李 娜， 劉 群， 李曉娟， 白曉暉， 劉玥蕓， 金鐘曄， 景玉霞,2, 嚴(yán)志礻韋, 陳家旭△

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 北京 100029； 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830054)

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2型糖尿病合并抑郁癥大鼠模型的建立及評(píng)價(jià)*

李 娜1， 劉 群1， 李曉娟1， 白曉暉1， 劉玥蕓1， 金鐘曄1， 景玉霞1,2, 嚴(yán)志礻韋1, 陳家旭1△

(1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 北京 100029； 2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 烏魯木齊 830054)

目的：建立2型糖尿病合并抑郁癥大鼠模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步研究該病提供動(dòng)物模型。方法：將24只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組(n=8)：正常組(N組)、2型糖尿病組(T組)、2型糖尿病合并抑郁癥組(T+D組)。采用高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素(STZ)的方法制備2型糖尿病模型，在其基礎(chǔ)上再用21 d慢性束縛的方法建立2型糖尿病合并抑郁癥大鼠模型。21 d慢性束縛后做口服葡萄糖耐受試驗(yàn)(OGTT)和胰島素耐受試驗(yàn)(ITT)；利用行為學(xué)設(shè)備對(duì)大鼠曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析，了解大鼠的抑郁程度；取材后用ELISA法檢測(cè)大鼠血清5-羥色胺(5-HT)和多巴胺(DA)，驗(yàn)證評(píng)價(jià)模型是否成功。結(jié)果：在ITT和OGTT中，T組和T+D組的血糖在180 min后沒有恢復(fù)到正常水平；曠場(chǎng)行為學(xué)分析表明T+D組大鼠5 min內(nèi)最大移動(dòng)距離，中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間和中央?yún)^(qū)滯留次數(shù)降低；T+D組血清中5-HT和DA含量降低。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)利用高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射小劑量STZ及21 d慢性束縛的方法，成功復(fù)制2型糖尿病合并抑郁癥大鼠模型，適用于后續(xù)研究。

2型糖尿病合并抑郁癥；大鼠模型；鏈脲佐菌素；胰島素耐受試驗(yàn)；口服葡萄糖耐受試驗(yàn)；5-羥色胺；多巴胺；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

糖尿病與抑郁癥是目前多發(fā)的疾病，兩者又經(jīng)常同時(shí)發(fā)病，兩者均存在學(xué)習(xí)能力、記憶能力等認(rèn)知功能障礙[1,2]，糖尿病合并抑郁癥的癥狀為糖、蛋白質(zhì)及脂肪代謝紊亂，持續(xù)高血糖并伴有情緒障礙，主要為情緒低落、興趣減退、悲觀、失望、睡眠障礙，且患者的抑郁癥狀越嚴(yán)重認(rèn)知功能損害也越嚴(yán)重，導(dǎo)致社會(huì)關(guān)系惡化，嚴(yán)重者有自殺傾向[3]，給社會(huì)和家庭帶來極大的負(fù)擔(dān)。國內(nèi)資料表明，國內(nèi)糖尿病人群中抑郁癥狀的發(fā)病率為32.4%，高于正常人群的發(fā)病率[4]，糖尿病伴發(fā)抑郁癥的危險(xiǎn)因素為性別、年齡、婚煙狀況、病程、并發(fā)癥數(shù)目、長期高血糖等，次要危險(xiǎn)因素是膽固醇和甘油三酯的水平[5]。糖尿病合并抑郁癥的具體機(jī)制尚不明朗，用鏈脲佐菌素( streptozotocin, STZ)誘發(fā)糖尿病模型歷史較長，有50年的歷史[6，7]，本課題組采用的21 d慢性束縛建立抑郁癥模型也有良好穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[8]。因此本課題組采用高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射小劑量STZ的方法制備2型糖尿病模型，并在其基礎(chǔ)上再用21d慢性束縛應(yīng)激抑郁的方法建立2型糖尿病合并抑郁癥大鼠模型。前期實(shí)驗(yàn)從大鼠的空腹血糖，體重和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的5 min內(nèi)總移動(dòng)距離和移動(dòng)速度對(duì)此模型進(jìn)行了探討[9]，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)從胰島素耐受試驗(yàn)(insulin tolorance test, ITT)、口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test, OGTT)、血清5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)和多巴胺(dopamine, DA)變化、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)大鼠5 min內(nèi)最大移動(dòng)距離(max movement distance)和在中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間(zone definition)和中央?yún)^(qū)滯留次數(shù)(zone frequency)對(duì)此模型進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar大鼠38只，雄性，4周齡，體重(170±20) g。購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2012-0001]。實(shí)驗(yàn)在北京中醫(yī)藥大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[SYXK(京)2011-0024]。

1.1.2 試劑、儀器、藥品制備 STZ: Sigma公司(美國)。一水合檸檬酸：西隴化工股份有限公司(中國)。二水合檸檬酸三鈉：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(中國)。強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖儀及配套試紙(美國)。大鼠束縛架：自制，木質(zhì)結(jié)構(gòu)，上面兩側(cè)分別有兩條可以調(diào)節(jié)的粘貼軟帶，分別用來束縛大鼠的胸部和腹部(中國)。大鼠曠場(chǎng)行為測(cè)試箱：自制，木質(zhì)(長×寬×高為100 cm×100 cm×40 cm)，底面由黃色線條劃分成面積相等的25個(gè)方格(中國)。計(jì)算機(jī)WV-CP470攝像頭(Panasonic)(日本)。The Obserber. 5.0分析軟件(Noldus，Netherlands)，EthoVision 3.0分析軟件(Noldus，Netherlands)進(jìn)行分析(荷蘭)。大鼠5-羥色胺酶聯(lián)免疫試劑盒(Lot: 20141130. 60087R)。大鼠多巴胺酶聯(lián)免疫試劑盒(Lot: 20141130. 60088R)，儀器：Thermo Multiskan MK3(芬蘭)。

1.1.3 飼料 基礎(chǔ)飼料由北京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供[SCXK(京)2009-0012]；高脂飼料購自北京華阜康公司(配方：68.8%基礎(chǔ)飼料、10%蔗糖、10%豬油、10%蛋黃粉、1%膽固醇、0.2%膽鹽)[SCXK(京)2009-0008]。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 38只大鼠均SPF級(jí)飼養(yǎng)，每天12 h光照維持，晝夜循環(huán)，自由飲水進(jìn)食。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按體重隨機(jī)分為兩組，其中8只為正常組，飼以普通飼料，其余30只大鼠飼以高脂飼料。6周后，夜間禁食14 h后，高脂飼料組腹腔注射STZ (35 mg/kg溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液，pH 4.4)于3 d后及7 d后測(cè)空腹血糖，測(cè)得兩次血糖值> 11.1 mmol/L者為2型糖尿病造模成功[10]。選取造模成功的19只大鼠，按血糖高低編號(hào)，用Excel表進(jìn)行隨機(jī)分組，分為2型糖尿病模型組(T組)，2型糖尿病合并抑郁癥模型組 (T+D組)。

1.2.2 2型糖尿病模型成功后慢性束縛應(yīng)激模型的建立 2型糖尿病合并抑郁癥造模參考[11，12]，并進(jìn)行改良，采用本課題組長期穩(wěn)定的慢性束縛應(yīng)激抑郁模型[13]，即將2型糖尿病大鼠捆綁在自制的束縛架上造模，隨機(jī)選取時(shí)間進(jìn)行束縛，3 h/d，連續(xù)21 d。正常組及2型糖尿病組不予束縛，但在相同的時(shí)間內(nèi)禁食禁水。

1.2.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法 (1)胰島素耐受試驗(yàn)：在慢性束縛21 d后進(jìn)行胰島素耐受試驗(yàn)，非麻醉狀態(tài)下5 min內(nèi)皮下注射胰島素0.6 u/kg，通過尾靜脈采血，測(cè)定0 min、30 min、60 min、120 min、180 min的血糖值，觀察和評(píng)價(jià)大鼠的胰島損傷情況。

(2)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)：在慢性束縛21 d后進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)，根據(jù)WHO推薦的方法在非麻醉狀態(tài)下5 min內(nèi)灌喂葡萄糖2.5 g/kg[14]，通過尾靜脈采血，測(cè)定0 min、30 min、60 min、120 min、180 min的血糖值，觀察和評(píng)價(jià)大鼠糖耐量情況。

(3)血清5-HT和DA：禁食12 h后，麻醉后腹主動(dòng)脈采血2 ml，分裝在一次性自動(dòng)定量采血管中，3 000 r/min離心30 min，分離血清后收集，于-20℃凍存?zhèn)溆茫?-HT和DA采用ELISA法測(cè)定。

(4)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) (open field test)：在安靜、遮光的環(huán)境下進(jìn)行。將大鼠放入箱內(nèi)底面中心，利用同步錄像、計(jì)時(shí)，觀察5 min內(nèi)大鼠在曠場(chǎng)行為測(cè)試箱內(nèi)的活動(dòng)情況。每只大鼠檢測(cè)完畢后用70%酒精清洗方箱內(nèi)壁及底面，以免上次大鼠余留的信息(如大鼠的大、小便、氣味)影響下次測(cè)試結(jié)果。更換大鼠，繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。觀察指標(biāo)如下：最大移動(dòng)距離：5 min內(nèi)大鼠最大的運(yùn)動(dòng)長度；中央?yún)^(qū)滯留時(shí)間：5 min內(nèi)大鼠于中央?yún)^(qū)滯留的時(shí)間；中央?yún)^(qū)滯留次數(shù)：5 min內(nèi)大鼠于中央?yún)^(qū)滯留的次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 胰島素耐受試驗(yàn)

給予高脂飼料及腹腔注射STZ制備2型糖尿病模型并21 d慢性束縛刺激后，T組和T+D組胰島素受損，在0、30、60、120、180 min各組大鼠血糖均升高，與N組比較差異有顯著性(P<0.01，圖1，見彩圖頁Ⅲ)，T+D組與T組大鼠在180 min沒有恢復(fù)到正常水平T+D組高于T組，兩組相比，差異有顯著性(P<0.05)。

2.2 口服葡萄糖耐量試驗(yàn)

給予高脂飼料及腹腔注射STZ制備2型糖尿病模型并21 d慢性束縛刺激后，T組和T+D組糖耐量明顯受損，在0、30、60、120、180 min各組大鼠血糖均升高，與N組比較差異有顯著性(P<0.01)，T+D組與T組大鼠在180 min沒有恢復(fù)到正常水平，兩組相比，差異有顯著性(P<0.01，圖2，見彩圖頁Ⅲ)，且T組和T+D組的空腹血糖高于7 mmol/L、2 h的血糖水平高于11.1 mmol/L，3 h還未恢復(fù)正常。

2.3 血清5-HT和DA

血清中5-羥色胺，與N組比較，T組和T+D組差異無顯著性，T組和T+D組兩組相比，差異有顯著性(P<0.01)；血清中多巴胺，T組和T+D組差異無顯著性，T組和T+D組兩組相比，差異無顯著性。

Tab. 1 5-hydroxytryptamine and Dopamine(±s, n=8)

5-HT： 5-hydroxytryptamine； DA: Dopamine； N： Normal group； T： T2DM group； T+D: T2DM with depression group; T2DM: Type 2 diatebetes mellitus

**P<0.01vsT

2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)行為學(xué)

給予高脂飼料及腹腔注射STZ制備2型糖尿病模型并21 d慢性束縛刺激后，T組和T+D組的最大移動(dòng)距離均減少，T組與N組比較差異無顯著性，T+D組與N組比較差異有顯著性(P<0.01)，T組與T+D組比較差異無顯著性；T+D組于中央?yún)^(qū)的滯留時(shí)間減少，與N組相比差異有顯著性(P<0.05)，T組與T+D組相比差異有顯著性(P<0.05)；T組與T+D組于中央?yún)^(qū)的滯留次數(shù)沒有減少，與N組相比差異無顯著性，T組與T+D組相比差異無顯著性。

GroupMaxmovementdistance(cm)Zonedefinition(s)ZonefrequencyN11.688±0.87918.033±11.3821.375±0.518T9.305±3.15619.765±8.1481.375±1.061T+D6.061±2.273**7.409±6.499*#1.125±0.354

N： Normal group； T： T2DM group； T+D: T2DM with depression group; T2DM: Type 2 diabetes mellitus

*P<0.05，**P<0.01vsN；#P<0.05vsT

3 討論

糖尿病作為一種終身疾病，需要患者長期服用降糖藥物或者長期注射胰島素等措施緩解病情。目前為止尚且沒有治愈的方法，糖尿病患者需要定期檢測(cè)血糖并有并發(fā)癥的發(fā)生，且長期服藥會(huì)產(chǎn)生心理壓力，這些都使患者產(chǎn)生焦慮抑郁情緒，產(chǎn)生嚴(yán)重的心理負(fù)擔(dān)，2004年中國糖尿病防治指南表明糖尿病心理障礙是糖尿病的14種常見并發(fā)癥之一[15]。有研究顯示糖尿病合并抑郁癥時(shí)，患者的抑郁癥狀和認(rèn)知功能損害均比單獨(dú)患抑郁癥者更為嚴(yán)重[16]，抑郁癥全面影響患者的日常生活，影響患者的飲食、運(yùn)動(dòng)、睡眠、血糖監(jiān)測(cè)，降低患者治療的依從性。因此用動(dòng)物模型進(jìn)行2型糖尿病合并抑郁癥的研究，能很好的研究2型糖尿病合并抑郁癥的發(fā)病機(jī)理。

本研究綜合運(yùn)用高脂飼料喂養(yǎng)加腹腔注射STZ，并在其基礎(chǔ)上采用21 d慢性束縛的方法造成大鼠的抑郁狀態(tài)，從而建立2型糖尿病合并抑郁癥大鼠模型。在胰島素耐受試驗(yàn)中，2型糖尿病合并抑郁癥大鼠在注射胰島素后血糖水平降低，在注射180 min后仍然沒有恢復(fù)正常水平，而正常組大鼠恢復(fù)到正常水平，表明糖尿病大鼠的胰島功能降低。在口服葡萄糖耐受試驗(yàn)中，2型糖尿病組和2型糖尿病合并抑郁癥組的糖耐量嚴(yán)重受損，且空腹血糖高于7 mmol/L，120 min的血糖水平高于11.1 mmol/L，180 min還未恢復(fù)，符合T2DM的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[17]。2型糖尿病合并抑郁癥大鼠血清中5-HT水平降低，與正常組相比有明顯差異，而5-HT是一種能產(chǎn)生愉悅情緒的信使，能調(diào)節(jié)情緒、精力、記憶力，5-羥色胺水平較低的人群更易發(fā)生抑郁、沖動(dòng)行為、自殺及暴力行為[18]。而多巴胺主要負(fù)責(zé)大腦的情欲、感覺，將興奮及開心的信息傳遞，也與上癮有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中2型糖尿病合并抑郁癥大鼠的多巴胺水平降低，本實(shí)驗(yàn)通過21 d慢性束縛的方法，導(dǎo)致糖尿病大鼠的神經(jīng)遞質(zhì)水平發(fā)生改變。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)可以評(píng)定大鼠在新異環(huán)境中的啟動(dòng)、探究行為和對(duì)新環(huán)境的警覺性，最大移動(dòng)距離初步評(píng)價(jià)大鼠的自發(fā)活動(dòng)度。本實(shí)驗(yàn)中2型糖尿病合并抑郁癥模型大鼠的最大移動(dòng)距離明顯小于正常大鼠和2型糖尿病大鼠，表明2型糖尿病合并抑郁癥模型大鼠的自發(fā)活動(dòng)度減小[19，20]，2型糖尿病合并抑郁癥大鼠中央?yún)^(qū)的滯留時(shí)間和次數(shù)減少，反應(yīng)大鼠的焦慮和抑郁情況，說明21 d慢性束縛應(yīng)激抑郁模型建立成功。這同臨床上2型糖尿病合并抑郁癥患者不思飲食、體重下降、血糖監(jiān)控較差，胰島功能降低、認(rèn)知功能障礙、情緒低落，活動(dòng)減少、治療依從性低，在一定程度上有一致性。因此提示成功復(fù)制2型糖尿病合并抑郁癥大鼠模型，有利于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。提示抑郁癥患者在降糖治療和改善認(rèn)知治療的同時(shí)合并抗抑郁治療[21],可以改善患者的精神狀況。

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*【基金項(xiàng)目】衛(wèi)生部科學(xué)研究基金—浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生重大科技項(xiàng)目(WKJ 2009-2030)；全軍醫(yī)藥衛(wèi)生科研項(xiàng)目(08MA059) 【收稿日期】2014-08-29 【修回日期】2014-10-27

△【通訊作者】Tel： 0577-86689817； E-mail： wwt@wzmc.edu.cn

Establishment and evaluation of a rat model of type 2 diabetes associated with depression

LI Na1, LIU Qun1, LI Xiao-juan1, BAI Xiao-hui1, LIU Yue-yun1, JIN Zhong-ye1,JING Yu-xia1,2, YAN Zhi-yi1, CHEN Jia-xu1△

(1. School of Basic Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029; 2. College of Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumchi 830054, China)

Objective: To establish and evaluate a rat model of type 2 diabetes mellitus (T2DM) associated with depression for further elaborating the disease. Methods: Twenty-four Wistar rats were randomly divided into three groups: normal group (group N), T2DM group (group T) and T2DM with depression group (group T+D), with 8 rats in each group. The T2DM rat model was induced by high fat diet and low dose of Streptozotocin (STZ) injection, and in addition, the T2DM rats were made restraint stress for 21 days. After the model was established, the insulin tolerance test (ITT) and oral glucose tolerance test (OGTT) were performed. Then the rat depression level was analyzed by open field test, and the concentration of 5-hydroxytryptamine (5-HT) and dopamine (DA)was determined by ELISA to confirm the model identity. Results: The blood glucose level in group T and group T+D didn’t return to the normal level at 180 minutes in the ITT and OGTT test；Compared with the group N, the max movement distance, retaining time in the central zone and the retaining frequency within 5 minutes in the group T+D decreased; 5-HT and DA level in the serum of rats in group T+D was reduced. Conclusion: A rat model of type 2 diabetes mellitus associated with depression has been successfully established by high fat diet and injection of low dose streptozotocin in combination with restraint stress for 21 days. This rat model is useful for further relevant studies.

type 2 diabetes mellitus associated with depression; rats model; streptozocin; insulin tolerance test; oral glucose tolerance test; 5-hydroxytryptamine; dopamine; open field test

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81072756)；北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目資助(2011CXTD-07)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81473597)

2014-08-13 【修回日期】2014-10-31

R332

A

1000-6834(2015)01-023-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.008

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