萬(wàn)秋英

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院， 恩施 445000)

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五鶴續(xù)斷總皂苷對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬Ach代謝的影響*

萬(wàn)秋英△

(湖北民族學(xué)院附屬民大醫(yī)院， 恩施 445000)

目的：研究五鶴續(xù)斷總皂苷對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及其作用機(jī)制。方法：將40只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組(n=10)，觀察各組大鼠一般情況，以方形水迷宮評(píng)價(jià)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，采用雙抗體夾心法測(cè)定大鼠海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶(AchE)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的活性變化。結(jié)果：治療過(guò)程中，模型組大鼠一般情況無(wú)明顯變化，五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠一般情況逐步改善，活動(dòng)能力逐漸增強(qiáng)。與空白對(duì)照組比，模型組不同時(shí)間的游泳時(shí)間均明顯延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多，海馬區(qū)AchE活性明顯增強(qiáng)，ChAT活性顯著降低(P<0.01)；與模型組比，五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠不同時(shí)間的游泳時(shí)間明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少，海馬區(qū)AchE活性明顯降低，ChAT活性顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與陽(yáng)性對(duì)照組比，五鶴續(xù)斷組不同時(shí)間的游泳時(shí)間、錯(cuò)誤次數(shù)和大鼠海馬區(qū)AchE和ChAT活性無(wú)顯著性差異。結(jié)論：五鶴續(xù)斷總皂苷能夠改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)海馬區(qū)Ach代謝有關(guān)。

五鶴續(xù)斷總皂苷;阿爾茨海默??；海馬；乙酰膽堿酯酶；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶

隨著全球人口老齡化,阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，如何有效地防治AD已經(jīng)成為提高人民群眾，特別是老年人群健康水平急待解決的重要課題。但阿爾茨海默病至今病因尚不明確，目前也缺乏特效的防治藥物。近年來(lái)，有不少學(xué)者從中草藥中分離出許多天然化合物，其中一些改善癡呆癥狀比傳統(tǒng)藥物的作用要好，且副作用較少，被認(rèn)為是很有前途的抗AD藥物[1]，為AD的防治找到了新的突破口。有研究證實(shí)續(xù)斷總皂苷可顯著提高斑馬魚(yú)的認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力，中和β淀粉樣蛋白神經(jīng)毒性作用，增加神經(jīng)元的存活率，減少β淀粉樣蛋白沉積引起的細(xì)胞凋亡，改善AD患者的癡呆癥狀[2]，但其機(jī)制尚不清楚。本文擬通過(guò)觀察五鶴續(xù)斷總皂苷對(duì)AD模型大鼠海馬區(qū)乙酰膽堿酯酶(acetyl cholinesterase，AchE)和膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(choline acetyltransferase，ChAT)活性的影響,探討五鶴續(xù)斷總皂苷防治AD的作用機(jī)理，為其在臨床上防治AD提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

五鶴續(xù)斷總皂苷水溶液的制備： 用95%乙醇提取五鶴續(xù)斷后, 濃縮提取液至無(wú)醇味的浸膏, 水溶解后上大孔吸附樹(shù)酯柱, 用香草醛-濃硫酸顯色反應(yīng)比色法在波長(zhǎng)532 nm測(cè)定總皂苷的含量為52.34%，稀釋成濃度為0.72 g/L五鶴續(xù)斷總皂苷水溶液備用。D-半乳糖、三氯化鋁(上海恒信化學(xué)試劑有限公司)。AchE、ChAT試劑盒(南京建成生物工程研究所)

1.2 主要儀器

UV-2450分光光度儀，GL-20GII型高速低溫離心機(jī)，Multikan MK3酶標(biāo)儀，DW40-120低溫冰箱，BS224S電子分析天平，HFJ-10內(nèi)切式勻漿機(jī)。

1.3 動(dòng)物分組及給藥

4月齡健康清潔級(jí)Wistar大鼠,雌雄各半，體重280～320 g(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后， 經(jīng)Morris水迷宮測(cè)試從50只中選出的40只反應(yīng)正常的大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組(n=10)。模型組、五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射D-半乳糖60 mg/kg·d和灌胃三氯化鋁500 mg/kg·d, 空白對(duì)照組給予等量生理鹽水進(jìn)行腹腔注射和灌胃，連續(xù)造模42 d,采用方形水迷宮判定造模是否成功，以大鼠游完全程到達(dá)臺(tái)階的時(shí)間(游泳時(shí)間)顯著長(zhǎng)于空白對(duì)照組(P<0.05)和進(jìn)入盲端的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))顯著多于空白對(duì)照組(P<0.05)為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后，五鶴續(xù)斷組分別按100 mg/kg·d連續(xù)灌服五鶴續(xù)斷總皂苷水溶液, 陽(yáng)性對(duì)照組給予目前臨床上常用來(lái)治療AD的有效藥物腦復(fù)康0．5 g/kg·d灌胃，空白對(duì)照組和模型組灌服等量生理鹽水，連續(xù)治療42 d。

1.4 一般情況觀察和神經(jīng)行為學(xué)測(cè)試

動(dòng)物處理過(guò)程中每天清晨空腹稱(chēng)重1次，觀察大鼠的行動(dòng)、反應(yīng)能力和睡眠、飲食狀況。按實(shí)驗(yàn)要求連續(xù)治療42 d， 末次給藥后進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練和測(cè)試。方形水迷宮內(nèi)有4 個(gè)盲端, 在終點(diǎn)處有臺(tái)階,水深略低于臺(tái)階, 水溫為(22±2)℃，動(dòng)物可以通過(guò)上岸逃避溺水危險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中, 保持水迷宮周?chē)庠?、物體位置固定不變。訓(xùn)練3 d, 測(cè)試4 d。訓(xùn)練由易到難，先將大鼠放在臺(tái)階附近，使其自行上岸逃避溺水危險(xiǎn), 然后放在逐漸遠(yuǎn)離臺(tái)階的位置，引導(dǎo)大鼠游至臺(tái)階上岸逃避。測(cè)試時(shí)直接將大鼠放于水迷宮遠(yuǎn)端，記錄大鼠游完全程到達(dá)臺(tái)階的時(shí)間(游泳時(shí)間)和進(jìn)入盲端的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù)), 120 s不能游出者游泳時(shí)間按120 s計(jì)。

1.5 大鼠海馬區(qū)AchE、ChAT活性測(cè)定

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，將大鼠脫頸椎處死，迅速取腦置于冰盤(pán)上，分離海馬，稱(chēng)重，放入玻璃勻漿器中，加入冷的生理鹽水(生理鹽水的體積總量是腦組織重量的9倍)，用內(nèi)切式組織勻漿機(jī)制備成10%的腦組織勻漿，低溫離心機(jī)3 000 r/min離心10～15 min，取適量勻漿上清夜，按試劑盒說(shuō)明測(cè)定并計(jì)算海馬區(qū)AchE、ChAT活性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

造模過(guò)程中，大鼠逐漸出現(xiàn)少動(dòng)，行動(dòng)和反應(yīng)遲緩，嗜臥，飲食減少，體重下降，并進(jìn)行性加重；治療過(guò)程中，模型組上述情況無(wú)明顯改善，五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠一般情況逐步改善，活動(dòng)能力逐漸增強(qiáng)。

2.2 水迷宮檢測(cè)結(jié)果

各組大鼠游泳時(shí)間日漸縮短 錯(cuò)誤次數(shù)逐漸減少。與空白對(duì)照組比，模型組不同時(shí)間的游泳時(shí)間明顯延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增多(P<0.01)；與模型組比，五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組不同時(shí)間的游泳時(shí)間明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(P<0.01); 與陽(yáng)性對(duì)照組比，五鶴續(xù)斷組不同時(shí)間的游泳時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)無(wú)顯著性差異(表1、表2)。

Group1stday2ndday3ird4thdBlankcontrol75.44±5.2167.28±5.6952.02±4.3636.94±3.27Model102.78±8.36**95.66±9.14**74.48±6.05**56.38±4.11**Dipsacus88.92±6.18##78.24±7.65##61.58±5.74##45.20±4.29##Positivecontrol81.54±5.32##72.67±5.44##58.62±4.43##41.98±3.80##

**P<0.01vsblank control group；##P<0.01vsmodel group

2.3 各組大鼠海馬區(qū)AchE、ChAT活性的比較

與空白對(duì)照組比，模型組大鼠海馬區(qū)AchE活性明顯增強(qiáng)，ChAT活性顯著降低 (P<0.01)；與模型組比，五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠海馬區(qū)AchE活性明顯降低，ChAT活性顯著增強(qiáng)(P<0.01)；與陽(yáng)性對(duì)照組比，五鶴續(xù)斷組大鼠海馬區(qū)AchE和ChAT活性無(wú)顯著性差異(表3)。

Group1std2ndd3rdd4thdBlankcontrol6.1±1.25.4±1.23.9±0.72.2±0.8Model9.7±1.6**9.0±1.5**7.0±1.1**4.8±0.7**Dipsacus7.5±1.3##6.9±1.4##5.1±0.8##3.6±0.4##Positivecontrol6.6±1.3##6.1±2.0##4.6±0.5##3.2±0.7##

**P<0.01vsblank control group；##P<0.01vsmodel group

GroupAchEChATBlankcontrol0.37±0.03100.14±8.26Model0.76±0.09**46.56±4.74**Dipsacus0.49±0.07##82.51±5.38##Positivecontrol0.43±0.06##84.62±7.08##

AchE： Acetyl cholinesterase; ChAT: Choline acetyltransferase

**P<0.01vsblank control group；##P<0.01vsmodel group

3 討論

中樞膽堿能神經(jīng)主要分布在海馬、紋狀體和皮質(zhì)等部位 ，膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)，M膽堿能突觸是記憶的物質(zhì)基礎(chǔ)，乙酰膽堿能夠促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶[3]，盡管AD 發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜, 難以用一種假說(shuō)解釋清楚, 但腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)功能低下被認(rèn)為是造成AD 的最重要病理因素之一[4]。AD患者腦內(nèi)ACh水平降低程度與患者認(rèn)知能力的降低顯著相關(guān)，提高腦內(nèi)ACh水平,患者的記憶力認(rèn)知力就能得到改善[5，6]。在腦內(nèi)ACh的代謝水平取決于ChAT和AchE的活性，ChAT是Ach的合成酶 ，可以提高Ach的水平，AchE能夠降解乙酰膽堿,終止其對(duì)突觸后膜的興奮作用[7]。

中醫(yī)基礎(chǔ)理論認(rèn)為, 腎虛髓衰、腦絡(luò)痹阻是老年性癡呆的基本病理機(jī)制[8]。腎與腦密切相關(guān)，腎虛是衰老的基礎(chǔ), 是許多老年性疾病發(fā)生的主要原因, 若腎中精氣虧虛，腦髓得不到適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充， 則出現(xiàn)記憶、智能、精神等方面的障礙[9]。大量的研究證明五鶴續(xù)斷具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、續(xù)折傷、止崩漏、安胎等功效[10]。其通過(guò)補(bǔ)腎精氣，使髓海得養(yǎng)，聽(tīng)覺(jué)靈敏，精力充沛，記憶清楚，反應(yīng)快捷。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁復(fù)制出了膽堿能功能受損而出現(xiàn)癡呆癥狀的動(dòng)物模型。連續(xù)使用五鶴續(xù)斷總皂苷水溶液灌胃治療, 治療過(guò)程中，五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠癡呆癥狀逐步改善，記憶、認(rèn)知、活動(dòng)能力逐漸增強(qiáng)。治療42 d后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠不同時(shí)間的游泳時(shí)間明顯縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少，海馬區(qū)AchE活性明顯降低，ChAT活性顯著增強(qiáng)，而五鶴續(xù)斷組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠不同時(shí)間的游泳時(shí)間、錯(cuò)誤次數(shù)和大鼠海馬區(qū)AchE和ChAT活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說(shuō)明五鶴續(xù)斷總皂苷具有腦復(fù)康樣抗AD作用，其能促進(jìn)海馬區(qū)乙酰膽堿的合成，減少乙酰膽堿的降解，提高ACh的水平，保持神經(jīng)信號(hào)在腦內(nèi)的正常傳遞，改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)預(yù)防和治療AD有良好的應(yīng)用前景。

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Effect of Dipsacus total saponins on the ability of learning and memory and acetylcholine metabolism of hippocampus in AD rats

WAN Qiu-ying△

(Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)

Objective: To study the effects of Dipsacus total saponins on the ability of learning and memory and its mechanism of action. Methods: Forty rats were randomly divided into blank control group, model group，Dipsacus group and positive control group (n=10), general situation of rats were observed, the ability of learning and memory of rats was tested by Square water maze, the activities of acetylcholinesterase (AChE)and choline acetyltransferase (ChAT) of hippocampus in rats were measured using double antibody sandwich method. Results: During the period of treatment, general situation had no obvious change in model group, but general situation and the ability of activity were gradually improved in Dipsacus group and positive control group. Compared with blank control group, the swimming time was obviously prolonged and the number of mistakes was obviously increased at different time, the activity of AChE was significantly enhanced and the activity of ChAT was significantly decreased in model group. Compared with model group, the swimming time was obviously shortened and the number of mistakes was obviously reduced at different time, the activities of AChE were significantly decreased and the activities of ChAT were significantly enhanced in Dipsacus group and positive control group； Compared with positive control group, the swimming time and the number of mistakes at different time and the activities of AChE and ChAT had no significant difference in Dipsacus group. Conclusion: Dipsacus total saponins can improve the ability of learning and memory in Alzheimer's disease(AD) rats, its mechanism of action may be related to regulating ACh metabolism of hippocampus.

dipsacus total saponins； Alzheimer’s disease; hippocampus; acetylcholinesterase； choline acetyltransferase

2014-06-20

2014-10-20

R285.5

A

1000-6834(2015)01-082-03

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.024

△【通訊作者】Tel： 15671534176; E-mail： 907903154@qq.com