盧舜飛, 汪亮亮, 盧俊婉, 劉丙進, 童應鵬, 程曉東, 葉挺梅△

(1. 麗水學院醫(yī)學院， 浙江麗水 323000; 2. 浙江工業(yè)大學藥學院, 杭州 310014； 3. 同濟大學生命科學與技術(shù)學院， 上海 200092)

?

剎毒草合劑對免疫抑制小鼠免疫功能的影響*

盧舜飛1, 汪亮亮1, 盧俊婉1, 劉丙進1, 童應鵬2, 程曉東3, 葉挺梅1△

(1. 麗水學院醫(yī)學院， 浙江麗水 323000; 2. 浙江工業(yè)大學藥學院, 杭州 310014； 3. 同濟大學生命科學與技術(shù)學院， 上海 200092)

目的：研究剎毒草合劑對免疫抑制小鼠免疫功能的影響。方法：BALB/C小鼠50只隨機分為5組(n=10): 空白組、模型組、剎毒草合劑低、中、高劑量組。除空白對照組外，其余各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg建立免疫抑制模型?？瞻捉M和模型組灌胃生理鹽水，剎毒草合劑低、中、高劑量組每天分別用剎毒草合劑 10、20、40 ml/kg灌胃，連續(xù)給藥15 d后，檢測小鼠外周血白細胞數(shù)和白介素-2(IL-2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)含量；檢測小鼠脾臟指數(shù)、NK細胞活性。 結(jié)果：與模型組比較，剎毒草合劑能顯著增加外周血白細胞數(shù)和IL-2、TNF-α、IFN-γ含量、提高脾臟指數(shù)和NK細胞活性，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：剎毒草合劑可明顯增強環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠的免疫功能。

剎毒草合劑；免疫抑制；免疫功能

腫瘤化療后及HIV感染患者的機體免疫力明顯抑制，近年來研究發(fā)現(xiàn)中藥復方制劑對人體的整體免疫起一定的調(diào)節(jié)作用[1,2]，臨床上常用于免疫低下患者的治療。復方制劑中各藥物間相輔相成，有協(xié)同作用，藥效優(yōu)于單味中藥。剎毒草合劑是本課題組經(jīng)多年臨床研究篩選出的中藥復方，主要由黃芪、黃芩、靈芝、甘草等組成，具有益氣助陽，清熱解毒，活血化瘀等功效。傳統(tǒng)醫(yī)學的扶正療法和現(xiàn)代醫(yī)學的人體免疫功能密切相關，但其內(nèi)在機制尚不明確，本研究通過觀察剎毒草合劑對環(huán)磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影響，探討其免疫調(diào)節(jié)機制，為進一步臨床應用與開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康BALB/C小鼠，SPF級，雌雄各半，體重17～22 g，6～8周齡，由揚州大學實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2012-0004，實驗動物使用許可證：SCXK(浙)2008-0117。

1.2 實驗藥物、主要試劑和儀器

剎毒草合劑，批號：100601，浙江省安福生物科技開發(fā)有限公司提供；環(huán)磷酰胺注射液，批號：090410，浙江省海正藥業(yè)股份有限公司。YAC-1細胞由中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所提供；RPMI 1640 細胞培養(yǎng)液、胎牛血清和Hank's液均購自美國Gibico公司；流式細胞儀溶血劑購自北京曠博生物技術(shù)有限公司；IL-2、TNF-α、IFN-γ ELISA試劑盒均購自美國eBioscience公司。AG285電子天平(瑞士Mettler公司)；MAX190酶標儀(美國分子儀器公司)；Suprafuge 22 型離心機(德國 Heraeus)；XDS-1B倒置顯微鏡(重慶光電儀器公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher)。

1.3 動物分組及給藥方法

SPF級BALB/C小鼠50只，雌雄各半，隨機分為5組(n=10): 空白對照組(Control)、模型組(Model)、剎毒草合劑(SDCM)低、中、高劑量組。除空白對照組小鼠腹腔注射生理鹽水外，其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺40 mg/kg造模，隔日1次，共3次。于造模結(jié)束后次日開始灌胃給藥，給藥劑量按小鼠臨床等效量計算，低、中、高劑量組每日分別給予剎毒草合劑10 ml/kg、20 ml/kg、40 ml/kg，空白對照組和模型組給予同體積生理鹽水，灌胃體積：0.4 ml/10 g，連續(xù)給藥15 d。

1.4 外周血白細胞(WBC)數(shù)測定

于末次給藥24 h后，摘除小鼠眼球采集全血，取20 μl至裝有380 μl 2%冰醋酸的1.5 ml離心管中，倒置顯微鏡計白細胞總數(shù)。

1.5 血清IL-2、TNF-α、IFN-γ測定

于末次給藥24 h后，摘取小鼠眼球采集全血，分離血清，血清IL-2、TNF-α、IFN-γ濃度的測定嚴格按ELISA試劑盒說明書步驟進行。

1.6 脾臟指數(shù)測定

于末次給藥24 h后頸椎脫臼法處死小鼠，稱小鼠體重，無菌取脾并稱濕重，以小鼠脾重/體重(mg/g)計算脾臟指數(shù)。

1.7 NK細胞活性測定(LDH測定法)

于末次給藥24 h后處死小鼠，無菌取脾制備脾細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為2×107cells/ml 作為效應細胞。傳代培養(yǎng)YAC-1細胞(細胞濃度為4×105cells/ml)作為靶細胞。取靶細胞和效應細胞各0.1 ml(效靶比50∶1)，加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各0.1 ml，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%NP40各0.1 ml ；每份標本均設三個復孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，取出后將96孔培養(yǎng)板以1 500 r/min離心5 min，每孔吸取上清0.1 ml置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液0.1 ml，根據(jù)室溫不同反應3～10 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30 μl以終止酶促反應。在酶標儀490 nm處測定光密度值(OD)。NK細胞活性%=[(反應孔OD值-自然釋放孔OD值)/(最大釋放孔OD值-自然釋放孔OD值)]× 100%。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 剎毒草合劑對免疫抑制小鼠外周血WBC數(shù)、脾臟指數(shù)及NK細胞活性的影響

模型組小鼠外周血WBC數(shù)較空白對照組顯著降低(P<0.01)，脾臟指數(shù)和NK細胞活性明顯低于空白對照組(P<0.05)。與模型組比較，剎毒草合劑中、高劑量組能顯著提高免疫抑制小鼠外周血WBC 數(shù)(P<0.01)；各劑量組均能顯著提高免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)(P<0.01)；低劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠NK細胞活性(P<0.05)，中、高劑量組可顯著提高免疫抑制小鼠NK細胞活性(P<0.01，表1)。

GroupDose(ml/kg)WBC(105cells/ml)Spleenindex(mg/g)FunctionofNKcells(%)Control/61．8±15．86．47±0．5960．4±16．2Model/6．2±2．0??5．75±0．56?40．7±18．9?SDCM107．6±2．88．43±1．68##67．3±20．9#SDCM2010．0±2．8##10．35±1．90##72．5±22．0##SDCM4012．0±3．9##11．63±2．85##80．3±18．7##

SDCM: Shadu Cao Mixture

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.2 剎毒草合劑對免疫抑制小鼠血清IL-2、TNF-α、IFN-γ的影響

模型組小鼠血清IL-2、TNF-α及IFN-γ明顯低于空白組(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，剎毒草合劑低、中、高劑量組顯著提高免疫抑制小鼠血清IL-2(P<0.01)；低劑量組小鼠血清TNF-α及IFN-γ較模型組有所提高但無統(tǒng)計學意義，中、高劑量組血清TNF-α及IFN-γ顯著高于模型組(P<0.01，表2)。

GroupDose(ml/kg)IL?2(pg/ml)TNF?α(pg/ml)IFN?γ(pg/ml)Control/112．65±3．8823．06±3．4846．23±5．31Model/104．01±7．51??19．59±1．44?40．69±3．48?SDCM10117．61±6．17##20．31±1．6043．31±4．35SDCM20117．16±4．77##22．57±2．46##49．72±5．24##SDCM40127．01±13．60##36．74±7．23##58．37±6．19##

SDCM: Shadu Cao Mixture

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

3 討論

HIV感染、腫瘤等疾病的發(fā)生及發(fā)展與機體免疫功能密切相關[3]。中醫(yī)認為人體免疫功能即正氣，是機體抗御外邪及防治疾病的基本物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理學研究表明中藥對調(diào)節(jié)機體免疫力有重要的作用[4-6]，通過增強機體的免疫功能而發(fā)揮抗病毒、抗腫瘤作用。剎毒草合劑是在傳統(tǒng)醫(yī)學“扶正祛邪、調(diào)整陰陽”理論的指導下篩選出的用于輔助治療艾滋病、腫瘤化療后等免疫功能低下患者的中藥復方制劑，具有益氣助陽、清熱解毒、活血化瘀等功效，可調(diào)節(jié)機體陽氣虛弱、熱毒瘀阻、神疲乏力、少氣懶言等癥，通過扶正治療起到免疫增強作用。環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠是研究藥物免疫調(diào)節(jié)作用較為理想的動物模型[7]。本研究探討剎毒草合劑對環(huán)磷酰胺致免疫抑制模型小鼠免疫功能的影響。

外周血WBC是機體重要的免疫細胞，脾臟是淋巴細胞居留、增殖和產(chǎn)生免疫效應的物質(zhì)基礎，在機體免疫防御中有重要作用。脾臟指數(shù)高低能反應機體的非特異性免疫力，是衡量機體免疫功能的初步觀察指標[8]。本研究發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺造模后小鼠的WBC數(shù)、脾臟指數(shù)顯著低于空白組，在給予不同劑量剎毒草合劑治療后顯著提高免疫抑制小鼠WBC數(shù)、脾臟指數(shù)，呈一定的劑量相關性。說明剎毒草合劑對免疫低下小鼠白細胞功能、脾臟功能有一定的保護和恢復作用，通過增強非特異性免疫提高環(huán)磷酰胺誘導免疫抑制小鼠的免疫功能。

NK 細胞是具有免疫調(diào)節(jié)作用的機體天然免疫細胞，是構(gòu)成機體第一道免疫防線的自然殺傷細胞[9]?；罨腘K細胞可合成和分泌細胞因子，具有抗腫瘤、抗感染和發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[10,11]。本研究結(jié)果表明，剎毒草合劑各劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠NK細胞活性，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。提示剎毒草合劑可通過增強細胞免疫提高環(huán)磷酰胺誘導免疫抑制小鼠的免疫功能。

細胞因子通過多種途徑參與免疫調(diào)節(jié)作用。IL-2的產(chǎn)生作為細胞免疫效應的主要指標[12]，IL-2主要由CD4+CD8+T細胞分泌產(chǎn)生，能激活多種免疫細胞，促進抗體和細胞因子產(chǎn)生[13,14]，可增強T細胞殺傷活性并誘導其分泌TNF、IFN-γ、CSF等細胞因子。IL-2促進B 細胞的免疫應答以及NK 細胞、單核巨噬細胞的增生而增強抗腫瘤、抗病毒作用[15,16]。本研究結(jié)果顯示，剎毒草合劑各劑量組可顯著提高免疫抑制小鼠血清IL-2濃度，這與本研究結(jié)果NK細胞的活性增強密切相關； TNF-α是主要由單核-巨噬細胞分泌的、具有多種生物學活性的另一種重要細胞因子。TNF-α可通過TNFR誘導腫瘤細胞的凋亡，在抗腫瘤免疫反應中發(fā)揮重要作用。另外，TNF-α可激活 T 細胞，促進 B 細胞產(chǎn)生抗體、單核細胞等產(chǎn)生細胞因子、白細胞殺傷病原微生物等功能[17]。IFN-γ是在免疫應答中發(fā)揮重要作用的細胞因子。主要由活化的Th1細胞和NK細胞所產(chǎn)生，并通過增強Th1細胞活性而提高細胞免疫功能，可誘導MHC-I/II各種分子的表達，促進中性粒細胞、單核巨噬細胞的吞噬功能，增強NK細胞作用，刺激合成血管內(nèi)皮細胞粘附分子等。本研究結(jié)果顯示剎毒草合劑中、高劑量組可顯著提高免疫抑制小鼠血清TNF-α及IFN-γ濃度，并呈劑量依賴性。提示剎毒草合劑可通過提高環(huán)磷酰胺誘導免疫抑制小鼠血清IL-2、TNF-α及IFN-γ的濃度而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，剎毒草合劑可恢復或增強環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫功能，該研究為其在抗腫瘤、HIV感染的臨床應用提供了實驗依據(jù)，其深入的分子機制還有待進一步研究。

[1] Yu Q, Nie SP, Wang JQ,etal. Chemoprotective effects of Ganoderma atrum polysaccharide in cyclophosphamide-induced mice[J].IntJBiolMacromol, 2014, 64: 395-401.

[2] 李斐斐, 吳 皓, 陳 璐, 等. 益肺清化顆粒對 Lewis 肺癌小鼠 VEGF、bFGF Angiostatin Endostatin 影響的研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2013, 33(8): 1086-1092.

[3] Orange JS, Roy-Ghanta S, Mace EM,etal. IL-2 induces a WAVE2-dependent pathway for actin reorganization that enables WASp-independent human NK cell function[J].JClinInvest, 2011, 121(4): 1536-1548.

[4] Lee J, Lim KT. SJSZ glycoprotein (38 kDa) modulates expression of IL-2, IL-12, and IFN-γ in cyclophosphamide-induced Balb/c[J].InflammRes, 2012, 61(12): 1319-1328.

[5] 李 樂, 張益靈, 陶厚權(quán). 貫葉連翹提取物對小鼠免疫性心肌炎的作用[J]. 中國應用生理學雜志, 2013, 29(4): 336-338.

[6] 王先麗, 陳龍菊. 富硒板黨對老齡大鼠免疫功能的影響及其機制[J]. 中國應用生理學雜志, 2014, 30(5): 401-404.

[7] Aboul-Fotoh Lel-M, Abdel Raheem MM, EI-Deen MA,etal. Role of CD4+CD25+T cells in children with idiopathic thrombocytopenic purpura[J].JPediatrHematolOncol, 2011, 33(2): 81-85．

[8] 劉 艷, 鄭小林. 白藜蘆醇對耐力訓練小鼠免疫功能的影響[J]. 中國應用生理學雜志, 2010, 26(3): 321-323.

[9] Brunetta E, Hudspeth KL, Mavilio D. Pathologic natural killer cell subset redistribution in HIV-1 infection: new insights in pathophysiology and clinical outcomes[J].JLeukocBiol, 2010, 88(6): 1119-1130.

[10]Miller SC, Pandi-perumal PS, Esquifino AI,etal. The role of melatonin in immuno-enhancement: potential application in cancer[J].IntJExpPathol, 2006, 87(2): 81-87.

[11]Alter G, Altfeld M. NK cells in HIV-1 infection: evidence for their role in the control of HIV-1 infection [J].JInternMed, 2009, 265(1): 29-42.

[12]Camisaschi C, Filipazzi P, Tazzari M,etal. Effects of cyclophosphamide and IL-2 on regulatory CD4+T cell frequency and function in melanoma patients vaccinated with HLA-class I peptides: impact on the antigen-specific T cell response[J].CancerImmunolImmunother, 2013, 62(5): 897-908.

[13]Smith AJ, Humphries SE. Cytokine and cytokine receptor gene polymorphisms and their functionality[J].CytokineGrowthFactorRev, 2009, 20(1): 43-59.

[14]Mostbock S, Lutsiak ME, Milenic DE,etal.IL-2/anti-IL-2 antibody complex enhances vaccine-mediated antigen-specific CD8+T cell responses and increases the ratio of effector/memory CD8+ T cell to regulatory T cell[J].JImmunol, 2008, 180(7): 5118-5129.

[15]Kim JW, Ferris RL, Whiteside TL. Chemokine C receptor expression and protection of circulating CD8+T lymphocytes from apoptosis[J].ClinCancerRes, 2005, 11(21): 7901-7910.

[16]Barbai VH, Ujhelyi E, Szlavik J,etal. Changes in the levels of some acute-phase proteins in human immunodeficiency virus-l infected patients, following interleukin-2 treatment [J].ClinExpImmunol, 2010, 161(1): 134-141.

[17]Sharma B, Altman JK, Goussetis DJ,etal. Protein kinase R as mediator of the effects of interferon(INF)γ and tumor necrosis factor(TNF) α on normal and dysplastic hematopoiesis[J].JBiolChem, 2011, 286(31): 27506-27514.

The effects of Shadu Cao Mixture on immune functions of immunosuppression mice

LU Shun-fei1, WANG Liang-liang1, LU Jun-wan1, LIU Bing-jin1, TONG Ying-peng2， CHENG Xiao-dong3， YE Ting-mei1△

(1. College of Medicine, Lishui University, Lishui 323000; 2.College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014; 3.School of Life Sciences and Technology, Tongji University， Shanghai 200092, China)

Objective: To investigate the effects of Shadu Cao Mixture(SDCM, traditional Chinese medicine) on immune functions of immunosuppression mice. Methods: Fifty BALB/C mice were randomly divided into blank control group, model group, SDCM low-dose, middle-dose and high-dose group. Except the blank control group, other groups were intraperitoneal injected with cyclophosphamide (40 mg/kg) to establish immunosuppression mice model. The blank control group and model group

gavage administration with normal saline, while the other groups received gavage administration with different doses of SDCM (10, 20, 40 ml/kg for 15 days) respectively. The number of leukocytes and serum levels of interleukin-2(IL-2), tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interferon-γ(IFN-γ) in peripheral blood, spleen index, and the function of NK cells were measured. Results: Compared with the model group , SDCM increased the number of leukocytes and serum concentrations of IL-2,TNF-α and IFN-γ in peripheral blood and improved the spleen index and the function of NK cells significantly (P<0.05～0.01). Conclusion: SDCM could remarkably enhance the immune functions of immunosuppression mice induced by cyclophosphamide.

Shadu Cao Mixture(traditional Chinese medicine); immunosuppression; immune function

浙江省自然科學基金項目(LQ12H29001);浙江省自然科學基金項目(LQ14H290001);浙江省科技廳重大科技專項社會發(fā)展項目(2011C03002)

2014-10-20

2015-02-12

R285.5

A

1000-6834(2015)03-266-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.019

△【通訊作者】Tel: 0578-2680382, E-mail: lsxylu@163.com