趙永才

(唐山師范學(xué)院體育系， 河北 唐山 063000)

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運動訓(xùn)練對小鼠心肌線粒體miR-499-CaN-Drp-1凋亡通路的影響*

趙永才△

(唐山師范學(xué)院體育系， 河北 唐山 063000)

目的：本文考察游泳訓(xùn)練對小鼠心肌miR-499和相關(guān)蛋白的影響，探討運動干預(yù)心肌凋亡的機(jī)制。方法：雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組(n=14)：安靜組(SE組)、運動訓(xùn)練1組(ET1組)、運動訓(xùn)練2組(ET2)。SE組不運動，ET1組進(jìn)行8周游泳訓(xùn)練；ET2組在ET1組負(fù)荷基礎(chǔ)上增加，前5周與ET1相同，后3周每天2次。TUNEL檢測心肌凋亡，RT-PCR和Western blot測定miR-499和蛋白。結(jié)果：相比SE組，ET1組心肌凋亡指數(shù)(AI)、miR-499、CaN蛋白表達(dá)及活性、Drp-1表達(dá)均無顯著性改變(P>0.05)；相比SE組，ET2 組AI顯著性下降(P<0.01)，miR-499表達(dá)顯著性升高(P<0.05)，Drp-1蛋白表達(dá)顯著性下降(P<0.01)，但CaN蛋白表達(dá)及活性無顯著改變(P>0.05)。結(jié)論：游泳訓(xùn)練能降低心肌凋亡水平，Drp-1表達(dá)下降是凋亡率下降的部分機(jī)制，但本研究上游CaN不參與運動調(diào)節(jié)心肌凋亡的信號。

運動；心??；線粒體；微小RNA；凋亡；小鼠

細(xì)胞凋亡是由基因控制細(xì)胞主動性死亡過程，伴隨DNA早期降解、染色質(zhì)濃縮、細(xì)胞碎裂。盡管心肌細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，但凋亡在心肌細(xì)胞同樣發(fā)生。近年研究表明，心肌細(xì)胞雖存在一定水平的增殖能力[1]，但這種低水平的增殖并不能有效補(bǔ)償心肌的凋亡流失，因此病理生理因素引發(fā)的高水平凋亡在心臟病理、生理發(fā)展過程中起到重要作用，也是各類心肌病，如心梗、病理性肥大等由代償性向病理性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[2]。目前認(rèn)為線粒體是調(diào)節(jié)內(nèi)源性心肌凋亡的關(guān)鍵細(xì)胞器，心肌線粒體處于分裂、融合動態(tài)過程中，線粒體過多分裂是內(nèi)源性凋亡通路必要途徑，促進(jìn)細(xì)胞色素c釋放和Caspase蛋白激活，動力相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein-1, Drp-1)是引發(fā)線粒體分裂的一種關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)含量和修飾水平在心肌線粒體分裂和促凋亡過程中起重要作用[3]。目前發(fā)現(xiàn)心肌上游microRNA-499(miR-499)直接以鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin, CaN)為靶目標(biāo)，抑制CaN表達(dá)，而CaN對Drp-1的去磷酸化作用是促進(jìn)Drp-1線粒體膜定位，加強(qiáng)心肌線粒體分裂，引發(fā)凋亡產(chǎn)生的機(jī)制之一，即心肌miR-499可通過抑制CaN來控制Drp-1分裂線粒體，對抗心肌凋亡[4]。心肌線粒體凋亡途徑存在miR-499-CaN-Drp-1調(diào)節(jié)通路，運動對此通路有何影響還不知曉，本文考察游泳運動對miR-499-CaN-Drp-1信號通路的影響，探討運動干預(yù)心肌凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

雄性C57BL/6小鼠，8周齡，平均體重為(17.0±1.8)g，北京維通利華實驗動物公司提供。本研究動物在運動生理實驗室動物房常規(guī)飼養(yǎng)，小鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，標(biāo)準(zhǔn)普通飼料喂養(yǎng)，晝夜節(jié)律人工光照控制，每天光照12 h。自由飲食和飲水，分籠飼養(yǎng)。隨機(jī)分為3組(n=14)：安靜組(sedentary group, SE)、訓(xùn)練組1 (exercise training group 1, ET1)、訓(xùn)練組2 (exercise training group 2, ET2)，各組小鼠運動訓(xùn)練前體重?zé)o顯著性差異。

1.2 運動訓(xùn)練安排

小鼠先適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，學(xué)習(xí)游泳運動，適應(yīng)游泳環(huán)境。正式訓(xùn)練開始后，SE組不做運動；ET1組進(jìn)行8周遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練，5天/周，每天訓(xùn)練1次，第1周每次時間安排為30 min，以后每周增加10 min，第7和第8周游泳時間維持在90 min；ET2組進(jìn)行8周訓(xùn)練，5天/周，前5周和ET1組訓(xùn)練模式相同，后3周每次游泳時間和ET1組也一樣，但每天訓(xùn)練2次，時間間隔至少6 h。

1.3 樣本處理

最后一次訓(xùn)練結(jié)束24 h后，所有小鼠提取心肌，每組隨機(jī)選取7樣本用于TUNEL檢測，多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片6張，厚度4 μm備用，剩余部分樣本研磨離心，測定CaN活性；每組剩余7樣本心肌漂洗后液氮速凍，-80℃低溫保存，用于RT-PCR和Western blot檢測。

1.4 TUNEL凋亡檢測方法

按照試劑盒說明操作(Cat.No. G7130, Promega)。組織切片進(jìn)行二甲苯常規(guī)脫蠟2次，梯度濃度酒精水化處理，0.85%濃度NaCl沖洗5 min，PBS 沖洗每次5 min，4%濃度多聚甲醛固定15 min，PBS 沖洗兩次，每次5 min，20 μg/ml蛋白酶k室溫孵育30 min，PBS 沖洗兩次，每次5 min，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 沖洗兩次，每次5 min，Equilibration Buffer 室溫平衡10 min，rTdT反應(yīng)液37℃孵育60 min，2×SSC溶液洗滌15 min。PBS沖洗，3% H2O2室溫封閉10 min，PBS沖洗，Streptavidin HRP (1∶500 PBS稀釋)，室溫孵育30 min，PBS沖洗兩次，DAB顯色，室溫顯色，控制顯色時間，終止反應(yīng)后蘇木精復(fù)染核5 min，常規(guī)梯度酒精脫水，封片。對切片隨機(jī)5個視野進(jìn)行觀察，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性細(xì)胞核根據(jù)凋亡程度不同呈現(xiàn)棕色或棕褐色，統(tǒng)計凋亡細(xì)胞和正常細(xì)胞的數(shù)量，陽性細(xì)胞與總細(xì)胞比值計算凋亡指數(shù)(apoptotic index, AI)。

1.5 miR-499檢測

1.5.1 引物設(shè)計及miRs逆轉(zhuǎn)錄 RT-PCR技術(shù)測定心肌miR-499，利用Primer 5.0引物設(shè)計軟件根據(jù)miR-499和內(nèi)參的序列設(shè)計反轉(zhuǎn)錄引物及擴(kuò)增引物，以U6作為內(nèi)參，引物序列具體見表1。按照RNA提取試劑盒要求操作(Invitrogen公司)提取心肌總RNA，并檢測RNA質(zhì)量，OD260/OD280>1.8，符合RNA檢測要求，取100 ng RNA利用miRs-Stem-Loop反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行cDNA的合成。

1.5.2 RT-PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)過程包括以下試劑：Power SYBR Green PCR Master Mix 10 μl(內(nèi)含DNA聚合酶、Buffer、dNTP、SYBR Green)，miRs cDNA 1 μl，miRs通用下游引物(10 μmol/L) 0.5 μl，miRs特異性上游引物(10 μmol/L) 0.5 μl，Nuclease-Free Water 8 μl，總反應(yīng)體積20 μl，進(jìn)行40個反應(yīng)循環(huán)，反應(yīng)條件：95℃變性10 min；95℃15 s；60℃1 min。使用7900HT Fast熒光定量PCR儀(ABI公司)，系統(tǒng)自動獲取指標(biāo)有：檢測樣品CT值、△CT值和融解曲線。miR-499表達(dá)水平采用2-ΔΔCT公式計算，CT代表PCR反應(yīng)檢測到的熒光強(qiáng)度值顯著大于背景值的循環(huán)數(shù)，△CT代表樣品Ct值減去同一樣品內(nèi)參基因(U6)Ct值得到的差值，ΔΔCT代表上述實驗樣品△Ct值減去對照樣品△Ct的差值。

Tab. 1 The primers of miR-499 and U6

1.6 Western blot檢測蛋白

從肌組織提取蛋白，樣品與RIPA buffer(碧云天生物公司)混合，在冰上培養(yǎng)20 min，12 000×g離心20 min。蛋白樣品上樣，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為8%，120 V電泳50 min。電泳結(jié)束后將包含目的蛋白在內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(Millipore)，然后將PVDF 膜浸入5% 脫脂奶粉中封閉2 h。4℃一抗孵育過夜，CaNA抗體1∶1 000 稀釋(Santa Cruz: sc-9070)，Drp-1抗體1∶1 000 稀釋(CST: 8570S)，GAPDH抗體1∶10 000稀釋(康成生物)，洗膜完后過氧化物酶標(biāo)記二抗，37℃環(huán)境孵育60 min。ECL試劑(碧云天生物公司)作用于PVDF膜上，然后于暗室中顯影并定影，使用凝膠成像系統(tǒng)半定量分析灰度值確定目的蛋白表達(dá)的相對量。對所得灰度比值進(jìn)行轉(zhuǎn)化，以SE組均值為1，觀察另兩組的表達(dá)。

1.7 心肌組織CaN活性檢測

比色法測定心肌組織CaN活性，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行(南京建成生物工程研究所)，心肌組織制成5%的組織勻漿，取上清液，進(jìn)行酶促反應(yīng)，再進(jìn)行定磷操作，然后加穩(wěn)定劑，混合液室溫靜置5 min，分光光度計測定標(biāo)準(zhǔn)管、測定管及空白對照管吸光度值，計算CaN活性，同時測定總蛋白濃度進(jìn)行校正。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 TUNEL凋亡檢測結(jié)果

研究發(fā)現(xiàn)ET1組訓(xùn)練后心肌細(xì)胞AI (2.41±0.56)%與SE組AI (2.26±0.55)%比較無顯著性差異(P>0.05)；而ET2組訓(xùn)練后心肌細(xì)胞AI (1.45±0.39)%非常顯著地低于ET1組和SE組(P<0.01)，結(jié)果顯示ET2組訓(xùn)練負(fù)荷能顯著降低細(xì)胞凋亡水平(圖1)。

Fig. 1 Effects of swimming training on myocardial apoptosis demonstrated by TUNEL assay. Representative images of myocardium sections in SE (A), ET1 (B) and ET2 (C). Apoptotic index evaluated by TUNEL assay (D) SE: Sedentary group; ET1: Exercise training group 1; ET2: Exercise training group 2**P<0.01vsSE;##P<0.01vsET1

2.2 運動訓(xùn)練后心肌miR-499表達(dá)結(jié)果

總RNA提取后電泳正常，miR-499 PCR反應(yīng)溶解曲線呈一個波峰，屬于特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線也正常，引物設(shè)計和操作均符合要求(圖2)。兩個運動組miR-499表達(dá)變化不同，相比SE組，ET1組miR-499表達(dá)有提高趨勢，但無顯著差異，而ET2組提高幅度較大，顯著高于SE組 (P<0.05, 表2)。

Fig. 2 miR-499 RT-PCR process and Gel electrophoresis image A： Electropherogram of Total RNA; B： Representative image of RT-PCR

GroupCaNactivitymiR?499expressionSE0．42±0．111．22±0．12ET10．49±0．181．27±0．45ET20．55±0．211．65±0．31?

Unit of measurement of CaN activity is umolPi/(mg prot·hour)

SE: Sedentary group; ET1: Exercise training group 1; ET2: Exercise training group 2

*P<0.05vsSE

2.3 運動訓(xùn)練后心肌CaN、Drp-1蛋白表達(dá)及活性變化

結(jié)果顯示CaN蛋白總體變化不顯著，相比SE組，ET1組下降9%，但ET2卻上升11%，但都不具有統(tǒng)計意義；而Drp-1表達(dá)變化均下降，相比SE組，ET1組下降幅度為17%，但無顯著性，ET2下降了36% ，具有非常顯著性差異(P<0.01，圖3)；另外對CaN活性進(jìn)行檢測， ET1、ET2組CaN活性呈升高趨勢，但相比SE組均無顯著性差異(表2)。

Fig. 3 Effects of swimming training on levels of CaN and Drp-1 proteins(n=7) A: Comparison of CaN levels; B: Comparison of Drp-1 levels; C: Representative blots of proteins**P<0.01vsSE

3 討論

運動生理學(xué)領(lǐng)域多考察運動訓(xùn)練對心肌的保護(hù)效應(yīng)，例如發(fā)現(xiàn)運動訓(xùn)練后的大鼠在一次急性運動后心肌的丙二醛相對更少，谷胱甘肽更多，認(rèn)為運動訓(xùn)練可以延長大鼠一次運動時間，推遲疲勞的發(fā)生[5]。關(guān)于運動與心肌凋亡關(guān)系的研究相對較少，而且現(xiàn)有相關(guān)研究著重考察Bcl-2家族蛋白對各類運動的適應(yīng)，間接評價運動和心肌凋亡的關(guān)系。有研究[6]認(rèn)為高脂膳食導(dǎo)致大鼠心肌正常形態(tài)喪失，心肌細(xì)胞凋亡增加，但茶多酚補(bǔ)充和耐力訓(xùn)練分別可降低Bax/Bcl-2比值，認(rèn)為運動訓(xùn)練有改善心臟損傷的效應(yīng)，但此類研究缺乏凋亡指數(shù)檢測。本研究首先考察心肌凋亡指數(shù)(AI)的變化，發(fā)現(xiàn)ET1組AI無顯著性變化(P>0.05)，而ET2組AI明顯下降(P<0.05)，表明ET1組訓(xùn)練強(qiáng)度可能相對較小，不能對心肌凋亡產(chǎn)生干預(yù)，ET2組訓(xùn)練負(fù)荷使凋亡指數(shù)顯著下降，對心肌凋亡有抑制作用，ET2組訓(xùn)練負(fù)荷能產(chǎn)生良好心肌保護(hù)效應(yīng)。

檢索關(guān)于心肌凋亡指數(shù)與運動關(guān)系的研究，有研究[7]安排肥胖大鼠進(jìn)行8周中等強(qiáng)度游泳訓(xùn)練，TUNEL凋亡檢測發(fā)現(xiàn)肥胖游泳組心肌凋亡細(xì)胞顯著減少，而且肥胖抵抗組大鼠也存在這樣的規(guī)律，認(rèn)為適量運動訓(xùn)練可以降低心肌凋亡水平。黃志輝[8]等人的研究發(fā)現(xiàn)游泳訓(xùn)練能夠降低老年大鼠心肌的凋亡指數(shù)。本研究針對小鼠的研究也發(fā)現(xiàn)同樣現(xiàn)象，總體可認(rèn)為適量運動訓(xùn)練能降低心肌凋亡。

miRs是一類約22nt長的非編碼RNA，與mRNA進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合促進(jìn)其降解或抑制蛋白質(zhì)合成，對靶基因形成轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)肌球蛋白重鏈(MHC)基因內(nèi)含子能夠轉(zhuǎn)錄合成特定miRs，α-MHC(Myh6)內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄miR-208a，β-MHC(Myh7)內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄合成miRNA-208b，而miR-499由第三種肌球蛋白重鏈Myh7b內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄。研究[4]發(fā)現(xiàn)心肌miR-499直接以CaN為靶目標(biāo)，無論是α-催化亞基(CaNA-α) 還是β-催化亞基(CaNA-β)，miR-499都可與其mRNA結(jié)合，翻譯受抑。缺氧等刺激可誘導(dǎo)CaNA表達(dá)增加，促進(jìn)心肌凋亡的產(chǎn)生，如果升高miR-499表達(dá)，CaNA表達(dá)顯著下降，心肌凋亡減少。CaNA促進(jìn)凋亡與其促進(jìn)心肌胞漿Drp-1去磷酸化有關(guān)，降低CaNA含量，Drp-1去磷酸化水平下降，細(xì)胞凋亡減少。Drp-1近年是研究熱點，Drp-1去磷酸化后可在線粒體膜與Bax集合定位，促進(jìn)線粒體膜破裂，易引發(fā)Caspase激活和細(xì)胞色素c釋放[9]。

本研究發(fā)現(xiàn)ET2游泳負(fù)荷顯著提高了miR-499表達(dá)(P<0.05)，說明生理狀態(tài)下，游泳訓(xùn)練能使心肌miR-499產(chǎn)生適應(yīng)性升高。miR-499表達(dá)升高能夠?qū)ο掠伟谢虍a(chǎn)生轉(zhuǎn)錄后抑制，但檢測發(fā)現(xiàn)ET1組和ET2組CaNA表達(dá)分別呈現(xiàn)下降和升高趨勢，并無顯著性差異(P>0.05)，并未產(chǎn)生預(yù)期下降的變化。目前認(rèn)為單個miRs可以同時抑制多個靶基因，但同一個靶基因也可被多個miRs抑制[10]，因此CaNA轉(zhuǎn)錄后翻譯可能被多個因素控制，這可能是CaNA變化和miR-499變化不同步的原因，另外還發(fā)現(xiàn)兩組CaNA活性變化也不明顯，表明CaNA對本次運動負(fù)荷不敏感?？疾彀l(fā)現(xiàn)CaNA下游的Drp-1對游泳訓(xùn)練負(fù)荷較敏感，ET1組下降不明顯，但ET2組下降具有顯著性(P<0.01)，表明其對心肌細(xì)胞促線粒體分裂的潛力下降，這和ET2組凋亡指數(shù)顯著下降相符合。本次研究總體上ET1組訓(xùn)練對miR-499、CaNA和Drp-1表達(dá)無顯著影響，而ET2組盡管CaNA無論蛋白表達(dá)或活性均無明顯改變，但miR-499升高和Drp-1明顯下降和凋亡信號抑制是相符合的，這可能是ET2組心肌凋亡降低的機(jī)制之一。

值得關(guān)注的是，Drp-1去磷酸化轉(zhuǎn)位至線粒體外膜，促進(jìn)線粒體分裂后，Drp1 重回胞漿，循環(huán)反復(fù)[4]。Drp-1磷酸化和去磷酸化狀態(tài)在心肌胞漿中都存在，而只有去磷酸化的Drp-1能聚集并剪切外膜，分裂線粒體。本次研究測定的是胞漿總Drp-1，ET2組訓(xùn)練后雖然CaNA變化不顯著，但Drp-1表達(dá)含量下降，其總體去磷酸化儲備潛能是下降的，以后研究可以增加對訓(xùn)練后心肌線粒體膜定位Drp-1的測定，更精確了解其變化規(guī)律。

本研究未發(fā)現(xiàn)CaN對運動產(chǎn)生變化，有研究發(fā)現(xiàn)12周游泳訓(xùn)練使大鼠產(chǎn)生心肌肥大，CaN活性和NFAT轉(zhuǎn)運均無顯著性改變[11]。而Wilkins 等人[12]的運動性心臟肥大模型中，同樣沒有發(fā)現(xiàn)CaN和NFAT的信號改變，但病理性心臟肥大上述信號顯著增強(qiáng)。上述研究認(rèn)為游泳訓(xùn)練不能影響心肌CaN活性，本次研究與其結(jié)果類似，發(fā)現(xiàn)游泳訓(xùn)練對CaN無顯著性影響，Drp-1明顯下降，凋亡發(fā)生率下降，說明本研究中，CaN可能不參與凋亡調(diào)節(jié)。

綜上所述，游泳訓(xùn)練能降低心肌凋亡水平，同時顯著提高miR-499表達(dá)，降低Drp-1表達(dá)，這可能是降低凋亡的分子機(jī)制之一；但本研究中，運動干預(yù)心肌凋亡通路下游Drp-1與上游miR-499和CaN關(guān)系不密切，此運動模式下，CaN可能不參與凋亡調(diào)節(jié)。

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Effects of exercise training on myocardial mitochondrial miR-499-CaN-Drp-1 apoptotic pathway in mice

ZHAO Yong-cai△

(Department of Physical Education, Tangshan Normal University, Tangshan 063000, China)

Objective: To detect the levels of miR-499 and relative proteins in hearts of mice after exercise training, and investigate the mechanism of exercise-regulative apoptosis. Methods: Male C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups(n=14): sedentary (SE), exercise training 1(ET1) and exercise training 2(ET2) group. SE did not do any exercise. ET1 performed swimming training for 8 weeks. ET2 performed the same work as ET1 until the 5th week. Then, mice trained twice a day until the end of training. TUNEL assay was applied to test myocardial apoptosis, RT-PCR and Western blot were used to detect miR-499 and proteins levels respectively. Results: Compared with SE, stress in ET1 failed to affect apoptotic index (AI) and miR-499-CaN-Drp-1 pathway (P>0.05). In contrast, exercise load in ET2 increased miR-499 level, decreased Drp-1 level and AI with statistical significance respectively(P<0.05), but neither CaN expression nor CaN activity was changed significantly(P>0.05). Conclusion: Swimming training can inhibit myocardial apoptosis, and the decrease in Drp-1 may be responsible for the reduced myocardial apoptosis. CaN, the upstream protein, does not participate in exercise-regulative apoptosis.

exercise; myocardium; mitochondria; microRNAs; apoptosis; mice

唐山師范學(xué)院科學(xué)研究基金項目(2013D03)

2014-10-13

2015-02-12

G804.7

A

1000-6834(2015)03-259-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.017

△【通訊作者】Tel： 0315-3863302； E-mail： 1067491223@qq.com