崔白蘋，高璀鄉(xiāng)，熊存全，孫安陽(yáng)

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院神經(jīng)退行性疾病與修復(fù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鹽城 224005)

◇實(shí)驗(yàn)方法學(xué)◇

一種簡(jiǎn)便、可靠的免疫組化雙重標(biāo)記新方法

崔白蘋，高璀鄉(xiāng)，熊存全，孫安陽(yáng)*

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院神經(jīng)退行性疾病與修復(fù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 鹽城 224005)

目的 探索一種簡(jiǎn)便可靠、清晰的免疫組化雙重標(biāo)記方法，可用普通光學(xué)顯微鏡觀察，并能長(zhǎng)期保存染色結(jié)果。方法 免疫組化雙標(biāo)中，均使用辣根過氧化物酶(HRP)連接的二抗，底物分別選用二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)和鎳增強(qiáng)DAB。第一標(biāo)DAB染色完成后切片煮沸4～5 min以滅活HRP，完全阻斷交叉反應(yīng)，然后進(jìn)行第二標(biāo)鎳增強(qiáng)DAB染色。結(jié)果 ① 切片煮沸5 min，可完全滅活殘余的HRP酶活性，防止染色反應(yīng)交叉；5%的H2O2滅活HRP酶不完全，易產(chǎn)生交叉反應(yīng)；短暫高溫滅活HRP不損壞之前的特異性DAB染色或造成組織損傷。② 第一標(biāo)DAB的棕黃色與第二標(biāo)鎳增強(qiáng)DAB的紫藍(lán)色反差大、背景低；顛倒底物使用次序?qū)p害雙標(biāo)質(zhì)量。此外，雙標(biāo)切片可采用傳統(tǒng)的中性樹膠封片，染色結(jié)果能恒久保存。結(jié)論 采用同一種酶標(biāo)記系統(tǒng)建立了簡(jiǎn)便、可靠的免疫組化雙標(biāo)新方法。該方法標(biāo)記結(jié)果清晰、操作簡(jiǎn)便、試劑易得，有較大應(yīng)用價(jià)值。

免疫組化；辣根過氧化物酶；二氨基聯(lián)苯胺；鎳；方法；雙重標(biāo)記；交叉反應(yīng)

在基礎(chǔ)和臨床病理形態(tài)學(xué)研究中，免疫組織化學(xué)染色是一種很常用的技術(shù)。在同一張組織切片上免疫組織化學(xué)雙重標(biāo)記(免疫組化雙標(biāo))可以了解兩種抗原分子之間不同的組織細(xì)胞分布，以分析兩者相互關(guān)系[1]； 其結(jié)果對(duì)比直觀，信息量遠(yuǎn)比傳統(tǒng)單染高，并可克服由于切片間各種差異而引起的時(shí)間或空間的樣本誤差，對(duì)標(biāo)本量少的病理組織更具有顯著優(yōu)勢(shì)，給科研人員和病理科醫(yī)師帶來極大便利。免疫組化雙標(biāo)有熒光雙標(biāo)和白光(明場(chǎng))雙標(biāo)。目前常用的熒光雙標(biāo)[2]雖然操作較簡(jiǎn)便，但也有染色原始結(jié)果難以長(zhǎng)期保存、拍攝過程中熒光容易淬滅等局限。明場(chǎng)雙標(biāo)的染色結(jié)果如果能采用樹脂封片，便能長(zhǎng)期保存，對(duì)臨床病理科，特別是腫瘤診斷[3]以及研究原始結(jié)果的保存非常有價(jià)值。

文獻(xiàn)報(bào)道的明場(chǎng)雙標(biāo)許多采用堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)雙酶顯色系統(tǒng)[4-7]，堿性磷酸酶的底物多選用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽/硝基四唑氮藍(lán)(BCIP/NBT)，HRP的底物多選用3-氨基-9-乙基咔唑 (3-amino-9-ethylcarbazole, AEC)或二氨基聯(lián)苯胺(3,3′-diaminobenzidine, DAB)。上述雙標(biāo)方法中，底物BCIP/NBT與AEC的呈色反應(yīng)存在一定程度的相互干擾[6]，使染色結(jié)果反差變?。挥捎贏EC等底物的反應(yīng)產(chǎn)物[8]在二甲苯中可溶，故只能采用水性封片，加之BCIP/NBT和AEC的反應(yīng)產(chǎn)物容易擴(kuò)散，使染色結(jié)果也不能長(zhǎng)期保存。另一方面，早期文獻(xiàn)中有將金屬離子增強(qiáng)DAB與DAB試用于免疫組化雙標(biāo)的報(bào)道[9]，而后又有研究者將DAB和鎳增強(qiáng)DAB方法加以改變或發(fā)展，用于特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模缑庖呓M化與原位雜交雜合雙標(biāo)[10]、免疫電鏡雙標(biāo)[11]。然而，已報(bào)道的DAB與金屬離子增強(qiáng)DAB明場(chǎng)雙標(biāo)方法存在一個(gè)共同的缺點(diǎn)，即未設(shè)計(jì)有效的處理以阻斷雙標(biāo)之間潛在的交叉反應(yīng)，進(jìn)而使雙標(biāo)信號(hào)的顏色反差有所下降。另外，已有的明場(chǎng)雙標(biāo)方法所用的試劑和操作步驟常較復(fù)雜。實(shí)際上，由于方法學(xué)的限制，發(fā)表文獻(xiàn)中很難見到清晰、高反差的明場(chǎng)雙標(biāo)結(jié)果。因此，建立一種簡(jiǎn)單可靠的明場(chǎng)免疫組化雙標(biāo)記方法，并產(chǎn)生高質(zhì)量的雙標(biāo)染色結(jié)果，將有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

本文將介紹一種簡(jiǎn)便的免疫組化雙重標(biāo)記方法，其特點(diǎn)是：(1)采用單一的HRP酶系統(tǒng)；(2)第一次免疫組化標(biāo)記后，通過短暫煮沸完全滅活第一標(biāo)殘余的HRP酶活性，阻斷其與第二次免疫組化染色產(chǎn)生交叉反應(yīng)；(3)底物依次使用DAB和鎳增強(qiáng)DAB，次序不宜顛倒；(4)雙標(biāo)信號(hào)棕黃色與紫藍(lán)色對(duì)比鮮明，背景清晰。此外，可采用常規(guī)的二甲苯和中性樹膠封片，染色結(jié)果可以長(zhǎng)期保存；染色時(shí)間較同類方法短，連接HRP的二抗可以與免疫印跡實(shí)驗(yàn)通用，經(jīng)濟(jì)實(shí)用。

1 材料與方法

1.1 試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗體：見Tab 1。

Tab 1 Antibodies used in this study

試劑：DAB、Trizma和Imidazole購(gòu)自Sigma。其他化學(xué)試劑除特別說明外，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。牛血清白蛋白和山羊血清購(gòu)自Life Technologies(Gibco)。

動(dòng)物：阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)三轉(zhuǎn)基因小鼠的建立與基因鑒定參見本研究組之前發(fā)表的文獻(xiàn)[12-14]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵守美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生機(jī)構(gòu)發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用指南》(NIH，Publication No.85-23，1996修訂版)相關(guān)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)小鼠在溫度22 ℃、濕度30%～40%的環(huán)境中飼養(yǎng)，12 h明暗周期，自由飲水和攝食。體質(zhì)量20～30 g。

1.2 免疫雙標(biāo)染色

1.2.1 組織切片 AD三轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照小鼠以8%的水合氯醛(380 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，常規(guī)的磷酸鹽緩沖液(PBS：NaCl 137 mmol·L-1, Na2HPO44.3 mmol·L-1, KH2PO41.4 mmol·L-1, KCl 2.7 mmol·L-1, pH 7.4)和4%～8%福爾馬林緩沖液自心臟灌流固定，小鼠腦經(jīng)Mouse Brain Matrix輔助切塊，再后固定12～24 h。冰凍切片(漂片法或貼片法)和石蠟切片(貼片法)均可以采用此雙標(biāo)方法。冰凍切片的組織塊分別經(jīng)20%～30%的蔗糖梯度處理。以小鼠腦組織為例，連續(xù)冰凍切片厚度可以選擇14 μm。小鼠腦組織石蠟切片，厚度通常為5～8 μm。經(jīng)過二甲苯脫蠟和酒精梯度浸水后PBS漂洗。

1.2.2 非特異性阻斷 組織切片在阻斷緩沖液中孵育1～3 h。阻斷緩沖液的基礎(chǔ)成分為磷酸鹽緩沖液，其中含 0.4% Triton-X 100、1%牛血清白蛋白、5%山羊血清。

1.2.3 第一標(biāo)抗體孵育 抗體孵育可采用漂片試管法(切片置于加抗體液的eppendorf管中)或貼片滴片法(抗體液滴于切片上)。一抗在4℃環(huán)境中孵育過夜或6 h，PBS漂洗3×10 min或更長(zhǎng)時(shí)間，再與一抗種屬相匹配的二抗孵育約2 h，然后用PBS漂洗3×10 min。如果第一標(biāo)的信號(hào)很弱，選項(xiàng)之一是改用親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法(ABC法)以放大第一標(biāo)的抗原信號(hào)。第一標(biāo)改用ABC法與之后的第二標(biāo)方法無沖突，但同一實(shí)驗(yàn)不可將第二標(biāo)也改為ABC方法，否則會(huì)發(fā)生新的交叉反應(yīng)。貼片法通常需要適當(dāng)提高抗體濃度。

1.2.4 第一標(biāo)呈色反應(yīng) 完成抗體孵育的切片依次用PBS和含0.8% NaCl的Trizma-Imidazole (TI) 緩沖液(50 mM Trizma, 10 mM Imidazole)漂洗，再進(jìn)行DAB呈色反應(yīng)，然后轉(zhuǎn)移至TI 緩沖液中止呈色反應(yīng)。DAB反應(yīng)液的基礎(chǔ)成分為TI 緩沖液，含0.05% DAB、0.01% H2O2。DAB呈色反應(yīng)通常需30 s至3 min，冰凍切片所需反應(yīng)時(shí)間一般較石蠟切片短。不同的實(shí)驗(yàn)尚可根據(jù)一抗與二抗的具體情況適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)液的DAB濃度，以達(dá)到理想的呈色效果。另外，由于本方法在一抗與二抗充分漂洗以及HRP活性好的情況下背景很低，如果遇到第一標(biāo)的抗原較弱時(shí)也可將呈色反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至5～10 min，以提高檢測(cè)靈敏度。

1.2.5 殘余過氧化物酶滅活 完成第一標(biāo)染色的切片轉(zhuǎn)移至加PBS緩沖液的eppendorf管中，在沸水浴上熱處理4～5 min以滅活殘余的過氧化物酶活性。水浴僅維持輕度沸騰，煮沸時(shí)間通常不超過6 min。漂片法加熱滅活過程中如果組織切片逐漸上浮至PBS液面，要及時(shí)將eppendorf管取離，冷卻數(shù)秒后輕搖試管便可使切片沉降，而后重新置于沸水浴上。加熱處理結(jié)束后立即插于冰上冷卻。貼片法選用可插玻片或可放小玻片架的組織缸進(jìn)行酶滅活處理。盛適量PBS液的組織缸在輕沸水浴上預(yù)熱至近100 ℃；完成第一標(biāo)的玻片(或連帶小玻片架)快速插入預(yù)熱的PBS液中，維持熱處理4～5 min；操作過程中注意避免切片干燥。為選擇合適的滅活過氧化物酶方法，我們還進(jìn)行了多種嘗試，包括不同濃度的H2O2處理、不同滅活溫度或不同滅活時(shí)間以及兩者組合。其他滅活方法與煮沸滅活的效果進(jìn)行了比較，煮沸滅活的方法由于操作簡(jiǎn)便、效果可靠而被選用。

1.2.6 第二標(biāo)抗體孵育 第一標(biāo)滅活完成后的組織切片僅需短時(shí)阻斷10 min(可省)，第二標(biāo)一抗在4 ℃孵育過夜或縮短至6 h，再與第二標(biāo)一抗相匹配的二抗孵育1～2 h，漂洗方法與第一標(biāo)相似。

1.2.7 第二標(biāo)呈色反應(yīng) 第二標(biāo)的一抗和二抗孵育完成后呈色反應(yīng)同前，不同之處在于采用鎳增強(qiáng)型DAB反應(yīng)液。鎳增強(qiáng)型DAB反應(yīng)液是在之前的DAB反應(yīng)液中加入0.02% 硫酸鎳(無水或六水物)。鎳增強(qiáng)DAB呈色反應(yīng)通常需20 s至2 min。

1.2.8 封片 漂片法的組織切片進(jìn)PBS漂洗干凈后貼片。室溫干燥后二甲苯透明、中性樹膠封片。染色后切片用連接數(shù)碼相機(jī)的顯微鏡(Olympus, BX51 或BX63)成像。

1.2.9 對(duì)照試驗(yàn) (1)不同方法滅活HRP酶的效果比較：平行處理的相鄰切片在第一標(biāo)(如Aβ)結(jié)束后，分別用以下方法滅活殘余的過氧化物酶活性：① 切片加入含PBS試管，沸水浴上煮沸5 min；② 5% H2O2處理組織切片5 min；③ 金屬恒溫浴不同溫度60℃、75℃、90℃，10～15 min；④ 1 mol·L-1HCl 處理 10 min。滅活處理結(jié)束后，上述切片平行標(biāo)記第二標(biāo)。(2)DAB和鎳增強(qiáng)DAB使用次序?qū)﹄p標(biāo)結(jié)果的影響：在平行操作的雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中，一部分切片用之前的常規(guī)次序，另一部分切片顛倒底物使用次序，即第一標(biāo)用鎳增強(qiáng)DAB，第二標(biāo)用DAB。比較底物使用次序不同對(duì)雙標(biāo)結(jié)果的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 本免疫雙標(biāo)方法能產(chǎn)生清晰、高反差的雙標(biāo)結(jié)果本工作起始于已發(fā)表文獻(xiàn)中尚缺乏理想的明場(chǎng)雙標(biāo)方法，不能產(chǎn)生高質(zhì)量的雙標(biāo)結(jié)果。我們經(jīng)過探索，建立一種清晰、高反差的明場(chǎng)雙標(biāo)方法，以滿足基礎(chǔ)研究和臨床病理診斷的需求。按照上述方法部分的步驟正確操作，本方法通?？梢援a(chǎn)生清晰、高反差的雙標(biāo)結(jié)果。以檢測(cè)AD三轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)病理為例，DAB標(biāo)記的Aβ斑塊與鎳增強(qiáng)DAB標(biāo)記的磷酸化Tau病理色彩對(duì)比鮮明，兩信號(hào)之間無交叉染色(Fig 1 A～C)。另外，染色背景較淺，如無彌散的特異性信號(hào)，背景呈灰白色。

2.2 底物使用次序明顯影響雙標(biāo)結(jié)果通常情況下，該免疫雙標(biāo)方法第一標(biāo)使用DAB，第二標(biāo)使用鎳增強(qiáng)DAB, 雙標(biāo)結(jié)果清晰(Fig 2A)。若在平行情況下僅僅將底物的使用次序顛倒，如第一標(biāo)使用鎳增強(qiáng)DAB標(biāo)記Aβ，第二標(biāo)使用DAB標(biāo)記pTau，即會(huì)出現(xiàn)第二標(biāo)背景較深，而且標(biāo)記信號(hào)變淺，使第二標(biāo)信號(hào)與背景對(duì)比度顯著下降(Fig 2B)。

Fig 1 A novel method produces high-quality immunohistochemical double labeling

A:A double labeling of amyloid plaques (brown) and hyperphosphorated tau pathology (purple) in an Alzheimer’s disease transgenic mouse model by using DAB firstly and Nickel enhanced DAB (Ni) secondly； B and C: The images in high magnification from the frames in panel A. Scale bar=500 μm in A, 100 μm in B, C.

為檢驗(yàn)改變底物使用次序?qū)⒂绊戨p標(biāo)結(jié)果這一現(xiàn)象是否具有普適性，我們?cè)囼?yàn)了不同類型的抗原或不同豐度的抗原加以驗(yàn)證。如雙標(biāo)的第一標(biāo)使用DAB標(biāo)記Tau病理構(gòu)象(MC1)，第二標(biāo)使用鎳增強(qiáng)DAB標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞(Iba-1)，仍然能獲得背景較淺的正常染色結(jié)果(Fig 2C)。在病理抗原豐度很低的情況下，如果改變底物使用次序(先使用鎳增強(qiáng)DAB，再用DAB)，仍然產(chǎn)生較深的染色背景(Fig 2D)。因而，在本方法中顛倒底物使用次序?qū)⒂绊戨p標(biāo)結(jié)果對(duì)于不同情況具有一定普適性。

2.3 煮沸法滅活HRP較傳統(tǒng)H2O2方法可靠在實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)囼?yàn)了多種不同方法滅活HRP酶的效果。以煮沸法與傳統(tǒng)H2O2方法進(jìn)行比較為例：第一標(biāo)Aβ(內(nèi)嗅皮層和杏仁核)結(jié)束后用5% H2O2處理組織切片，第一標(biāo)殘余的HRP酶活性未被完全滅活，在第二標(biāo)pTau時(shí)出現(xiàn)與第一標(biāo)染色反應(yīng)交叉，第一標(biāo)Aβ信號(hào)顏色變深，與第二標(biāo)pTau反差下降，背景染色疊加(Fig 3A, C)。如果第一次染色后，用煮沸法滅活HRP酶活性(Fig 3B,D)，則不出現(xiàn)染色反應(yīng)交叉，背景較淺。煮沸滅活時(shí)間以4～5 min較適宜，通常不超過6 min；煮沸時(shí)間過長(zhǎng)(如>10 min)將逐步減弱一標(biāo)DAB信號(hào)強(qiáng)度。其他滅活HRP酶的試驗(yàn)方法(如60℃或75℃)因?yàn)樵跇?biāo)記抗原不同的實(shí)驗(yàn)中效果不恒定而被棄用。

Fig 2 Effects of substrate application orders on the quality of immunohistochemical double labeling in different conditions

A and B: In Alzheimer’s disease transgenic mice with abundant pathology, a double labeling of amyloid plaques and hyperphosphorated tau pathology by using DAB firstly and Nickel enhanced DAB (Ni) secondly (DAB/Ni), or reversely using Nickel enhanced DAB firstly and DAB secondly (Ni/DAB). The labeling quality was ruined with reversely applying substrates of DAB and Nickel enhanced DAB; C: A double labeling using different antibodies for tau pathology (MC1) with DAB (brown) firstly, followed by microglial cells (Iba1) with Nickel enhanced DAB (purple); D: In low density of Alzheimer's pathology, labeling amyloid pathology (Aβ) with Nickel enhanced DAB (purple) firstly, followed by tau pathology (pTau) with DAB (brown). In the conditions of either different antibodies or low antigen levels, applying Nickel enhanced DAB firstly still generated higher background staining. Scale bar=100 μm.

2.4 免疫組化雙標(biāo)染色的常見失誤分析按照上述方法部分正確操作，通常情況下可獲得高質(zhì)量雙標(biāo)結(jié)果。但是，任何一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵錯(cuò)誤都可能使結(jié)果質(zhì)量下降甚至雙標(biāo)染色失敗。常見的失誤包括：第一標(biāo)殘余HRP酶活性滅活不完全導(dǎo)致交叉反應(yīng)(Fig 4A)；高豐度抗原使用過高濃度抗體、過長(zhǎng)的孵育時(shí)間或反應(yīng)時(shí)間，原始或交叉反應(yīng)均可導(dǎo)致抗原集中部位出現(xiàn)組織損傷(Fig 4B)；兩次標(biāo)記強(qiáng)度未大致平衡，高豐度第一標(biāo)反應(yīng)過度，導(dǎo)致較低豐度的第二次標(biāo)記失敗(Fig 4C)。免疫組化雙標(biāo)常見問題及處理辦法見Tab 2。

3 討論

本文采用同一種酶標(biāo)記系統(tǒng)建立了簡(jiǎn)便、可靠、清晰的免疫組化雙標(biāo)方法。該方法試劑易得、操作簡(jiǎn)便、如正確操作染色結(jié)果質(zhì)量高、穩(wěn)定可靠。由于本方法不需要特殊的試劑與設(shè)備，將可廣泛地應(yīng)用于臨床和實(shí)驗(yàn)室研究。

早期文獻(xiàn)中已有將金屬離子增強(qiáng)DAB和DAB試用于免疫組化雙標(biāo)的報(bào)道，但該文介紹的雙標(biāo)方法[9]存在若干缺陷：(1)未做阻斷交叉反應(yīng)的處理，僅通過呈色反應(yīng)先深色，后淺色，以忽略交叉反應(yīng)。(2)底物使用次序是先采用金屬鈷(Co)加強(qiáng)DAB，而后使用DAB，可能導(dǎo)致第二標(biāo)抗原性明顯下降，同時(shí)產(chǎn)生較深的染色背景。(3)采用兩種較為復(fù)雜的酶顯色系統(tǒng)(ABC與PAP法)。近期報(bào)道的硫化物-銀-金加強(qiáng)法[11]用于免疫電鏡雙標(biāo)具有明顯優(yōu)點(diǎn)，但用于光鏡水平的免疫組化雙標(biāo)并無優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樵摲椒ú粌H步驟繁瑣、需要使用貴金屬試劑，而且一標(biāo)顏色轉(zhuǎn)換后還遺留少量致密的雜色信號(hào)，易與二標(biāo)信號(hào)相混淆，使雙標(biāo)顏色反差變小。實(shí)際上，由于目前文獻(xiàn)中尚缺乏簡(jiǎn)便和反差大的明場(chǎng)雙標(biāo)方法，需要長(zhǎng)久保存結(jié)果的免疫組化染色還是大量采用單標(biāo)記方法，需要標(biāo)記不同抗原時(shí)通常標(biāo)記在不同的或者相鄰的組織切片上。因而迫切需要建立一種簡(jiǎn)便、清晰的明場(chǎng)免疫組化雙標(biāo)方法。

Fig 3 Comparison between H2O2 treatment and boiling in deactivating residual HRP activity

Double labeling of amyloid pathology (Aβ, brown) and tau pathology (pTau, purple) in triple transgenic mice model of Alzheimer’s disease. A and C: Sections were treated with 5% H2O2for 5 min when the first labeling of Aβ is done. B and D: Sections were boiled for 5 min after the first labeling. ERC: Entorhinal cortex; Amyg: Amygdala. Scale bar =100 μm.

Fig 4 Various mistakes produce a failure in the immunohistochemical double labeling

A: An incomplete deactivation of residual HRP decreased the labeling contrast between tau pathology (dark brown) and GFAP (purple). B: Over staining of tau pathology in the same double labeling damaged tissue integrity in hippocampus; C: An excessive DAB reaction for tau pathology in the first labeling prevented the second labeling for amyloid pathology. Scale bar =100 μm.

Tab 2 Troubleshooting guide for the immunohistochemical double labeling method

本免疫組化雙標(biāo)記方法采用同一種酶標(biāo)記系統(tǒng)，其關(guān)鍵之一是有效滅活第1次標(biāo)記后殘余的過氧化物酶活性。我們最終采用含組織切片的PBS在沸水浴上平緩煮沸4～5 min以滅活殘余過氧化物酶活性的方法。與傳統(tǒng)的H2O2滅活法相比，其操作簡(jiǎn)單、滅活效果可靠，同時(shí)短暫熱滅活不損傷組織切片，也不影響第二標(biāo)的抗原活性。實(shí)驗(yàn)探索中，我們也嘗試用水浴或金屬恒溫浴試驗(yàn)不同溫度(如60℃、75℃、90℃)的酶滅活效果，雖然在一部分實(shí)驗(yàn)中也觀察一定的滅活效果，但在不同實(shí)驗(yàn)中重現(xiàn)性差，還需要特別儀器控制溫度，故被棄用。

堿性磷酸酶/HRP雙酶系統(tǒng)的常用底物為BCIP/NBT與AEC，其呈色反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定性欠佳，可溶于組織病理學(xué)常用的有機(jī)溶劑。本免疫組化雙標(biāo)方法選用DAB和鎳增強(qiáng)DAB染色，顏色對(duì)比鮮明，背景清晰，尤其是雙標(biāo)的反應(yīng)產(chǎn)物均穩(wěn)定，可以恒久保存原始染色結(jié)果。采用DAB和鎳增強(qiáng)DAB染色，底物使用次序需要合理考慮。一般先用DAB底物對(duì)豐度相對(duì)較低或者分布較為局限的抗原進(jìn)行染色。若先用鎳增強(qiáng)DAB后再用DAB標(biāo)記，可能會(huì)導(dǎo)致第二標(biāo)信號(hào)降弱、背景加深，從而使雙標(biāo)信號(hào)對(duì)比不明顯。一種例外的情況是：其中一標(biāo)的信號(hào)相當(dāng)微弱和彌散，另一標(biāo)的信號(hào)則很強(qiáng)，兩者強(qiáng)度差別巨大；此時(shí)可以考慮先用鎳增強(qiáng)DAB標(biāo)記彌散弱信號(hào)，再注意調(diào)節(jié)DAB反應(yīng)時(shí)間等因素恰當(dāng)標(biāo)記強(qiáng)信號(hào)。

采用本免疫組化雙標(biāo)獲得高質(zhì)量的染色結(jié)果，還需要注意以下要點(diǎn)：(1)組織切片制備質(zhì)量良好。(2)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，獲得特定抗體濃度和抗原豐度的經(jīng)驗(yàn)。高豐度抗原如使用過高濃度抗體且呈色反應(yīng)時(shí)間偏長(zhǎng)，可導(dǎo)致組織切片局部損傷。(3)選擇購(gòu)買活性高的HRP產(chǎn)品，是縮短反應(yīng)時(shí)間、獲得清晰的染色結(jié)果和保持較好檢測(cè)靈敏度的關(guān)鍵之一。(4)平衡第一標(biāo)與第二標(biāo)的染色強(qiáng)度。尤其是第一標(biāo)染色強(qiáng)度盡可能適中，過強(qiáng)的第一標(biāo)在某些情況下可以導(dǎo)致第二標(biāo)抗原性下降。(5)在組織切片加熱滅活HRP酶等操作中要防止組織切片快速干燥而損失抗原性。

本文介紹的免疫組化雙標(biāo)方法適用面廣，冰凍和石蠟切片均可采用。適當(dāng)加以改變還可以進(jìn)一步提高靈敏度或發(fā)展成三標(biāo)甚至多標(biāo)方法。例如，與我們之前報(bào)道的序貫染色法[15]相結(jié)合，加入熒光方法與抗體洗脫、原位雜交或者化學(xué)染色方法，可以同一標(biāo)本上標(biāo)記出更多的組織信號(hào)。

(致謝：本項(xiàng)工作是在“鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院神經(jīng)退行性疾病與修復(fù)實(shí)驗(yàn)室”完成。)

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A novel,convenient and reliable method for immunohistochemical double labeling

CUI Bai-ping, GAO Cui-xiang, XIONG Cun-quan, SUN An-yang

(LaboratoryofNeurodegenerativeDiseasesandRepair,YanchengInstituteofHealthSciences,Yancheng,Jiangsu224005,China)

Aim To establish a convenient，reliable and high-contrast method of immunohistochemical double labeling,which can be observed with ordinary optical microscopy, and the staining results can be preserved permanently. Method This double labeling method employed the single detection system, HRP conjugated second antibodies, and used the substrates of 3,3′-diaminobenzidine (DAB) and Nickel-enhanced DAB respectively. When the first labeling was completed, HRP was totally inactivated by boiling for 4～5 min to prevent the cross-reaction in the second labeling. Results (1) Boiling for 5 min could completely inactivate HRP activity, whereas 5% H2O2treatment only reduced HRP activity, and residual enzyme activity generated the cross-reaction between two labeling. Boiling for a few minutes did not damage positive DAB staining in the first labeling or tissue integrity. (2) There was a sharp contrast between DAB in brown and Nickel enhanced DAB in purple-blue, which also gives clean backgrounds; reversely applying the substrates will ruin the quality of double labeling. In addition, the above method allowed conventional mounting protocol using xylene and Permount, instead of a water-based mounting medium, thus the staining results could be permanently preserved. Conclusion As the same HRP detection system is employed, this novel double labeling method is simple, convenient and reliable. The method would bear broad applications in basic and clinical research.

immunohistochemistry; horseradish peroxidase; 3,3′-diaminobenzidine; Nickel; method; double labeling; cross-reaction

時(shí)間：2015-3-3 11:08 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.028.html

2014-12-02，

2015-01-14

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30470594, 30772282)

崔白蘋(1987-)女， 碩士 ，講師， 研究方向：神經(jīng)退行性疾病研究，E-mail: cuibaiping@126.com； 孫安陽(yáng)(1966-)男， 博士，教授， 研究方向：神經(jīng)退行性疾病研究， 通訊作者，E-mail: asun08@fudan.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.028

A

1001-1978(2015)03-0436-06

R392-33;R392.11;R977.3