賈 振， 孫 建， 李鴻珠， 李宏霞， 彭 雪， 邵洪江， 楊金霞， 徐長慶， 白淑芝△

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院周圍血管病科， 哈爾濱 150040； 2. 牡丹江醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)教研室, 黑龍江 牡丹江 157011；3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 黑龍江 哈爾濱 150086)

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鈣敏感受體對大鼠糖尿病性心肌病的影響*

賈 振1， 孫 建2， 李鴻珠3， 李宏霞3， 彭 雪3， 邵洪江3， 楊金霞3， 徐長慶3， 白淑芝3△

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)院周圍血管病科， 哈爾濱 150040； 2. 牡丹江醫(yī)學(xué)院機(jī)能學(xué)教研室, 黑龍江 牡丹江 157011；3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 黑龍江 哈爾濱 150086)

目的：觀察鈣敏感受體(CaSR)在大鼠糖尿病性心肌病中的作用。方法：30只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為對照組、糖尿病4周組和糖尿病8周組(n=10)。高糖高脂飲食4周后腹腔注射STZ(30 mg/kg)建立糖尿病模型。通過透射電鏡觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的變化，通過Western blot檢測心肌組織CaSR、肌漿網(wǎng) Ca2+-ATPase (SERCA)和受磷蛋白(PLN)的蛋白表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，隨著病程的延長糖尿病組大鼠心肌CaSR、SERCA蛋白表達(dá)降低，PLN表達(dá)增加，心肌結(jié)構(gòu)損傷逐漸加重。結(jié)論：在大鼠糖尿病性心肌病進(jìn)展過程中CaSR的表達(dá)逐漸降低，并可能導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)紊亂參與糖尿病心肌病的發(fā)生。

鈣敏感受體；糖尿病性心肌??；大鼠

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病的嚴(yán)重合并癥之一[1]，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚未完全闡明。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)屬于G蛋白耦聯(lián)受體，目前，關(guān)于CaSR的研究已經(jīng)成為國際上的熱點(diǎn)，國內(nèi)則剛起步不久，對其研究主要集中在慢性腎衰[2]和甲狀旁腺等疾病上，在心血管系統(tǒng)研究的較少[3]，有關(guān)CaSR在DCM發(fā)生發(fā)展中的作用更是鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察大鼠DCM不同時(shí)間點(diǎn)心肌組織CaSR蛋白表達(dá)的變化及心肌損傷的程度，擬進(jìn)一步揭示DCM的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與器材

蛋白定量試劑盒(北京碧云天)，CaSR抗體(Alpha Diagnostic International Inc., USA)；PLN、SERCA、GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)；其他試劑為國產(chǎn)分析純。主要器材包括BECKMAN 低溫離心機(jī)，紫外凝膠檢測和成像系統(tǒng)( Bio -Rad)，酶標(biāo)儀( DG3022 A)，Western blot電泳槽(北京六一廠)等。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與分組

健康 Wistar 雄性大鼠180～250 g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬二院動物研究所提供。30只雄性大鼠，飼養(yǎng)在22℃～24℃、12 h∶12 h晝夜循環(huán)的安靜環(huán)境中。適應(yīng)1周后，動物隨機(jī)分為3組：(1)正常對照組(Control)；(2)糖尿病4周組(Dia-4w)；(3)糖尿病8周組(Dia-8w)(n=10)。對照組大鼠給予正常的飲食飲水。糖尿病組大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飲食(成分：20%糖，10%豬油，2%膽固醇，1%膽酸鈉，67%基礎(chǔ)飼料)。一個(gè)月后，大鼠禁食12 h，糖尿病組通過腹腔注射低劑量佐鏈脲菌素( STZ, 30 mg/kg，溶于0.1 mol/L枸櫞酸鈉溶液中)。對照組給予單獨(dú)注射枸櫞酸鈉。三天后檢測血糖高于16.7 mmol/L為造模成功。觀察大鼠一般狀態(tài)，每周監(jiān)測血糖、飲食、飲水量，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.3 血糖、甘油三酯、膽固醇和胰島素測定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d，從下腔靜脈采血離心，于4℃冰箱靜置15 min，然后用低溫離心機(jī)離心3 000 r/min×5 min后取上清。甘油三酯和膽固醇通過全自動生化檢測儀檢測。血清胰島素通過商業(yè)化ELISA試劑盒(ADL，USA)檢測，步驟完全按照試劑盒說明書操作。通過大鼠尾靜脈采血用血糖儀(ACCU CHEK，Roche，Germany)檢測血糖。

1.4 電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)

取心室肌組織，PBS 洗滌 1 遍，4℃，2.5% 戊二醛固定；1% 鋨酸固定，常規(guī)乙醇、丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鉛-鈾雙重染色，用H-7650型透射電鏡觀察并攝片。

1.5 Western blot 檢測蛋白的表達(dá)

取各組大鼠心室肌組織，液氮研磨后加入組織裂解液，4℃ 裂解 1 h，提取蛋白。取 50 μg 總蛋白樣品進(jìn)行 10% 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜，分別用 CaSR 抗體(1∶2 000)、PLN(1∶500)、SERCA(1∶1 000)、GAPDH(1∶500)抗體， 4℃ 震蕩過夜。 再用二抗(1∶1 000 的羊抗兔 IgG 二抗；1∶1 000 的兔抗鼠 IgG 二抗，堿性磷酸酶標(biāo)記)孵育1 h后顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照、分析。計(jì)算各蛋白條帶的光密度值，蛋白表達(dá)水平用其與內(nèi)參 GAPDH 光密度比值來表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài)

實(shí)驗(yàn)期間，正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好、反應(yīng)敏捷、動作迅速、色光澤。糖尿病組大鼠全部出現(xiàn)了大量飲水，飲食增多，精神萎靡不振，反應(yīng)遲鈍，動作緩慢，毛色晦暗，視力下降(表1)。

GroupWaterintake(ml/day)Foodintake(g/day)Control28.0±2.112.5±1.1Dia-4w180.0±5.6*38.5±2.3*Dia-8w230.0±6.2*#45.0±2.9*#

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdia-4w

2.2 血糖、胰島素、甘油三酯和膽固醇測定

與正常對照組大鼠相比，糖尿病組大鼠隨機(jī)血糖顯著升高(P<0.05)，血清膽固醇(cholesterol, Chol)、甘油三酯(triglyceride， TG)和胰島素顯著升高(P<0.05)，尤其糖尿病大鼠8周組血清胰島素水平更高(P<0.05,表2)。

GroupGlucose(mmol/L)Chol(mmol/L)TG(mmol/L)Insulin(pmol/L)Control5.2±0.21.15±0.130.34±0.05268.70±12.01Dia-4w29.6±2.8*21.07±2.61*4.09±0.37*575.25±46.25*Dia-8w26.8±2.5*19.87±1.31*3.79±0.57*658.40±32.96*#

Chol: Cholesterol; TG: Triglyceride; Dia: Diabetic

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdia-4w

2.3 透射電鏡下各組心肌組織超微結(jié)構(gòu)的改變

正常對照組心肌細(xì)胞排列整齊，心肌細(xì)胞質(zhì)膜連續(xù)、完整，肌絲排列整齊，線粒體豐富，大小均一、排列整齊。糖尿病組心肌細(xì)胞排列紊亂，心肌細(xì)胞質(zhì)膜模糊、斷裂，線粒體腫脹，空泡樣變，大小不一，排列紊亂，糖尿病8周組更為明顯(圖1)。

Fig. 1 Ultrastructure alteration of rat myocardium in different goups (×5 000)

2.4 心肌組織 CaSR、SERCA、PLN 蛋白表達(dá)的變化

與正常對照組相比，糖尿病組大鼠心肌組織CaSR表達(dá)量隨病程延長逐漸降低(P<0.05,圖2A)，同時(shí)SERCA表達(dá)逐漸減少，PLN表達(dá)升高，SERCA/PLN比值逐漸降低，說明鈣泵的活性逐漸降低(圖2B)。

Fig.. 2 Protein expression of CaSR(A), SERCA and PLN(B) in heart CaSR： Calcium-sensing receptor； SERCA： Ca2+-ATPase； PLN： Phospholamban; Dia: Diabetic*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsdia-4w

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制大鼠DCM 動物模型，觀察大鼠的一般狀態(tài)及超微結(jié)構(gòu)變化，并檢測心肌組織CaSR及相關(guān)鈣調(diào)控蛋白的表達(dá)來探討CaSR在大鼠DCM發(fā)生中的作用。

本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合小劑量STZ腹腔注射的方法來復(fù)制大鼠2型DCM 動物模型。與對照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)與臨床糖尿病患者類似的表現(xiàn)(多食和多飲)，血糖、甘油三酯、膽固醇顯著升高，血清中胰島素水平也明顯升高，表明出現(xiàn)了胰島素抵抗。上述結(jié)果，說明本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠2型DCM 動物模型。

與正常大鼠相比，糖尿病大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯的改變，出現(xiàn)了線粒體腫脹、肌原纖維斷裂和細(xì)胞核染色質(zhì)的濃縮和邊集化。心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷符合Cooper GJ[4]、林中民等[5]報(bào)道的DCM的特點(diǎn)。由此可見，我們成功地復(fù)制了2型糖尿病大鼠誘導(dǎo)的DCM模型。

DCM 的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，迄今尚不十分清楚。本文采用Western blot 方法檢測了糖尿病大鼠4周和8周時(shí)心肌CaSR蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠心肌CaSR蛋白的表達(dá)呈時(shí)間依賴性降低，這一變化和心肌超微結(jié)構(gòu)損傷的程度密切相關(guān)。Ward等用STZ復(fù)制的大鼠糖尿病模型，2周后發(fā)現(xiàn)腎臟CaSR表達(dá)降低約50%。Weston 等發(fā)現(xiàn)，ZDF大鼠腸系膜動脈CaSR表達(dá)降低是引起糖尿病血管合并癥的重要原因之一[6]?？磥?，糖尿病或肥胖癥大鼠其他器官同我們觀察到的心肌相同，CaSR的表達(dá)也是降低的。

目前認(rèn)為，DCM與慢性心力衰竭一樣，伴有Ca2+調(diào)控蛋白表達(dá)及活性異常，這是造成心肌舒縮功能異常的主要原因[7]。PLN和SERCA是心肌細(xì)胞 Ca2+調(diào)控的重要蛋白，在糖尿病狀態(tài)下發(fā)生失調(diào)，必然引起心肌功能受損[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠4周和8周心肌組織 SERCA表達(dá)減少，PLN表達(dá)增強(qiáng)。SERCA活性降低可引起肌漿網(wǎng)攝取Ca2+能力下降，直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)紊亂從而造成心臟功能異常、引起心肌損傷。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)2型糖尿病大鼠心肌組織CaSR表達(dá)呈時(shí)間依賴性降低，DCM大鼠心肌出現(xiàn)鈣穩(wěn)態(tài)紊亂，造成心肌的進(jìn)一步損傷，這將為臨床DCM的治療提供新的理論基礎(chǔ)。

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Decreased expression of calcium-sensing receptor involved in the progression of diabetic cardiomyopathy

JIA Zhen1, SUN Jian2, LI Hong-zhu3, LI Hong-xia3, PENG Xue3, SHAO Hong-jiang3,YANG Jin-xia3, XU Chang-qing3, BAI Shu-zhi3△

(1.Department of Peripheral Angiopathy, the First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040;2. Mudanjiang Medical College, Mudanjiang 157011; 3. Department of Pathophysiology, Harbin Medical University, Harbin 150086， China)

Objective: To observe the dynamic expression of calcium-sensing receptor(CaSR) in myocardium of diabetic rats. Methods: Thirty male Wistar rats were randomly divided into 3 groups including control, diabetic-4 week and diabetic-8 week groups(n=10). The type 2 diabetes mellitus models were established by intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ, 30 mg/kg) after high-fat and high-sugar diet for one month. The cardiac morphology was observed by electron microscope. Western blot analyzed the expression of CaSR, phospholamban (PLN), a calcium handling regulator, and Ca2+-ATPase(SERCA) in cardiac tissues. Results: Compared with control group, the expressions of CaSR and SERCA were decreased, while the expression of PLN was significantly increased in a time-dependent manner in diabetic groups. Meanwhile diabetic rats displayed abnormal cardiac structure. Conclusion: These results indicate that the CaSR expression of myocardium is reduced in the progression of DCM, and its potential mechanism may be related to the impaired intracellular calcium homeostasis.

calcium-sensing receptor; diabetic cardiomyopathy; Wistar rat

國家自然科學(xué)基金(81200160，81270273,81270311, 81070123，81300163)；黑龍江省自然科學(xué)基金(QC2011C022)

2014-07-17 【修回日期】2014-10-17

R363.2

A

1000-6834(2015)01-035-03

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.011

△【通訊作者】Tel: 0451-86674548； E-mail: baishuzhi12@163.com