黃誠胤， 潘建華， 李 慧

(重慶大學體育學院， 重慶 400044)

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表沒食子兒茶素沒食子酸酯對小鼠運動疲勞的拮抗作用*

黃誠胤△， 潘建華， 李 慧

(重慶大學體育學院， 重慶 400044)

目的：探索腹腔注射表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對小鼠運動疲勞的拮抗作用。方法：將120只小鼠隨機分為生理鹽水對照(1 ml/kg·d)(A組)、EGCG低濃度組(10 mg/kg·d)(B組)、EGCG高濃度防護組(50 mg/kg·d)(C組)(n=40)。建立疲勞小鼠訓練模型，每天腹腔注射不同劑量的EGCG或生理鹽水，持續(xù)給藥28 d。檢測小鼠負重游泳、輪轉耐力、爬桿、動物耐缺氧時間及血乳酸水平(BLA)、血尿素氮(BUN)、血乳酸脫氫酶(LDH)及肝糖原(LG)、肌糖原(MG)等疲勞相關指標。結果：腹腔注射EGCG組(B組、C組)小鼠負重游泳、爬桿、輪轉耐力持續(xù)時間及耐缺氧存活時間顯著延長，且較對照組相比具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)；同時提高小鼠血清中LDH濃度，降低BLA、BUN濃度及升高MG和LG含量。高濃度EGCG的抗疲勞效果與低濃度組相比更為明顯(P<0.05)。結論：EGCG具有拮抗小鼠運動疲勞的作用。

兒茶素沒食子酸酯；運動疲勞；拮抗作用；小鼠

運動性疲勞是指在運動過程中，機體的機能或工作效率不能維持在特定的水平而出現運動能力和身體功能暫時下降的現象[1]。運動疲勞產生的原因包括能源物質的耗竭、代謝產物的堆積，機體內環(huán)境失衡等。茶葉中含有的茶多酚，具有很強的抗氧化和清除自由基的能力。茶多酚中的兒茶素類化合物約占茶多酚總量的70%～80%，其中，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)含量最高，占兒茶素總量的50%以上。以往研究表明EGCG具有抗癌、抗突變、預防和治療心腦血管系統疾病等生物活性[2，3]。

本實驗以昆明小鼠為研究對象，給予低、高兩種濃度EGCG溶液腹腔注射。測試小鼠進行負重游泳能力、爬桿及轉輪耐力；觀察動物在常壓下耐缺氧的時間；檢測了動物血乳酸水平(blood lactic acid, BLA)、血尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)、血乳酸脫氫酶(blood lactate dehydrogenase, LDH)及肝糖原(liver glycogen, LG)、肌糖原(muscle glycogen, MG)等疲勞相關指標的變化，探討EGCG對小鼠運動性疲勞過程中對能源物質的耗竭、代謝產物堆積的影響，以及對小鼠運動能力的影響，為日后研究EGCG對小鼠運動性疲勞具有拮抗作用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

本實驗采用120只4～6周齡SPF級健康昆明小鼠，雌雄各半，體重(20±2)g，動物由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供(許可證號：SCXK(渝)2007-0003)。實驗小鼠隨機分為3組(n=40)，10只/籠飼養(yǎng)。動物飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(23±2)℃，保持通風，自然晝夜節(jié)律變化，相對濕度40%～60%。由第三軍醫(yī)大學實驗動物飼養(yǎng)中心新鮮配制動物飼料。

實驗分為生理鹽水對照組(A組)腹腔注射等量生理鹽水(1 ml/kg·d)、低濃度EGCG組(B組：10 mg/kg·d)、高濃度EGCG組(C組：50 mg/kg·d)，各組持續(xù)給藥28 d，并且每組飼養(yǎng)條件相同。每組再隨機分4組為負重游泳、轉輪耐力、爬桿及常壓耐缺氧時間的測定。

1.2 試劑與器材

EGCG標準品(純度>95%)(美國Sigma公司)；戊巴比妥鈉(成都科龍化工試劑廠)；0.01 mol/L PBS、(北京中杉金橋生物技術有限公司)；乳酸(BLA)試劑盒(南京建成生物工程研究所生產，批號：110802)；LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所生產，批號：110610)；BUN測試盒(南京建成生物工程研究所生產，批號：110928)；LG試劑盒(南京建成生物工程研究所生產，批號：110404)；MG試劑盒(南京建成生物工程研究所生產，批號：110618)。

1.3 實驗方法

1.3.1 小鼠爬桿實驗 直徑1 cm，長100 cm的玻璃棒上端固定于爬桿架上，下端距地面約40 cm處懸空，底部放入一裝水容器，水溫20℃，水深20 cm。動物適應性喂養(yǎng)4 d后開始給予適應性訓練，每2天1次，每次4～5 min。每次訓練前30 min注射生理鹽水及不同濃度EGCG。28 d適應性訓練后，無運動功能異常的小鼠進行測試。末次腹腔注射30 min后，將小鼠置于設置好的爬桿下端，記錄從小鼠放置開始至因疲勞無力而從上端滑落的時間，重復3次，時間累加。

1.3.2 小鼠負重游泳 動物適應性喂養(yǎng)4 d后開始進行3 d適應性游泳訓練，每天1次，每次15 min。游泳訓練在直徑120 cm，寬50 cm，水深30 cm的容器中進行，水溫(25±2)℃。每天實驗開始前30 min A組動物腹腔注射生理鹽水、B組動物腹腔注射10 mg/kg EGCG、C組動物腹腔注射50 mg/kg EGCG。各組小鼠腹腔注射30 min后陸續(xù)放入游泳池內游泳，每次游泳30 min，每天逐漸遞增10 min游泳時間。游泳完成后，取出動物擦干，放入籠中休息。力竭小鼠提前取出，記錄每只小鼠的訓練時間及狀態(tài)，訓練持續(xù)28 d。游泳訓練完成后，在小鼠尾部負載其體重8%的負荷，將小鼠放入游泳池內進行游泳實驗，記錄小鼠從入水到力竭的時間。

1.3.3 小鼠轉輪耐力實驗 將轉輪底部置于水盆中，水沒過轉輪底部。動物適應性喂養(yǎng)4 d后開始給予適應性訓練，每天1次，每次1～2 min。每天實驗開始前30 min A組動物腹腔注射生理鹽水、B組動物腹腔注射10 mg/kg EGCG、C組動物腹腔注射50 mg/kg EGCG。28 d適應性訓練后，再次將小鼠放置于轉輪中，讓其自行轉動，觀察小鼠轉動疲勞狀況，記錄小鼠在轉輪中不再自主前行轉動的時間[4]。

1.3.4 小鼠在常壓下耐缺氧時間測定 爬桿實驗結束后，小鼠休息3 d，實驗各組分別每天腹腔注射生理鹽水及不同濃度的EGCG，連續(xù)注射28 d。末次腹腔注射30 min后，將其裝入250 ml 廣口瓶中，廣口瓶里放入紗布包裹15 g CaCl2，每瓶放置1只小鼠，塞緊瓶蓋，凡士林封口，檢查不漏氣后開始記錄小鼠全身出現痙攣需要的時間。然后開啟瓶蓋，記錄小鼠存活時間[5]。

1.3.5 標本采集 以上實驗數據收集完后，進行動物樣本的采集。動物處死前禁食12 h，采用腹腔內注射3%戊巴比妥鈉( 50 mg/kg 體重) 麻醉，眼眶及心臟采血。血樣于室溫靜置2 h 后，3 000 r/min 離心10 min，分離血清，1.5 ml EP 管分裝，標記，-70℃冰箱中保存。采血后，剝離出小鼠完整肝臟組織和雙下肢肌肉，用預冷生理鹽水沖洗血液，濾紙吸干組織表面水分，再用滅菌錫泊紙包裹后儲于液氮中保存。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 EGCG對小鼠爬桿能力的影響

B組與C組訓練小鼠爬桿能力顯著高于A組小鼠(P<0.01)，而B組小鼠爬桿持續(xù)能力明顯低于C組小鼠，B組與C組訓練小鼠的爬桿能力相比較也有顯著性差異(P<0.05，圖1)。

2.2 EGCG對小鼠負重游泳時間的影響

C組的訓練小鼠負重游泳時間與A組相比有顯著性差異，其負重力竭游泳時間較A組顯著性延長(P<0.05，圖2)。

2.3 EGCG對小鼠輪轉耐力時間的影響

B組與C組訓練小鼠輪轉耐力持續(xù)時間顯著長于A組小鼠(P<0.01)，而B組訓練小鼠的輪轉耐力時間低于C組，有顯著性差異(P<0.05，圖3)。

2.4 EGCG對小鼠耐缺氧時間的影響

C組的訓練小鼠缺氧存活時間與A組相比有顯著性差異，其耐缺氧時間較A組顯著性延長(P<0.01，圖4)。B組與C組小鼠的耐缺氧存活時間無顯著性差異。

2.5 EGCG對小鼠BLA、LDH和血清BUN含量的影響

BLA、LDH和BUN是評判疲勞的重要指標。與A組相比，B組、C組小鼠運動后BLA、BUN含量呈降低趨勢，LDH呈增高趨勢。表明EGCG能降低小鼠運動后BLA、BUN含量，并增加LDH活性。其中，B組BLA含量與A組相比有顯著性差異(P<0.05)，LDH和血清BUN含量與A組相比，差異不顯著；C組與A組相比，各項指標均有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。

GroupBLA(nmol/L)LDH(U/L)BUN(mmol/L)A11.01±1.984678.35±611.7810.06±0.19B8.91±1.83*5029.97±444.909.91±1.07C7.77±1.76*5987.19±675.24**8.99±1.21*

A: Control group; B: Low dose group; C: High does group;

BLA: Blood lactic acid； LDH： Lactic dehydrogenase； BUN： Blood urea nitrogen; EGCG: Epigallocate chin gallate

*P<0.05,**P<0.01vsA group

2.6 EGCG對小鼠MG和LG含量的影響

與A組相比，B組與C組小鼠運動后MG和LG含量均呈增高趨勢。其中C組小鼠MG、LG含量具有顯著性差異(P<0.05，P<0.01)。該結果提示高濃度EGCG可促進無氧酵解產生的乳酸盡快轉化為葡萄糖，幫助運動后的小鼠恢復體內能量供給(表2)。

GroupMG(mg/g)LG(mg/g)A0.78±0.194.97±0.33B0.75±0.074.86±0.51C0.91±0.09*5.55±0.40**

A: Control group; B: Low dose group; C: High does group;

MG： Muscle glycogen； LG： Liver glycogen; EGCG: Epigallocate chin gallate

*P<0.05，**P<0.01vsA group

3 討論

隨著競技體育水平日益提高，運動員在訓練過程中承受的心理壓力和運動負荷增強，出現運動性疲勞的幾率在逐漸增加。如果運動性疲勞不能及時得到恢復，將影響運動員的運動能力。本實驗采用負重游泳、爬桿、轉輪耐力及動物在常壓下耐缺氧時間四項指標較為全面地觀察了EGCG對運動疲勞的拮抗作用。實驗結果顯示B組、C組小鼠與A組相比負重游泳、爬桿和輪轉耐力及在常壓下耐缺氧的時間均呈增高趨勢，C組小鼠與A組相比各項指標均有顯著性的提高(P<0.05，P<0.01)。小鼠運動耐力提高、負重游泳和輪轉時間增加以及在常溫下耐缺氧時間的延長從多方面提示：EGCG能在一定程度上改善動物提高平衡能力、協調動物大小肌肉群的力量輸出、改善精細肌肉群的疲勞程度等多渠道對抗運動疲勞。目前已有多項研究指出，EGCG可顯著增加機體的抗氧化能力，降低體內過氧化物生成，對酶依賴性和非酶依賴性抗氧化功能均有顯著的作用[6，7]。本實驗結果驗證了EGCG可以拮抗運動疲勞的效應的假說，而這種效應是否通過EGCG拮抗組織過氧化與自由基的清除，而緩解運動引發(fā)的疲勞，從而促進運動能力的顯著提高？其具體的分子作用機制還需進一步研究。

運動性疲勞可消耗機體大量的能量和氧氣并產生大量乳酸。其最直接的表現即運動耐力下降[8，9]。劇烈運動會消耗機體的能量和氧氣并生成大量乳酸，乳酸的解離可改變肌肉中pH值，進而引起酸堿平衡的變化，也是引起疲勞的重要原因之一。除此之外，BUN和LDH水平同樣被視為反應機體有氧代謝能力和疲勞程度的重要指標。本研究結果顯示，運動后B組、C組小鼠BLA和BUN水平呈下降趨勢，C組與A組相比有顯著性差異，LDH呈升高趨勢，說明EGCG可能通過促進無氧酵解產生的乳酸向丙酮酸方向進行代謝轉變，促進肌肉中乳酸盡快轉化為葡萄糖。

糖是肌肉重要的能量供應源，長時間的運動可耗竭體內的糖原儲備，此時，個體的運動能力，特別是耐力的持久性將受到嚴重影響。A組的研究結果提示，運動導致體力的消耗與肌糖原的耗竭同時發(fā)生，伴隨肌糖原的逐漸消耗，機體需動員肝糖原來維持正常的血糖水平。因此MG和LG水平的變化也可以間接反應機體疲勞程度。分析表明：EGCG可提高小鼠血清中LDH濃度，降低BLA、BUN濃度，MG和LG含量升高，且高濃度EGCG的抗疲勞效果與低濃度組相比更為明顯。本實驗中，運動后C組小鼠的MG、LG水平與A組比較有顯著性差異，但EGCG拮抗運動疲勞的作用究竟是源于其通過增加MG、LG儲備還是降低MG、LG消耗，還有待進一步的科學論證。有研究表明，通過EGCG防護后能有效增強疲勞大鼠對新事物的探究及空間學習能力[10]。綜上，EGCG可顯著延長小鼠負重游泳、爬桿、輪轉耐力持續(xù)時間及耐缺氧存活時間，能有效拮抗小鼠運動疲勞過程中代謝產物的堆積及緩解機體內環(huán)境失衡的作用。

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Effect of epigallocatechin gallate against exercise-induced fatigue in mice

HUANG Cheng-yin△, PAN Jian-hua, LI Hui

(Physical Education College, Chongqing University, Chongqing 400044, China)

Objective: To investigate the effects of epigallocatechin gallate (EGCG)against exercise-induced fatigue in mice. Methods: Total 120 mice were randomly divided into three groups and tested separately. For each test, there were 30 mice subdivided into high dose (50 mg/kg·d EGCG) and low dose (10 mg/kg·d EGCG) groups as well as saline control group(1 ml/kg·d) with 10 in each. Burden swimming, running wheel endurance, stick climbing and hypoxia tolerance exercise were used to establish fatigue mice training model in three groups. And intraperitoneal injection with different doses of EGCG per day for consecutively 28 days and the mice in the control group were treated with normal saline. After the last each test, the blood lactic acid (BLA), blood urea nitrogen (BUN), blood lactate dehydrogenase (LDH), muscle glycogen (MG) and liver glycogen (LG) of each group of mice were determined. Results: EGCG treatment groups(B and C)revealed a prolonged the mice survival time of burden swimming test, hypoxia tolerance, running wheel time and the ability of stick climbing(P<0.05 orP<0.01), and increased LDH activity and MG and LG contents, reduced contents of BLA and BUN. High dose group had an obviously increase effect than lower dose group(P<0.05). Conclusion: EGCG has significant effects against exercise-induced fatigue in mice.

EGCG； exercise-induced fatigue； antagonism; rats

中央高?；究蒲袠I(yè)務費資助項目(CQDXWL-2012-100)

2014-06-23 【修回日期】2014-10-15

G804.2

A

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10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.025

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