劉網網， 鄭 怡， 夏作利， 張士鏘， 鮑 方， 林中民， 姬秀煥， 應麗麗，趙靈靈， 徐夢菲， 蔡國平△， 陳國榮△

(1. 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科， 浙江溫州 325000； 2. 安慶市第一人民醫(yī)院病理科， 安徽安慶 246004)

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Survivin和Ki67在胰腺內分泌腫瘤中表達及預后價值的評估*

劉網網1， 鄭 怡1， 夏作利1， 張士鏘1， 鮑 方2， 林中民1， 姬秀煥1， 應麗麗1，趙靈靈1， 徐夢菲1， 蔡國平1△， 陳國榮1△

(1. 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院病理科， 浙江溫州 325000； 2. 安慶市第一人民醫(yī)院病理科， 安徽安慶 246004)

目的：探討Survivin及Ki67與胰腺內分泌腫瘤(PETs)臨床病理特征和預后的關系。方法：免疫組化檢測25例正常胰腺組織和81例PETs組織芯片中Survivin、Ki67的表達情況，并分析其與預后的關系。結果：①PETs中Survivin、Ki67表達顯著高于正常胰腺組織(P<0.01)；②Survivin及Ki67在PETs中的表達均與病理分級和TNM臨床分期有關(P<0.05)，與腫瘤大小、發(fā)生部位及功能分類無相關性。另外，胞核Survivin陽性表達與淋巴結轉移具有相關性(P<0.05)；③Ki67高增殖指數(shù)與胞核Survivin陽性表達顯著相關，與胞漿Survivin相關性無統(tǒng)計學意義。結論：Survivin和Ki67在PETs中均有表達，并且與PETs的臨床病理特征關系密切，可作為評判PETs預后的新型指標。其中，胞核Survivin的陽性表達較胞漿陽性表達更具有診斷意義，其與淋巴結轉移顯著相關，是提示PETs預后不良的重要依據(jù)。

胰腺內分泌腫瘤；Survivin；Ki67；預后

胰腺內分泌腫瘤(pancreatic endocrine tumors，PETs)是一種罕見的消化系統(tǒng)內分泌腫瘤，發(fā)病率約1/10萬。此類腫瘤多為良性，而胰腺外組織、器官發(fā)生侵犯或淋巴結轉移，是PETs判斷生物學行為良惡性的重要依據(jù)。此外，一些報道中將腫瘤大小、核分裂象數(shù)、有無周圍血管神經侵犯、Ki67增殖指數(shù)視為評估患者預后的指標，但并未達成統(tǒng)一觀點[1]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)中的一員，在腎、肝、消化道等多個部位癌組織中檢測到高水平表達。Ki67是一類與細胞增殖有關的核抗原，其功能與有絲分裂關系密切，在多種惡性腫瘤中表達，表達范圍覆蓋除G0期以外的各增殖周期的細胞核。本研究通過組織芯片技術建立一個PETs樣本系列，免疫組化測定Survivin、Ki67的表達，研究其與臨床病理特征及預后的關聯(lián)性。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集1998～2011年溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院存檔的PETs 18例及由耶魯大學醫(yī)學院提供的PETs 63例，所選病例患者經粗針穿刺或外科手術均有完整臨床資料，選取的蠟塊經病理醫(yī)師鏡檢及免疫組化神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、嗜鉻粒蛋白A(chromogranin A，CgA)、突觸素(Synaptophysin，Syn)檢測確定。部分難以確定的石蠟標本轉制成電鏡標本，觀察有無分泌顆粒以確定。另選25例腫瘤旁正常胰腺組織作為對照。

1.2 主要試劑

兔抗人單克隆抗體(Survivin)、鼠抗人單克隆抗體(Ki67)工作液及免疫組化PV-6000試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3 透射電鏡標本制備

取標本0.1 cm厚切片，剔除腫瘤周邊組織，制成約0.5×0.5×0.1 cm3大小的蠟片，二甲苯脫蠟，丙酮梯度水化，0.1 mmol/L PBS緩沖液漂洗15 min×3次，1%鋨酸后固定1 h，0.1 mmol/L PBS緩沖液10 min，雙蒸水10 min×2次，1%醋酸鈾1 h，丙酮梯度脫水，環(huán)氧樹脂浸透包埋，半薄切片定位后80 nm超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色，日立H-7500透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)下觀察并拍照[2]。

1.4 組織芯片的制備

81例標本蠟塊經HE染色、閱片，選取典型腫瘤組織區(qū)域，在樣本蠟塊上用記號筆標記。制備2 cm×2 cm的模板蠟塊，用針孔直徑為2 mm的芯片制作儀在模板蠟塊上打孔。根據(jù)樣本蠟塊上的標記，在對應部位打孔采集組織芯粒并轉移至模板蠟塊孔中，每例標本取兩個點。組織芯粒全部插入后，將模板蠟塊置于烘箱(70℃)2 min，取出后壓平表面，再4 μm連續(xù)切片，制成組織芯片。

1.5 免疫組化

采用Envision二步法，切片常規(guī)脫蠟水化后，3%H2O2室溫阻斷10 min，高壓鍋煮沸抗原修復2 min，自然冷卻；Survivin、Ki67采用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)配制；滴加即用型一抗，4℃過夜；切片常溫下復溫30 min，滴加二抗，37℃ 20 min；DAB顯色，水洗，蘇木素復染，常規(guī)脫水，中性樹膠封片。

1.6 結果判定

透射電鏡下觀察腫瘤細胞內有無分泌顆粒，若出現(xiàn)分泌顆粒則可以確定屬于PETs，否則予以排除。Survivin以腫瘤細胞內出現(xiàn)黃色為陽性表達，根據(jù)Survivin陽性細胞數(shù)：≤5%為陰性，5%～50%為陽性，>50%為強陽性，胞核與胞漿評定標準一致[3]。Ki67以胞核內棕黃細顆粒染色為陽性細胞。在高倍鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)至少1 000個腫瘤細胞，計算Ki67陽性細胞百分比，即增殖指數(shù)，≤2%為低增殖指數(shù)，>2%為高增殖指數(shù)[4]。

1.7 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，用χ2檢驗分析Survivin及Ki67與臨床病理特征的聯(lián)系，用Spearman秩相關檢驗分析Survivin與Ki67增殖指數(shù)、WHO病理學分級和TNM分期的相關性。

2 結果

2.1 臨床資料

81例PETs中，男34 例，女47 例，年齡范圍(11～84)歲，平均(54.6±13.2)歲。腫塊直徑0.4～15 cm，平均直徑3.4 cm，直徑≥2 cm者50例。腫瘤位于胰頭22例，胰體21例，胰尾38例。其中，高分化內分泌腫瘤42例，良惡性未定的內分泌腫瘤21例，高分化內分泌癌13例，低分化內分泌癌5例。根據(jù)2013年中國胃腸胰神經內分泌腫瘤病理診斷共識專家組意見[5]對PETs進行分級可分為G1級42例，G2級21例，G3級18例。按臨床TNM分期[6]，Ⅰ期27例，Ⅱ期24例，Ⅲ期14例，Ⅳ期16例。

2.2 TEM下腫瘤細胞的超微結構

腫瘤細胞胞核較規(guī)則，核內染色質稍深染，無明顯染色質紊亂、邊集等現(xiàn)象發(fā)生。瘤細胞胞質內含有大量神經內分泌顆粒，體積大小不一，直徑150～200 nm，200 nm以上的神經內分泌顆粒形態(tài)變化為空泡狀結構，與周圍分界明顯(圖1)。

Fig.. 1 Transmission electron microscopy of the tumor cells A:×10 k； B: ×15 k

2.3 不同WHO分級和TNM分期的PETs中Survivin和Ki67的表達情況

根據(jù)腫瘤的WHO分級和TNM分期， PETs中Survivin和Ki67的表達情況具體見圖2(圖2，見彩圖頁Ⅴ)。

2.4 Survivin的表達與臨床病理特征的聯(lián)系及其與WHO分級和TNM分期相關性的比較

81例PETs中，Survivin在腫瘤細胞的胞漿和胞核部位都有表達，胞核染色強度較胞漿略強，正常胰腺內無表達(圖3，見彩圖頁Ⅴ)。其中，胞核Survivin表達呈強陽性4例，陽性23例，陰性54例，其陽性表達與腫瘤病理學分級(P<0.01)、臨床TNM分期(P<0.05)及腫瘤鄰近器官轉移(P<0.05)具有相關性，另外與淋巴結轉移具有顯著相關性(P<0.05)；胞漿Survivin呈強陽性表達11例，陽性29例，陰性41例，陽性表達與病理學分級(P<0.01)、臨床TNM分期(P<0.01)具有相關性，并與腫瘤鄰近器官浸潤顯著相關(P<0.01)，而與淋巴結轉移無相關性。另外，Survivin在PETs中與年齡、性別、腫瘤大小、發(fā)生部位及功能分類均無相關性。

2.5 Ki67的表達與臨床病理特征的聯(lián)系及其與WHO分級和TNM分期相關性的比較

Ki67在PETs中陽性細胞百分比范圍為0～40%，Ki67呈高增殖指數(shù)30例，低增殖指數(shù)51例(圖4，見彩圖頁Ⅴ)。其與腫瘤WHO分級(P<0.05)、TNM分期(P<0.05)及淋巴結轉移(P<0.05)具有相關性，而與腫瘤毗鄰器官浸潤無相關性。此外，Ki67在PETs中與患者年齡、性別、腫瘤大小、發(fā)生部位及功能分類無相關性。

2.6 Survivin的表達與Ki67增殖指數(shù)相關性的比較

Ki67增殖指數(shù)與胞核Survivin表達具有高度相關性(P<0.01)，而與胞漿Survivin表達無相關性。

3 討論

PETs是一種起源于胰腺管內原始多能神經干細胞的腫瘤，臨床罕見，占所有胰腺腫瘤的1%～2%，病程發(fā)展緩慢，一般預后較好。然而由于其發(fā)生位置隱蔽，少部分低分化腫瘤在發(fā)現(xiàn)時就已發(fā)生轉移，且預后不良，五年生存率不足1%[7]?，F(xiàn)階段判斷PETs的生物學行為仍未有統(tǒng)一的標準。腫瘤組織學類型、原發(fā)灶大小、有無遠處轉移、是否為根治性切除等是影響患者預后的主要因素，核分裂率和壞死也有一定的參考價值。目前，關于PETs的WHO分級標準由Capella等在2000年提出并隨后進行了多次修改，此標準是建立于專家的統(tǒng)一意見而并非是大量臨床數(shù)據(jù)基礎之上，國際上尚未形成一致標準[8]。因此，我們應尋找更可靠的指標用于提高PETs預后評估的效率。

IAPs是一類高度保守的內源性抗細胞凋亡因子家族，主要通過抑制Caspase活性發(fā)揮抗凋亡作用，其抗凋亡作用遠強于Bcl-2家族[9]。目前已發(fā)現(xiàn)8個人類IAPs家族成員，其中Survivin是作用最強的凋亡抑制因子，其作為預后不良的標記已在乳腺癌、腎癌、食管癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中有過大量報道[10]。已有研究表明，Survivin在神經內分泌腫瘤中表達是指示預后不良的一個有價值的生物學標記[4]，其陽性表達與mTOR、VEGF等多種信號通路相關[11]。本實驗中，胰腺內分泌癌Survivin陽性表達率高于Ki67呈高增殖指數(shù)的病例，說明Survivin對胰腺內分泌癌的敏感性較Ki67更高。Survivin在胞漿內陽性表達例數(shù)較胞核內陽性表達例數(shù)更多，這一現(xiàn)象可能是由Survivin在胞核與胞漿中作用方式及功能性不同所致[12]。而胞核的表達在胰腺內分泌癌中陽性率較胰腺內分泌瘤更高，且Survivin在胞核中的陽性表達與淋巴結轉移高度相關，而胞質陽性與其無統(tǒng)計學意義，提示核Survivin的陽性表達是指示預后不良的指標。根據(jù)Ekeblad[3]等的結果，隨著神經內分泌腫瘤的進展，核Survivin的表達上調，pNECs核Survivin陽性患者生存期限明顯短于分化較好的陽性患者。另外，Survivin在腫瘤調控細胞增殖與抑制凋亡過程中可以產生Survivn-ΔEx3、Survivn-2B等大量的剪接變異體，在一些腫瘤中可能對Survivn本身的功能產生影響[13]，是否同樣對PETs的預后具有診斷價值，尚需進一步研究。

Ki67作為定位于細胞核的與細胞增殖相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關，但具體作用機制尚不明確[14]。多數(shù)學者研究認為Ki67的表達與腫瘤的臨床病理分級相關性較高，隨著Ki67表達水平的增高，臨床療效及預后就越差。因此，一些報道將Ki67作為PETs的獨立評估因子，但其在PETs中敏感度和特異性不高，能否作為評價預后的標準目前仍未有統(tǒng)一意見。根據(jù)Alexiev[4]等報道，PETs的病理分級和Ki67增殖指數(shù)及腫瘤大小、局部組織轉移間并沒有明顯關聯(lián)。Grabowski[15]的研究顯示，Ki67高增殖指數(shù)并不能作為判斷PETs患者預后的主要指標。同時研究分析表明，如果將Ki67作為影響預后的唯一因素，對比PETs患者Ki67高增值指數(shù)與低增值指數(shù)生存時間，K.M.生存分析曲線并無統(tǒng)計學差異。如果將核Survivin及Ki67兩變量聯(lián)合分析，則K.M生存分析曲線有變化且對預測預后有意義。本實驗研究表明核Survivin陽性表達與Ki67增殖指數(shù)具有高度相關性，提示Survivin可能通過抑制凋亡，使腫瘤細胞處于高增殖狀態(tài)，促進腫瘤侵襲、轉移。因此，核Survivin陽性表達聯(lián)合Ki67高增殖指數(shù)可以作為判斷PETs侵襲力和預后的重要指標。

綜上所述，Survivin和Ki67均可在PETs中表達。其中，Survivin在胞漿內陽性表達提示腫瘤具有侵襲性，而胞核陽性表達更明確的指示腫瘤預后不良。胞核Survivin陽性表達與淋巴結轉移高度相關，是提示預后不良的重要依據(jù)，同時，其與腫瘤細胞增殖指數(shù)Ki67具有顯著相關性，且與腫瘤的發(fā)展和轉移密切相關，可作為早期診斷PETs及判斷預后的新型指標。

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聲 明

《中國應用生理學雜志》2014年第30卷第5期471～474頁發(fā)表的白春宏，劉浩，李雙英，彭朋，寧麗娜的《骶神經電刺激對脊髓損傷大鼠腸黏膜機械屏障的保護作用》一文，其基金項目為國家自然科學基金青年項目(81101441)、武警后勤學院博士啟動金課題(WHB201213)和武警醫(yī)學院附屬醫(yī)院科研種子基金(FYM201111)，特此聲明。

The study of the expression and the prognostic value of Survivin and Ki67 in pancreatic endocrine tumors

LIU Wang-wang1， ZHENG Yi1， XIA Zuo-li1， ZHANG Shi-qiang1， BAO Fang2， LIN Zhong-min1， JI Xiu-huan1，YING Li-li1， ZHAO Ling-ling1， XU Meng-fei1， CAI Guo-ping1△， CHEN Guo-rong1△

(1. Department of Pathology， the First Affiliated Hospital， Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000; 2. Department of Pathology， the First People’s Hospital of Anqing City， Anqing 246004， China)

Objective: To explore the relationship between the expression of Survivin and Ki67 with prognosis of pancreatic endocrine tumors (PETs). Methods: Immunohistochemistry for Survivin and Ki67 was performed in 25 cases of normal pancreatic tissues and 81 cases of PETs by tissue microarrays and to observe the expression and evaluate the relationship with prognosis. Results: ①The expression of Survivin and Ki67 in PETs was significantly higher than that in normal pancreatic tissues (P<0.01); ②The expression of Survivin and Ki67 in PETs was correlated with tissue grading and the TNM-staging (P<0.05), but not related with tumor size、location and functional status. In addition, the expression of nuclear Survivin was association with lymph node metastasis (P<0.05). ③The high expression of Ki67 was related with the expression of nuclear Survivin, but not related with the expression of cytoplasmic Survivin. Conclusion: Survivin and Ki67 were both expressed in PETs, which were closely related to the clinical pathological characteristics. They could be used as new indicators in the evaluation of prognosis of PETs. The expression of Survivin in nucleus had more diagnostic significance than that in cytoplasm, and that could be highly correlated with lymph node metastasis, which would be used as a new marker of poor prognosis.

pancreatic endocrine tumors； Survivin； Ki67； prognosis

浙江省科技廳國際合作項目(2013C24031)；浙江省自然科學基金資助項目(LY12H26002)

2014-08-13 【修回日期】2014-10-27

R736.7

A

1000-6834(2015)01-072-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.021

△【通訊作者】Tel： 0577-55579795； E-mail： guopingcai@yahoo.com; chengr1978@aliyun.com