皮建輝， 譚 娟， 胡朝暾， 向德標

(懷化學院生命科學系， 民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室， 湖南 懷化 418008)

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金銀花黃酮對小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的研究*

皮建輝△， 譚 娟， 胡朝暾， 向德標

(懷化學院生命科學系， 民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湘西藥用植物與民族植物學湖南省高校重點實驗室， 湖南 懷化 418008)

目的：探討金銀花黃酮對小鼠血清免疫酶活性與淋巴器官的抗氧化作用。方法：將50只昆明小鼠隨機分為5組(n=10)：正常組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組。模型組和正常組小鼠生理鹽水灌胃，低、中、高劑量組分別給予金銀花黃酮100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg體重灌胃。連續(xù)灌胃7周后，除正常組注射生理鹽水，其他各組小鼠均采用25 mg/kg體重的地塞米松連續(xù)3 d皮下注射，造成免疫抑制后繼續(xù)灌胃1周，處死全部小鼠，取血和胸腺、脾臟，稱重胸腺和脾臟，計算小鼠臟器指數(shù)，測定血漿中酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LSZ)活力，以及胸腺和脾臟勻漿中單胺氧化酶(MAO)、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。結(jié)果：金銀花黃酮能顯著提高免疫抑制小鼠的臟器指數(shù)，增加免疫抑制小鼠血清ACP、AKP和LSZ活力，提高免疫抑制小鼠的脾臟、胸腺組織T-AOC和SOD活性，而明顯降低MAO和MDA含量。結(jié)論：金銀花黃酮能顯著調(diào)節(jié)小鼠血清免疫酶活性，提高淋巴器官的抗氧化功能，表明具其有良好的免疫調(diào)節(jié)功能。

金銀花黃酮；臟器指數(shù)；免疫酶活性；抗氧化作用

植物黃酮類化合物因其獨特的化學結(jié)構(gòu)而對哺乳動物和其它類型的細胞具有許多重要的生理、生化作用，是許多中草藥的重要有效成分。金銀花(LoniceraJapanicaThunb)為忍冬科多年生半常綠纏繞植物忍冬的花蕾，含有木犀草素、異綠原酸、綠原酸和黃酮等多種化合物?，F(xiàn)代藥理學研究表明，金銀花黃酮類化合物具有明顯的抗氧化作用[1]，但其他相關(guān)的生物學活性研究甚少。本實驗通過探討金銀花黃酮對小鼠血清免疫酶活性與淋巴器官的抗氧化損傷作用，揭示其免疫調(diào)節(jié)功能，為金銀花的進一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與主要儀器

金銀花采自懷化中坡山，經(jīng)鑒定為忍冬科忍冬屬植物忍冬的花蕾。試驗動物采用體重22～25 g的清潔級KM小鼠，購自中南大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(湘)2009-0004。試劑：地塞米松(Dexamethasone，Dex，購自鄭州卓峰有限公司，批號：1010721)；肝素鈉(購于懷化解放軍五三五醫(yī)院)；酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、溶菌酶(lysozyme，LSZ)、單胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；其他藥品均為國產(chǎn)分析純。主要使用儀器：EU800紫外/可見光分光光度計(美國貝克曼)、WFH-203紫外分析儀(上海精科實業(yè)有限公司)。

1.2 金銀花總黃酮的提取及其純度測定

金銀花黃酮(LoniceraJaponicaflavone)的提取參照文獻[2]進行。用蘆丁做黃酮的標準品，經(jīng)光譜分析測定其最大吸收波長為510 nm。用最小二乘法作線性回歸，得吸光值(A510 nm)與蘆丁濃度(mg/ml)的線性回歸方程為：y=2.1387x-0.0009，R2=0.9999，線性范圍為：0.1096～1.0965(mg/ml)。配制2 mg/ml的金銀花黃酮粉溶液，測得A510 nm平均值為x=0.5766，代入標準方程y=2.1387x-0.0009，得y=1.2323 mg/ml，故金銀花黃酮粉中總黃酮含量(純度)為61.61%。

1.3 動物實驗

選取體重22～25 g的清潔級KM小鼠50只，隨機分為5組，每組雌雄各半(n=10)：模型組、正常組、高劑量組、中劑量組、低劑量組。模型組和正常組小鼠生理鹽水灌胃，高、中、低劑量組分別給予金銀花黃酮按照100 mg/kg、200 mg/kg、400 mg/kg體重灌胃。連續(xù)灌胃7周后，除正常組注射生理鹽水，其他各組小鼠均采用Dex(25 mg/kg體重)連續(xù)3 d皮下注射，造成免疫抑制后繼續(xù)灌胃1周。

1.4 生理生化指標測定

1.4.1 臟器指數(shù)計算 Dex致敏(同時灌胃)一周后禁食不禁水12 h，稱量體重，摘眼球采血后引頸處死小鼠，迅速解剖，分別將離體脾臟、胸腺用蒸餾水清洗表面，用濾紙吸干稱重，以小鼠臟器質(zhì)量(mg)/體重(g)計算各臟器指數(shù)。

1.4.2 小鼠血清免疫酶活性測定 小鼠活體摘眼球取血，將血滴入事先用肝素鈉處理過的無菌離心管中，輕輕搖勻后3 000 r/min、4℃離心10 min后取上清，嚴格按照試劑盒說明書分別測定ACP，AKP，MPO，LSZ。

1.4.3 小鼠淋巴器官抗氧化指標測定 分別將脾臟、胸腺剪碎，用冰生理鹽水制成10%的勻漿，3 000 r/min、4℃離心10 min后取上清，嚴格按照試劑盒說明書分別測定脾臟、胸腺的MAO、T-AOC、SOD、MDA。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 金銀花黃酮對小鼠臟器指數(shù)的影響

動物實驗后，各實驗組間的動物體重沒有明顯變化，說明動物體重不受Dex和金銀花黃酮影響。與正常組相比，模型組小鼠各臟器指數(shù)極顯著性降低(P<0.01)；低劑量組臟器指數(shù)極顯著低于正常組(P<0.01)，中、高劑量組的臟器指數(shù)與正常組均無顯著的統(tǒng)計學差異。與模型組相比，除低劑量組胸腺指數(shù)沒有明顯差異外，其他各劑量組臟器指數(shù)顯著性升高(P<0.01)；可見Dex會損傷小鼠脾臟、胸腺組織，降低小鼠脾臟、胸腺臟器指數(shù)，小鼠灌胃金銀花黃酮后能有效地提高各劑量組小鼠臟器指數(shù)，表明金銀花黃酮對各劑量組脾臟、胸腺具有明顯的保護作用。

GroupDose(mg/kg)Spleen ThymusControl—3.36±0.122.28±0.13Model—2.26±0.11**2.05±0.12**Lowdose1002.67±0.13**2.02±0.13**Middledose2003.28±0.15##2.22±0.12##Highdose4003.34±0.16##2.85±0.13##

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsmodel group

2.2 金銀花黃酮對小鼠血清免疫酶活性的影響

GroupDose(mg/kg)ACP(U/100ml)AKP(U/100ml)LSZ(u/mgprot)ControlModelLowdoseMiddledoseHighdose——10020040023.75±1.986.03±0.60**9.85±1.28##16.95±2.40##22.13±1.28##7.25±1.483.63±0.58**7.28±1.58##8.09±1.17##12.73±3.50##6.30±0.074.31±0.07**6.71±0.97##12.61±0.05##13.63±0.86##

ACP：Acid phosphatase；AKP：Alkaline phosphatase；LSZ：Lysozyme

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsmodel group

2.3 金銀花黃酮對小鼠淋巴器官抗氧化損傷的作用

與正常組相比，模型組小鼠脾臟、胸腺組織中MAO、MDA含量均極顯著性升高(P<0.01)，而T-AOC、SOD明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，金銀花黃酮各劑量組小鼠脾臟、胸腺組織中MAO、MDA含量均顯著性降低(P<0.05，P<0.01)，而T-AOC、SOD明顯升高(P<0.01，表3、表4)。可見，金銀花黃酮能抵抗Dex所造成的淋巴器官組織氧化損傷。然而，相對正常組來說，各劑量組整體來說還不能完全恢復(fù)Dex所致淋巴組織的氧化損傷。

Tab. 3 Effect of Lonicera Japonica flavone on MAO、T-AOC、SOD、MDA in spleen of mice(±s, n=10)

MAO： Monoamine oxidase； T-AOC： Total antioxidant capacity； SOD： Superoxide dismutase； MDA： Malondialdehyde

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group；#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

Tab. 4 Effect of Lonicera Japonica flavone on MAO、T-AOC、SOD、MDA in thymus of mice(±s, n=10)

MAO： Monoamine oxidase； T-AOC： Total antioxidant capacity； SOD： Superoxide dismutase； MDA： Malondialdehyde

**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsmodel group

3 討論

植物活性成分的免疫調(diào)節(jié)作用通?？疾炝馨图毎D(zhuǎn)化率、巨噬細胞吞噬力、溶血素抗體生成、NK細胞活性、血清IL-2與IFN-α水平等[3-5]。本研究通過考察免疫酶活性與淋巴器官的抗氧化來探討植物活性成分的免疫調(diào)節(jié)作用，為免疫調(diào)節(jié)分析提供了新的分析思路。

機體的免疫功能可比較客觀地反映機體內(nèi)臟器官，特別是免疫器官的發(fā)育狀況。當機體整體免疫功能增強時，內(nèi)臟器官重量有所增加，其臟器指數(shù)也隨之升高。Dex對小鼠所造成的免疫抑制明顯降低了脾臟與胸腺的臟器指數(shù)，但金銀花黃酮灌胃能提高各臟器指數(shù)，表明金銀花黃酮能抑制Dex對小鼠脾臟與胸腺細胞所造成的免疫損傷。

ACP、AKP和LSZ是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子，與生物的免疫水平密切相關(guān)。ACP具有清除、消化、水解異物的作用，在血液和血細胞中有重要的防御功能[6]；AKP是解毒系統(tǒng)的主要酶之一，可作為機體非特異性免疫指標來評判免疫刺激劑對機體非特異性免疫功能的影響[7]；血清LSZ是由單核細胞、中性粒細胞和巨噬細胞合成分泌的，在機體正常防御功能和非特異免疫中，具有增強機體的抵抗力的作用[8]。本研究中，金銀花黃酮能改善Dex所致免疫抑制小鼠血清中ACP、AKP、LSZ等免疫相關(guān)酶的活力，表明金銀花黃酮具有較明顯的免疫活性調(diào)節(jié)作用。

機體內(nèi)有一套完整的抗氧化防御體系，能防止自由基鏈式反應(yīng)的氧化損傷，這一體系有類似于免疫系統(tǒng)的作用。MAO是能夠選擇性代謝(氧脫氨基)單胺類物質(zhì)的一類酶，在人體內(nèi)分布極廣，它能夠分解5-羥色胺、腎上腺素、去甲腎上腺素、多巴胺等[9]。T-AOC 是機體清除自由基的重要指標，它的測定結(jié)果克服了單一的抗氧化指標難以全面反映組織抗氧化能力的不足[10]。MDA 是氧自由基攻擊生物膜不飽和脂肪酸的終產(chǎn)物，淋巴器官勻漿中MDA 含量的變化可反映淋巴器官中細胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS) 的情況[11]，當淋巴細胞中ROS含量增加時，細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂類、DNA等生物大分子將受到明顯損傷，導(dǎo)致淋巴細胞功能下降，甚至威脅細胞的生存[12]；SOD是細胞內(nèi)源性的抗氧化酶類，它可通過代謝轉(zhuǎn)化將細胞內(nèi)的ROS轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄬Φ投拘缘奈镔|(zhì)，保護細胞免受損傷，對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用[11,13]。本研究結(jié)果顯示，Dex所致免疫抑制小鼠脾臟、胸腺組織中MAO明顯升高、T-AOC明顯降低，表明此時脾臟、胸腺組織受到明顯的過氧化損傷，但金銀花黃酮灌胃后，脾臟、胸腺組織中的MAO與T-AOC明顯改善。同時，金銀花黃酮能顯著提高Dex所致免疫抑制小鼠脾臟、胸腺中SOD的活力，保護淋巴細胞免受過氧化損傷，明顯降低MDA含量，說明金銀花黃酮具有良好的抗氧化損傷作用，可以通過調(diào)節(jié)機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度而提高機體免疫能力。

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本刊的宗旨、欄目和要求

本刊宗旨系面向應(yīng)用基礎(chǔ)理論研究，以促進科研，加強我國的經(jīng)濟建設(shè)和國防建設(shè)。內(nèi)設(shè)三個欄目：研究論文，報道與應(yīng)用有關(guān)的生理學研究及對應(yīng)用生理學有指導(dǎo)意義的基礎(chǔ)理論研究的論文；技術(shù)方法，登載有關(guān)的新技術(shù)、新方法；研究簡報，以短篇的形式報道最新的研究成果。

文稿應(yīng)具有科學性、實用性、創(chuàng)新性，論點明確，數(shù)據(jù)可靠，簡明扼要。研究論文不超過6 000字(限3個印刷頁，含圖、表及參考文獻等)；技術(shù)方法不超過4 000字(限2個印刷頁)；研究簡報3 000字以內(nèi)(可省略英文摘要，但需附英文題目和關(guān)鍵詞，限1.5個印刷頁)。

來稿須附單位推薦信。信應(yīng)注明不涉及保密，無一稿兩投，署名無爭議。

本刊編輯部

Effects ofLoniceraJaponicaflavone on immunomodulation in mice

PI Jian-hui△， TAN Juan， HU Zhao-tun, XIANG De-biao

(Department of Life Science, Huaihua University, Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources；Laboratory of Hunan Higher Education for Hunan-Western Medicinal Plant and Ethnobotany， Huaihua 418008, China)

Objective: To study immunomodulating activity ofLoniceraJaponicaflavone by investigating immune enzymatic activity of serum and ant-ioxidized activity of lymphoid organs in mice. Methods: Fifty KM mice were randomly divided into control group, model group, low dose group, middle dose group and high dose group(n=10), respectively. And low dose group, middle dose group and high dose group were givenLoniceraJaponicaflavone with 100 mg/kg, 200 mg/kg and 400 mg/kg every day, respectively, while control group and model group were administered with NS. After continuously giving drug 7 weeks, other groups were injected with Dexamethasome (Dex: 25 mg /kg) for 3 days by subcutaneous injection, but the control group were treated with NS. And after givingLoniceraJaponicaflavone 1 week simultaneously, organ indexes , the activity of acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (AKP) and lysozyme (LSZ) in serum , and the content of monoamine oxidase (MAO), total antioxidant capacity (T-AOC), total superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) in lymphoid organs in mice were tested, respectively. Results:LoniceraJaponicaflavone could significantly improve the organ indexes, and significantly improve the activity of ACP、AKP and LSZ in serum, and significantly improve the contents of T-AOC and SOD, but reduce that of MAO and MDA in lymphoid organs in immunosuppressed mice. Conclusion:LoniceraJaponicaflavone can significantly improve the activity of immune enzyme in serum and the anti-oxidized activity of lymphoid organs in mice. It suggests thatLoniceraJaponicaflavone has a good immunomodulatory effects.

LoniceraJaponicaflavone； organ index; Immune enzymatic activity; anti-oxidized activity

湖南省重點學科建設(shè)項目(湘教發(fā)[2011]42號)；“民族藥用植物活性成分高效利用”湖南省高校創(chuàng)新團隊培育項目(2012A01)

2014-07-10 【修回日期】2014-10-24

R392.1，R967

A

1000-6834(2015)01-089-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.026

△【通訊作者】Tel: 13574578248; E-mail: pijh817@126. com