王志旺， 劉雪楓， 妥海燕， 程小麗， 郭 玫

(甘肅中醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000)

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育陰軟肝中藥對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用*

王志旺△， 劉雪楓， 妥海燕， 程小麗， 郭 玫

(甘肅中醫(yī)學(xué)院， 蘭州 730000)

目的：研究育陰軟肝方對(duì)小鼠化學(xué)性急性肝損傷的保護(hù)作用。方法：將55只昆明小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、育陰軟肝方低、中、高劑量組(n=11)，連續(xù)給藥7 d后，采用腹腔分別注射D-半乳糖胺(D-GalN)、四氯化碳(CCl4)或硫代乙酰胺(TAA)復(fù)制三種肝損傷模型，通過(guò)測(cè)定血液生化指標(biāo)、肝組織抗氧化酶及氧化產(chǎn)物的水平，研究育陰軟肝方對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果：育陰軟肝方能降低D-GalN、CCl4或TAA誘發(fā)急性肝損傷小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)的水平，提高急性肝損傷小鼠肝組織超氧化物岐化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的活性，降低丙二醛(MDA)的含量。其降酶保肝、抗氧化作用顯示出一定的量效關(guān)系。結(jié)論：育陰軟肝方對(duì)實(shí)驗(yàn)性急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

育陰軟肝方；肝損傷；抗氧化系統(tǒng)；小鼠

在養(yǎng)陰派朱丹溪“陽(yáng)常有余，陰常不足”理論[1]的指導(dǎo)下，擬定的育陰軟肝方由山茱萸、黃芩、柴胡、丹參、黃芪、醋鱉甲等中藥組成，具有育陰養(yǎng)肝、活血化瘀、理氣疏肝、補(bǔ)益氣血的功效，臨床上對(duì)肝病、特別是肝病過(guò)程中的肝纖維化有明顯的療效。為了進(jìn)一步探討育陰軟肝方的藥理作用，本次研究復(fù)制了急性化學(xué)性肝損傷模型，并從降酶保肝、抗氧化方向探討育陰軟肝方治療肝病及肝纖維化的藥理作用及作用機(jī)制，為臨床通過(guò)育陰軟肝治法來(lái)治療肝纖維化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

育陰軟肝方由山茱萸、黃芩、柴胡、丹參、黃芪、醋鱉甲等藥物組成，中藥購(gòu)自甘肅至仁同濟(jì)大藥房，加水浸泡30 min后，煎煮2次，用水量分別為藥物的10與8倍，每次煎煮1 h，混合2次煎液，濃縮至所需濃度，冷藏備用。D-半乳糖胺(D-GalN)，CAS：157297-00-6，Sigma試劑公司；四氯化碳(CCl4)，批號(hào)：20100912，廣東汕頭市西隴化工廠生產(chǎn)；硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)，批號(hào)：20090415，天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)與丙二醛(malonaldehyde, MDA)試劑盒，為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；其余試劑為分析純。

1.2 動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠，體重(20±2)g，雌雄兼用，由甘肅中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(甘)2011-0001。實(shí)驗(yàn)室為SPF級(jí)，許可證號(hào)為SCXK(甘)2011-0001。

1.3 儀器

HH-S型恒溫水浴鍋(金壇市正基儀器有限公司)，722型分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠產(chǎn)品)，TGL-16G高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，BS1103型Sartorius電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.4 對(duì)D-GalN引起的小鼠急性肝損傷的影響

取合格KM小鼠55只，按性別、體重分層隨機(jī)分為5組(n=11)：即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、育陰軟肝方高、中、低劑量組(36 g/kg、18 g/kg、9 g/kg)。各組按上述劑量灌胃給藥，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組蒸餾水灌胃20 ml/kg，每天1次，連續(xù)7 d。末次給藥1 h后，育陰軟肝方高、中、低劑量組與模型對(duì)照組按0.6 g/kg腹腔注射D-GalN[2，3]，正常對(duì)照組腹腔注射生理鹽水10 ml/kg。小鼠禁食12 h、禁食禁水6 h后，眼眶采血，分取血清測(cè)定AST與ALT；斷頸椎處死小鼠，于肝臟固定位置取肝組織適量，制成10%肝勻漿，離心，取上清液按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肝組織SOD的活性及MDA的含量。

1.5 對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷的影響

取合格KM小鼠55只，依1.4項(xiàng)下所述方法分組、給藥。末次給藥1 h后，育陰軟肝方高、中、低劑量組與模型對(duì)照組按15 mg/kg腹腔注射0.15%的CCl4花生油溶液[4-6]，正常對(duì)照組腹腔注射花生油10 ml/kg。小鼠禁食12 h、禁食禁水6 h后，眼眶采血，取血清測(cè)定ALT與AST；脫頸椎處死小鼠，打開腹腔，在相同位置取肝組織適量，制成10%勻漿，離心，取上清液按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定肝組織MDA的含量與GSH-Px的活性。

1.6 對(duì)TAA引起的小鼠急性肝損傷的影響

取合格KM小鼠55只，按1.4項(xiàng)下所述方法分組與給藥。末次給藥1 h后，育陰軟肝方高、中、低劑量組與模型對(duì)照組按0.5 g/kg腹腔注射5%的TAA[7]，正常對(duì)照組腹腔注射蒸餾水10 ml/kg。小鼠禁食12 h、禁食禁水6 h后，眼眶采血，測(cè)定血清ALT，AST的活性；脫頸椎處死小鼠，在相同位置取肝組織制成10%勻漿液，離心，取上清液測(cè)定肝組織MDA的含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 育陰軟肝方對(duì)D-GalN引起的小鼠急性肝損傷的影響

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠血清ALT與AST以及肝組織MDA的含量顯著升高，肝組織SOD的活性顯著降低(P<0.01，表1)，表明D-GalN致小鼠急性肝損傷模型復(fù)制成功。與模型對(duì)照組比較，育陰軟肝方對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)有不同程度的改善作用，即育陰軟肝方可降低ALT、AST水平及肝組織MDA的含量，提高肝組織SOD的活性；同時(shí)，9～36 g/kg的育陰軟肝方抗肝損傷作用顯示出一定的量效關(guān)系(P<0.05,P<0.01，表1)。

Tab. 1 Effect of YRD on hepatic injury in mice induced by D-GalN (±s, n=11)

YRD: Yuyin Ruangan Decoction; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase; SOD: Superoxide dismutase; MDA: Malondialdehyde

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vslow dose of YRD

2.2 育陰軟肝方對(duì)CCl4引起的小鼠急性肝損傷的影響

小鼠腹腔注射CCl412 h后，血清ALT與AST顯著升高，肝組織GSH-Px明顯降低，而MDA顯著升高，與正常對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)9～36 g/kg育陰軟肝方防治后，上述變化得到明顯改善，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與育陰軟肝低劑量組比較，育陰軟肝高劑量組對(duì)上述指標(biāo)的改善作用更加明顯，顯示出一定的量效關(guān)系(P<0.05,P<0.01，表2)。

2.3 育陰軟肝方對(duì)TAA引起的小鼠急性肝損傷的影響

腹腔注射TAA后，小鼠血清ALT與AST、肝組織MDA的含量顯著升高，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。經(jīng)育陰軟肝方干預(yù)后，血清ALT、AST、肝組織MDA的含量明顯下降，與模型對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與育陰軟肝方低劑量組比較，育陰軟肝方高劑量組的作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，表3)，顯示出一定的量效關(guān)系。

Tab. 2 Effect of YRD on hepatic injury in mice induced by CCl4(±s, n=11)

YRD: Yuyin Ruangan Decoction; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase; GSH-Px: Glutathione peroxidase; MDA: Malondialdehyde

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vslow dose of YRD

Tab. 3 Effect of YRD on hepatic injury in mice induced by TAA(±s, n=11)

YRD: Yuyin Ruangan Decoction; ALT: Alanine aminotransferase; AST: Aspartate aminotransferase; MDA: Malondialdehyde; TAA: Thioacetamide

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group;△△P<0.01vslow dose of YRD

3 討論

朱丹溪謂“人之一身，陰不足而陽(yáng)有余”，“陰不足”主要指陰精難成易虧，而“陽(yáng)有余”主要是指肝腎相火容易妄動(dòng)。陰精的難于生長(zhǎng)、相火的易于妄動(dòng)，震亨認(rèn)為是人一生中容易患病的關(guān)鍵因素之一。而要想保持陰精的充沛，首先就要盡量避免相火妄動(dòng)；在生活中使相火不致妄動(dòng)的方法是暫遠(yuǎn)“溫柔、聲音、顏色、馨香”諸物欲，尤其是“節(jié)飲食、戒色欲”。而在現(xiàn)代社會(huì)中，隨著體力勞動(dòng)的銳減、腦力勞動(dòng)的劇增、互聯(lián)網(wǎng)的普及、娛樂(lè)活動(dòng)的充斥，滿口嚼香、滿目露色已成常態(tài)，相火亦有不妄動(dòng)之理，故“陰常不足”在現(xiàn)代社會(huì)中更具有普遍意義?！案文I之陰，悉具相火”，而“相火妄動(dòng)，煎熬真陰，陰虛則病”，即相火為肝腎二臟專司，相火妄動(dòng)，易致肝腎陰虛，故補(bǔ)益肝腎之陰是治療肝腎之病的基礎(chǔ)。在多種肝病及其發(fā)病過(guò)程中出現(xiàn)的肝纖維化，肝陰虛是疾病的基本證型，氣滯血瘀是引起臨床癥狀的主要原因，而脾虛濕阻是肝郁氣滯的繼發(fā)證候。因此，陰虛血瘀是肝病及肝纖維化的基本證型，而育陰化瘀法是治療肝病的基本治則。在育陰化瘀法的指導(dǎo)下形成的育陰軟肝方由山茱萸、黃芩、柴胡、丹參、黃芪、醋鱉甲等中藥組成，具有育陰養(yǎng)肝、活血化瘀、理氣疏肝、補(bǔ)益氣血之功，臨床上對(duì)多種肝病、特別是肝纖維化及早期肝硬化有明顯的療效。

由于肝臟是機(jī)體進(jìn)行物質(zhì)代謝的重要基地，進(jìn)入機(jī)體的物質(zhì)、特別是對(duì)機(jī)體有一定毒性的物質(zhì)必須經(jīng)過(guò)肝臟代謝，降低毒性后才能從腎臟排出。在肝臟代謝、解毒的過(guò)程中，肝組織常常被有毒物質(zhì)所破壞，引起炎癥、纖維組織增生。近年來(lái)的研究表明，肝臟纖維組織增生、甚至輕度肝硬化可以逆轉(zhuǎn)[8]，這為炎癥引起的肝臟纖維化治療帶來(lái)了希望。本次實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)法復(fù)制肝損傷模型，即利用D-GalN、CCl4或TAA等化學(xué)物質(zhì)的肝組織損傷作用來(lái)復(fù)制小鼠急性肝損傷模型。D-GalN可損害肝臟細(xì)胞的細(xì)胞器，引起肝細(xì)胞代謝紊亂，同時(shí)D-GalN進(jìn)入體內(nèi)還可產(chǎn)生自由基，啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，加重肝細(xì)胞及線粒體的損傷；CCl4及其活化自由基·CCl3可與蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞而導(dǎo)致肝組織損傷；TAA代謝生成的親電子活性物質(zhì)可干擾RNA的轉(zhuǎn)錄，影響蛋白質(zhì)的合成及酶的活性[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，育陰軟肝方對(duì)不同化學(xué)性急性肝損傷動(dòng)物模型均能降低血清ALT、AST的水平，顯示出一定的降酶保肝作用；在抗氧化實(shí)驗(yàn)中，育陰軟肝方可提高SOD、GSH-Px的活性，降低MDA的含量，提示育陰軟肝方通過(guò)提高抗氧化酶的活性而減輕肝組織的氧化損傷。

綜上所述，根據(jù)育陰化瘀治則的中醫(yī)理論組成的育陰軟肝方對(duì)急性肝損傷具有一定的降酶保肝活性，從而提高肝組織抗氧化能力是其作用機(jī)制之一。

[1] 朱丹溪. 格致余論·陽(yáng)有余陰不足[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2005: 2-4.

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[9] 賴玉熔, 周炯亮. 外源性化學(xué)物誘導(dǎo)的肝氧化損傷機(jī)制[J]. 職業(yè)醫(yī)學(xué), 1995, 21(1): 45-48.

The protective effect of Yuyin Ruangan Decoction on experimental hepatic injury

WANG Zhi-wang△， LIU Xue-feng， TUO Hai-yan， CHENG Xiao-li， GUO Mei

(Gansu College of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China)

Objective: To investigate the protective effects of Yuyin Ruangan Decoction(YRD，traditional Chinese medicine) on experimental hepatic injury in mice. Methods: The mice were randomly divided into control group, model group and YRD low, middle and high dose group(n=11). By ip injection of D-GalN, CCl4or thioacetamide (TAA) , three models of hepatic injury mice were established to investigate the effects of YRD through detecting the indexes of liver function in serum and, the content of antioxidant system in the hepatic tissue. Results: YRD could decrease the content of alanine aminotransferase (ALT )and aspartate aminotransferase (AST) in serum and that of malonaldehyde (MDA) in the hepatic tissue, upregulate the activity of superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) in the hepatic tissue. Furthermore, the above effects were dosedependent in a certain degree. Conclusion: YRD has some protection effects on the model of experimental hepatic injury in mouse.

Yuyin Ruangan Decoction(YRD); hepatic injury; antioxidant system; rats

2014-09-11

2014-10-27

R285.5

A

1000-6834(2015)01-076-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.022

△【通訊作者】Tel: 0931-8765395； E-mail: wzw0933@126.com