何金波, 包財盈, 葉玉柱, 羅梓垠, 應(yīng) 磊， 王萬鐵

(溫州醫(yī)科大學(xué)缺血/再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035)

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缺氧/復(fù)氧大鼠心肌中IL-1β濃度的動態(tài)變化及意義*

何金波, 包財盈, 葉玉柱, 羅梓垠, 應(yīng) 磊， 王萬鐵△

(溫州醫(yī)科大學(xué)缺血/再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035)

目的：探討大鼠心肌中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)在心肌缺氧/復(fù)氧過程中的動態(tài)變化及其意義。方法：采用Langendorff方法制備離體大鼠心肌缺氧/復(fù)氧模型。40只雄性SD大鼠隨機分為對照組(A組)和缺氧/復(fù)氧組( H/R組)。H/R組按照復(fù)氧時間分為H/R 0.5 h、H/R 1 h、H/R 2 h組(B、C、D組)(n=10)。連續(xù)紀(jì)錄各組左室發(fā)展壓(LVDP)、左心室發(fā)展壓最大上升/下降速率(± dp/dtmax)的變化，ELISA檢測各組心肌IL-1β和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的濃度，RT-PCR檢測心肌IL-1β mRNA 的表達(dá)水平，光鏡觀察心肌結(jié)構(gòu)。結(jié)果：與對照組相比，H/R組大鼠 LVDP、 ± dp/dtmax值均降低(P<0.05)，心肌中IL-1β的含量及IL-1β mRNA 的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，CK-MB濃度上升(P<0.05)，隨復(fù)氧時間的延長以上指標(biāo)的變化更明顯,B、C、D組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，H/R 2 h組心肌中的IL-1β、CK-MB的濃度以及IL-1β mRNA 的表達(dá)量與A、B、C組相比，達(dá)到最高(P<0.05)。結(jié)論：大鼠心肌缺氧/復(fù)氧后IL-1β在心肌組織中的表達(dá)上升并引起心肌再灌注損傷。

IL-1β；心肌缺血/再灌注損傷；血流動力學(xué)

心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)是指缺血心肌在恢復(fù)血流灌注后所產(chǎn)生的心肌損傷加重的現(xiàn)象。隨著近些年來心肌梗死后冠狀動脈再灌注治療技術(shù)的發(fā)展，MI/RI成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的熱點。研究表明，再灌注期間，自由基的大量生成、細(xì)胞鈣超載、炎癥反應(yīng)、凋亡是導(dǎo)致MIRI的重要原因[1]。作為白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)家族中的一員，IL-1β是反映IL-1系統(tǒng)活性的重要指標(biāo)[2]，它可以激活免疫細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子促進自由基等的產(chǎn)生和釋放，參與介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要過程[3]。IL-1β與許多心臟疾病，如冠心病、心肌梗死的發(fā)生與發(fā)展有密切關(guān)系[4],并且在缺血性心臟病心肌細(xì)胞凋亡的進程中具有重要作用[5]。本研究旨在通過觀察IL-1β在大鼠心肌缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)過程中的動態(tài)變化，探討IL-1β在心肌缺血/再灌注損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RT-PCR引物購自上海生工生物工程技術(shù)公司，RT-PCR試劑盒購自美國Thermo公司，大鼠IL-1β ELISA試劑盒購自上海西唐生物科技有限公司，其它試劑為市售分析純產(chǎn)品。改良克氏液(Krebs-Henseleit，K-H)：氯化鈉 118.5 mmol/L，氯化鉀4.8 mmol/L，硫酸鎂1.2 mmol/L，磷酸二氫鉀1.2 mmol/L，碳酸氫鈉25.0 mmol/L，氯化鈣2.5 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L，pH 7.40±0.05。改良ThomasⅡ停搏液：氯化鈉110 mmol/L，氯化鉀16 mmol/L，氯化鈣1.2 mmol/L，碳酸氫鈉1.0 mmol/L，氯化鎂16 mmol/L，pH 7.80±0.05。

1.2 動物模型的制備與分組

SPF級健康雄性SD大鼠40只，體重(280±30)g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[SYXK(浙)2010-0150]。將大鼠隨機分為空白對照組(A組)、缺氧/復(fù)氧30 min組(B組)、缺氧/復(fù)氧1 h組(C組)、缺氧/復(fù)氧2 h組(D組)(n=10)。大鼠稱重后，用5%水合氯醛(7～8)ml/kg腹腔注射麻醉，開腹，經(jīng)下腔靜脈注射肝素(1 000 U/kg)抗凝，迅速開胸取出心臟，將心臟懸掛在Langendorff離體心臟灌流裝置上，經(jīng)主動脈進行逆行灌注，恒溫恒壓灌流，灌注液溫度(37±0.5)℃，灌注壓100 mmHg。A組在建立Langendorff離體心臟灌注模型的基礎(chǔ)上，平衡灌注20 min后將心臟保存；B、C、D組在平衡灌注20 min后，持續(xù)灌注改良ThomasⅡ停搏液3 min，使心臟完全停搏，繼而停灌30 min，然后再復(fù)灌恒溫恒壓并通有混合氣體的K-H緩沖液使其復(fù)跳并持續(xù)灌注，復(fù)灌的時間分別為30 min、1 h、2 h。

1.3 監(jiān)測心功能相關(guān)指標(biāo)

從左心耳向左心室插入球囊，球囊內(nèi)注射適量生理鹽水，直至左心室舒張末期壓力(left ventricular end dilated pressure ，LVEDP)維持在(4～10)mmHg，通過Powerlab八通道生理記錄儀連續(xù)記錄各組左室發(fā)展壓(1eft ventricular development pressure，LVDP)、左心室發(fā)展壓最大上升/下降速率( maximal rates of increase/decrease of the left ventricular pressure，±dp/dtmax)的變化。

1.4 ELISA方法檢測心肌組織中IL-1β和CK-MB的蛋白表達(dá)水平

取心肌組織100 mg，在超聲勻漿機中充分勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)入1.5 ml EP管中，4℃,3 000 r/min，離心15 min，取上清，用BCA試劑盒對上清液進行蛋白定量，用大鼠IL-1β ELISA試劑盒和大鼠CK-MB ELISA試劑盒進行IL-1β和CK-MB蛋白表達(dá)水平的檢測。

1.5 RT-PCR方法檢測心肌組織中IL-1β mRNA的表達(dá)水平

Trizol法提取大鼠心肌組織總RNA，蛋白核酸儀進行RNA濃度檢測。按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA產(chǎn)物。按RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書準(zhǔn)備25 μl的反應(yīng)體系： 模板cDNA 1 μl ，PCR Mix 12.5 μl，上下游引物各1 μl，加三蒸水至25 μl。IL-1β的上游引物為5’-CTTCAAATCTCACAGCAGCATC-3’，下游引物為5’-GCTGTCTAATGGGAACATCACA-3’，擴增片段長度：220 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性3 min，進入循環(huán)：94℃ 30 s，59.6℃ 30 s，72℃ 1 min，28個循環(huán)，再72℃ 5 min。β-actin上游：5’-TCAGGTCATCACTATCGGCAAT-3’，下游：5’-AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA-3’，擴增片段長度：432 bp。PCR反應(yīng)條件：94℃ 預(yù)變性3 min，進入循環(huán)：94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，29個循環(huán)，再72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，用MUVB-20凝膠圖像分析儀進行灰度值掃描，拍照。用Quantity One凝膠軟件分析系統(tǒng)分析灰度值。

1.6 HE染色標(biāo)本制備

各組停灌后迅速從心尖部同一部位取材，用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察心肌組織結(jié)構(gòu)的改變。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組動物心功能參數(shù)的的比較

與A組相比，B、C、D組的LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax值明顯降低(P<0.05)；B、C、D組隨著復(fù)氧時間延長，LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的值逐漸下降，B、C、D組間LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的值兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；D組與其他組相比，LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax值達(dá)到最低(P<0.05,表1)。

Group+dp/dtmax(mmHg/s)-dp/dtmax(mmHg/s)LVDP(mmHg)A7096.36±319.52-3318.56±310.28225.31±27.45B6479.32±286.73*-2731.65±359.25*153.89±10.14*C5125.74±241.93*#-2054.57±413.20*#123.32±3.99*#D3070.58±410.64*#Δ-757.93±283.54*#Δ42.16±16.43*#Δ

A: Sham group; B: H/R 0.5 h group; C: H/R 1 h group; D: H/R 2 h group; +dp/dtmax: Maximal rates of increase of the left ventricular pressure; -dp/dtmax: Maximal rates of decrease of the left ventricular pressure;LVDP:Left ventricular development pressure； H/R: Hypoxia /reoxygenation

*P<0.05vsA group;#P<0.05vsB group;ΔP<0.05vsC group

2.2 各組大鼠心肌組織IL-1β和CK-MB蛋白的表達(dá)水平

與A組比較，B、C、D組心肌組織中IL-1β的表達(dá)明顯增高(P<0.05)，CK-MB的濃度上升(P<0.05)；在B、C、D組，IL-1β和CK-MB的水平隨著復(fù)氧時間的延長而升高，B、C、D組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與A、B、C組相比，D組心肌組織中IL-1β和CK-MB的表達(dá)達(dá)到到高峰(P<0.05，表2)。

GroupIL-1β(pg/ml)CK-MB(ng/ml)A90.52±17.3522.83±3.79B148.87±19.27*62.82±2.71*C206.21±16.11*#114.71±28.08*#D280.03±55.07*#158.18±7.74*#Δ

A: Sham group; B: H/R 0.5 h group; C: H/R 1 h group; D: H/R 2 h group; IL-1β: Interleukin-1β; CK-MB: Creatine kinase-MB; H/R: Hypoxia /reoxygenation

*P<0.05vsA group;#P<0.05vsB group;ΔP<0.05vsC group

2.3 各組大鼠心肌組織IL-1β mRNA的表達(dá)水平

RT-PCR發(fā)現(xiàn)，各組心肌組織均見220 bp的IL-1β mRNA條帶，對各組的IL-1β mRNA表達(dá)進行半定量分析，B、C、D組IL-1β mRNA的表達(dá)量與對照組相比顯著升高(P<0.01)；隨著復(fù)氧時間的延長，在B、C、D組，IL-1β mRNA的表達(dá)量逐漸升高，B、C、D組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；D組與其他組相比，IL-1β mRNA的表達(dá)量達(dá)到最高(P<0.01，圖1)。

2.4 相關(guān)性分析結(jié)果

大鼠心肌缺氧/復(fù)氧期間LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的值與心肌組織IL-1β的濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；大鼠心肌組織CK-MB的表達(dá)量與心肌組織IL-1β的濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.01)；心肌IL-1β mRNA相對表達(dá)量與心肌組織IL-1β的濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.01)；心肌缺氧/復(fù)氧期間LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的值與心肌組織IL-1β mRNA相對表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；大鼠心肌組織CK-MB的表達(dá)量與心肌組織IL-1β mRNA相對表達(dá)量呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。

2.5 光鏡下大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)觀察

A組心肌細(xì)胞排列整齊，形態(tài)正常，細(xì)胞核居中，未見炎性細(xì)胞浸潤;B組心肌細(xì)胞大體正常，排列尚有序，部分出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤;C組心肌纖維腫脹、變性，部分出現(xiàn)壞死;D組心肌纖維出現(xiàn)大范圍斷裂、溶解(圖2，見彩圖頁Ⅱ)。光鏡下大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)觀察表明隨著復(fù)氧時間延長，大鼠心肌組織損傷逐漸加重。

3 討論

隨著冠心病，心肌梗死發(fā)病率的節(jié)節(jié)攀高，溶栓治療、PCI和搭橋手術(shù)在臨床上也日趨廣泛，這意味著術(shù)后心肌缺血/再灌注損傷會成為困繞臨床醫(yī)師的重要問題，自1960年Jennings第一次提出心肌缺血/再灌注損傷的概念以來，其具體機制也一直不斷地被探討，作為一種中介因素，炎癥反應(yīng)貫穿于心肌缺血/再灌注損傷的全過程，不僅能夠激活中性粒細(xì)胞合成并釋放炎癥介質(zhì)，通過級聯(lián)反應(yīng)引起血管內(nèi)皮細(xì)胞游走收縮，使血管通透性增加，誘導(dǎo)細(xì)胞以及血管細(xì)胞粘附分子的表達(dá)增加，最終導(dǎo)致再灌注心肌的炎癥損傷[6]，而且能夠與其他損傷因素相互作用，共同導(dǎo)致心肌的缺血/再灌注損傷[7]。

作為炎癥反應(yīng)的啟動因子，IL-1β廣泛參與了組織破壞、水腫形成等多種病理損傷過程，在炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的機體缺血/再灌注損傷中也發(fā)揮著重要作用。有研究表明，腦、肝臟、腎臟等其他器官在經(jīng)歷缺血/再灌注后，炎癥通路被激活，炎癥因子的表達(dá)量升高，而在使用藥物或者缺血預(yù)處理干預(yù)后，相應(yīng)組織與血漿中IL-1β的含量降低，器官的缺血/再灌注損傷也得到有效緩解[8, 9]。IL-1β可直接上調(diào)細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)和內(nèi)皮白細(xì)胞黏附分子-1(endothelial leukocyte adhesion molecule-1, ELAM-1)表達(dá)，進而誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移至心肌缺血區(qū)域，通過影響微血管通透性、釋放氧自由基等機制導(dǎo)致最終引起心肌再灌注損傷。在李擁軍的研究中表明，急性心肌梗死患者在接受PCI治療后，再灌注過程中血漿IL-1β表達(dá)上升，于術(shù)后12 h血漿IL-1β水平達(dá)到高峰，而在兔的心肌缺血/再灌注模型中，再灌注即刻給予重組人IL-1受體拮抗劑(recombinant human interleukin-1 receptor antagonist, rhIL-1ra)之后，心肌再灌注損傷明顯減輕，梗死面積縮小[10]。

本實驗采用Langendorff離體灌流系統(tǒng)制備大鼠心臟缺氧/復(fù)氧模型，研究結(jié)果顯示，作為提示心功能早期損傷的敏感指標(biāo)，復(fù)氧期間CK-MB在心肌中的表達(dá)量逐漸升高，LVDP、+dp/dt、-dp/dt的值呈下降趨勢，隨著復(fù)氧時間延長，心肌損傷加重。缺氧/復(fù)氧組的心肌IL-1β的含量普遍高于對照組(P<0.05)，而在缺氧/復(fù)氧組組內(nèi)，B、C、D組隨著再灌注時間的延長，IL-1β的表達(dá)量逐漸上升，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，反映出心肌的再灌注損傷與再灌注期間IL-1β的高表達(dá)所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)聯(lián)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，大鼠心肌缺氧/復(fù)氧期間LVDP、+dp/dtmax、-dp/dtmax的值與心肌組織IL-1β的濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，心肌組織CK-MB的表達(dá)量與心肌組織IL-1β的濃度呈顯著正相關(guān)(P<0.01)，反映了缺氧/復(fù)氧期間心肌損傷的發(fā)生與發(fā)展和心肌組織中IL-1β的水平有密切關(guān)系。病理形態(tài)學(xué)觀察可見，心肌缺氧/復(fù)氧后呈明顯缺血、壞死性改變，在復(fù)氧的不同時間點其表現(xiàn)程度不同，最典型的特征是大量炎細(xì)胞浸潤，也證實了炎癥反應(yīng)在再灌注損傷中的重要地位。

綜上所述，在心肌缺氧/復(fù)氧過程中，心肌組織IL-1β的表達(dá)量呈動態(tài)的的上升趨勢，并與再灌注損傷的程度相一致，因此我們有理由相信大鼠心肌缺氧/復(fù)氧過程中IL-1β介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是引起再灌注損傷的重要機制，這對臨床上心肌缺血/再灌注損傷的預(yù)防與治療有一定的指導(dǎo)意義。

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Dynamic changes of IL-1β in rat myocardium during hypoxia/ reoxygenation transition

HE Jin-bo, BAO Cai-ying, YE Yu-zhu, LUO Zi-yin, YING Lei, WANG Wan-tie△

(Ischemia/Reperfusion Injury Research Institute, Whenzhou Medical University, Whenzhou 325035, China)

Objective: To investigate the expression profile of interleuki-1β (IL-1β) in rat myocardium at different time points during hypoxia/reoxygenation(H/R)transition. Methods: The isolated Langendorff perfused rat heart model was established．Forty SD rats were randomly divided into sham group (A group) and hypoxia/reoxygenation group (H/R group). The H/R group rats were subdivided into H/R 0.5 h group(B group), H/R 1 h group(C group), H/R 2 h group(D group)according to reoxygenation time. The 1eft ventricular development pressure(LVDP) , maximal rates of increase/decrease of the left ventricular pressure(±dp/dtmax) were continuously recorded．The concentration of interleukin-1β( IL-1β ) and creatine kinase-MB (CK-MB) in myocardium was measured by ELISA. The mRNA expression of IL-1β in myocardium was determined by RT-PCR. Microstructure of myocardium was observed under light microscopy. Results: The value of LVDP and ± dp/dtmaxin hypoxia/reoxygenation group rat were significantly lower than that in sham group(P<0.05). The expression of IL-1β and CK-MB at protein level and the expression of IL-1β at mRNA level in hypoxia /reoxygenation group were higher than that in sham group(P<0.05). There were significant differences of the above parameters among H/R 0.5 h,1 h,2 h group(P<0.05). The concentration of IL-1β and CK-MB, the mRNA expression of IL-1β were higher in H/R 2 h group than that of other groups(P<0.05). Conclusion: The high expression of IL-1β in myocardium after myocardial hypoxia /reoxygenation in rats might lead to.ischemia/reperfusion injury.

IL-1β； myocardial ischemia/reperfusion injury； hemodynamics

R363

A

1000-6834(2015)01-027-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.009