李新娟， 魏林郁， 李超， 李東亮

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學與神經(jīng)生物學教研室， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

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孕酮對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的神經(jīng)保護作用及其機制*

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生理學與神經(jīng)生物學教研室， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

目的：觀察孕酮(PROG)對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷后的神經(jīng)保護作用，并探討其作用機制。方法：120只雄性SD大鼠隨機分為：假手術組、大腦中動脈栓塞(MCAO)組和PROG+MCAO組(n=40)。線栓法建立大鼠右側MCAO模型，PROG+MCAO組于建模型前30 min按8 mg/kg腹腔內注射PROG。大鼠腦缺血2 h再灌注0、24、48、72 h，通過Longa評分標準進行神經(jīng)功能缺陷評分；實時熒光定量聚合酶鏈反應技術檢測大鼠腦組織中雙孔道結構域鉀離子通道3(TASK3)mRNA的表達。結果：PROG(8 mg/kg)可顯著降低大鼠腦缺血2 h再灌注24、48、72 h時的神經(jīng)功能缺陷評分(P<0.05)。與假手術組相比，MCAO組再灌注各時間點腦組織TASK3 mRNA的表達均顯著降低(P<0.05)；與MCAO組相比，PROG + MCAO組再灌注各時間點大鼠腦組織中TASK3 mRNA的表達均顯著增多(P<0.05)。結論：PROG可改善局灶性腦缺血/再灌注損傷后大鼠神經(jīng)功能缺陷癥狀，其作用機制可能與上調腦組織中TASK3 mRNA的表達有關。

孕酮；腦缺血；再灌注損傷；TASK3

缺血性腦血管疾病是導致老年人殘疾最常見的一種疾病，且隨著人口老齡化，其發(fā)病率還有增加的趨勢。因此進一步研究其發(fā)病機制和尋找有效的防治措施已成為神經(jīng)科學研究的熱點。

腦缺血時最初的病理生理改變?yōu)槟X組織氧供給不足和內環(huán)境pH值的迅速下降，而酸敏感的雙孔道結構域鉀離子通道3(two-pore domain K channel 3，TASK3)的功能狀態(tài)可隨著pH值及氧含量的降低受到抑制，甚至變?yōu)殛P閉狀態(tài)[1]，TASK3通道的關閉將導致神經(jīng)元的去極化，引發(fā)神經(jīng)元鉀離子依賴性凋亡[1,2]。

越來越多的研究表明孕酮(progesterone，PROG)具有神經(jīng)保護作用[3]，本課題組前期實驗也證實PROG可對腦缺血大鼠發(fā)揮保護作用[4]。但PROG是否影響大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷(cerebral ischemia/reperfusion injury)過程中TASK3 mRNA的表達目前未見報道，本研究以大腦中動脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)大鼠為研究對象，觀察PROG對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠腦組織中TASK3 mRNA表達的影響，探討其對缺血/再灌注損傷神經(jīng)保護作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 藥品與試劑

PROG購于Sigma公司；RNAiso Plus試劑盒、 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒、SYBRPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒均購于寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 動物分組與給藥方法

SPF級雄性SD大鼠(動物合格證號：SCXK豫2010-0002)，體重(200±20)g，隨機分為假手術組(Sham)、MCAO組和PROG + MCAO組(n=40)，各組按腦缺血/再灌注后不同時間隨機分為再灌注0、24、48、72 h四個亞組(n=10)，PROG+MCAO組于建模型前30 min按8 mg/kg腹腔內注射PROG芝麻油液，假手術組和MCAO組于相同時間注射等容積芝麻油。

1.3 大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型的制備

參考Zea-Longa方法制備大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷模型[5，6]。大腦中動脈栓塞2 h時，固定大鼠，緩慢將栓線拔出10 mm實現(xiàn)血液再灌注，剪斷線栓外露部分。假手術組僅分離頸總動脈、暴露頸內外動脈分叉，造模后保溫常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4 大鼠神經(jīng)功能缺陷評分

參照Longa 5分制評分標準對實驗大鼠進行神經(jīng)功能缺陷評分[7]：0分：無神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺失(不能完全伸展對側前肢)；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺失(向對側轉圈)；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺失(向對側傾倒)；4分：不能自發(fā)行走，意識水平降低。評分為0分或4分的大鼠均為造模失敗大鼠，予以剔除，并隨機補齊每亞組10只大鼠。

1.5 引物的設計

根據(jù)大鼠基因全序列設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，大鼠GAPDH和TASK3的引物序列及片段長度見表1。

1.6 腦組織中RNA的提取

大鼠深度麻醉后處死，迅速斷頭取腦，將100 g腦組織置于玻璃勻漿器中，加入1 ml TRIzol液，在冰浴中將組織研碎，顛倒混勻后，靜置5 min，嚴格按試劑盒說明書逐步進行RNA抽提，以260 nm及280 nm吸光度值計算所獲RNA含量及純度，分裝后 - 80℃保存。

Tab. 1 Primer sequences for Real-time PCR(bp)

1.7 cDNA的制備

等量取上述每個標本總RNA 1 μg，首先去除基因組DNA；取DEPC水處理過的EP管，依次加入gDNA Eraser Buffer(5 ×)2 μl、gDNA Eraser 1 μl、上述各標本總RNA 1 μl(1 μg)，最后加RNase free dH2O 至10 μl；反應條件：42℃ 5 min，4℃?zhèn)溆?。然后進行反轉錄反應：取DEPC水處理過的EP管，依次加入RNase free dH2O 1 μl、 PrimeScript Buffer 2(for real time，×5)4 μl、RT Primer Mix 4 μl、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μl混勻后加入至上述10 μl反應體系的EP管中，反應條件37℃ 15 min，85℃ 5 s，即逆轉錄成cDNA，-20℃保存。

1.8 Real-time PCR檢測大鼠腦組織TASK3 mRNA表達及結果分析

總反應體積20 μl，取DEPC水處理過的EP管，依次加入SYBRPremix Ex TaqTMII(×2)10 μl、TASK3或GAPDH Forward Primer(0.4 μmol/L)0.8 μl、TASK3或GAPDH Reverse Primer(0.4 μmol/L)0.8 μl、cDNA 1 μl(50 ng)，最后加dH2O 至20 μl。在ABI Stepone Plus Real-time PCR儀上進行PCR反應，擴增條件：預變性95℃ 30 s；PCR反應95℃ 3 s，60℃ 30 s，45個循環(huán)。

分別測定每個樣品TASK3 mRNA和GAPDH mRNA的Ct值，每個樣品均做復孔以減少操作誤差。根據(jù)擴增曲線確定Ct值(cycle threshold)，利用2-△△Ct法計算TASK3 mRNA的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 PROG對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺陷評分的影響

局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠在再灌注24 h時神經(jīng)功能缺陷評分最高，而后逐漸降低。與MCAO組再灌注24 h(2.67±0.49)、48 h(2.25±0.57)、72 h(1.86±0.41)相比，PROG+MCAO組再灌注24 h(2.01±0.74)、48 h(1.77±0.42)、72 h(1.34±0.39)可明顯降低大鼠神經(jīng)功能缺陷評分(P<0.05,圖1)。

2.2 MCAO組大鼠腦缺血2 h再灌注后不同時間點腦組織TASK3 mRNA表達的變化

Real-time PCR結果顯示：MCAO組再灌注各時間點GAPDH mRNA擴增曲線無明顯漂移現(xiàn)象，而對應的TASK3 mRNA擴增曲線出現(xiàn)明顯的漂移(圖2)；通過計算各亞組2-△△Ct值并經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)MCAO組中再灌注0 h大鼠腦組織中TASK3 mRNA表達最高，與再灌注0 h相比較，再灌注24、48、72 h大鼠腦組織TASK3 mRNA表達顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且再灌注48 h大鼠腦組織TASK3 mRNA表達最低(P<0.01)，再灌注72 h大鼠腦組織TASK3 mRNA表達稍有升高(P<0.01，表1)。

Fig. 2 Amplification curve of TASK3 and GAPDH in different time points rats brain after focal cerebral ischemia/reperfusion of MCAO group TASK3: Two-pore domain K channel 3; MCAO: Middle cerebral artery occlusion; 1: 0 h; 2: 24 h; 3: 48 h; 4: 72 h

2.3 PROG對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠腦TASK3 mRNA表達的影響

Real-time PCR結果顯示：各組再灌注各時間點GAPDH mRNA擴增曲線無明顯漂移現(xiàn)象，而對應的TASK3 mRNA擴增曲線出現(xiàn)明顯的漂移(圖3)；通過計算各亞組2-△△Ct值并經(jīng)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)與假手術組相比，MCAO組再灌注各時間點腦組織TASK3 mRNA的表達均顯著降低(P<0.05)；與MCAO組相比，PROG+MCAO組再灌各時間點大鼠腦組織中TASK3 mRNA的表達均顯著增多(P<0.05，P<0.01，表1)。

Group0h24h48h72h Sham?operated1．012±0．0061．013±0．0211．006±0．0141．017±0．019MCAO0．874±0．054#0．821±0．049?#0．476±0．041??#0．732±0．047??#PROG+MCAO0．977±0．060△△0．867±0．048△0．791±0．038△△0．834±0．312△△

PROG: Progesterone; TASK3: Two-pore domain K channel 3; MCAO: Middle cerebral artery occlusion

*P<0.05，**P<0.01vsMCAO group reperfusion 0 h;#P<0.05vssham-operated group;△P<0.05，△△P<0.01vsMCAO group

3 討論

雙孔道結構域鉀離子通道家族(two-pore domain potassium channel familly，K2P)是幾乎沒有時間或電壓依賴性產(chǎn)生背景電流的鉀離子通道，可通過調節(jié)膜靜息電位從而調節(jié)神經(jīng)細胞的興奮性[2，8]。TASK3是K2P家族中有功能的pH敏感亞基之一，廣泛分布于神經(jīng)細胞[9]，TASK3通道在正常pH(pH 7.4)條件下主要表現(xiàn)為開放狀態(tài)，只有在氫離子濃度較高的酸性環(huán)境中才轉變?yōu)殛P閉狀態(tài)[10]。腦缺血時局部血流的減少可引起腦組織氧供給不足及無氧酵解增強，后者產(chǎn)生的乳酸及ATP水解產(chǎn)生的質子可使腦組織pH值降至6.0～6.5[11]，而pH 值下降和低氧可快速使TASK3通道被抑制導致膜去極化[1]，進而引發(fā)神經(jīng)元鉀離子依賴性的凋亡[1，2]，由此可見TASK3通道在腦缺血損傷過程中扮演著重要的角色。

本研究通過建立短暫性大腦中動脈栓塞模型，發(fā)現(xiàn)腦缺血2 h，再灌注0、24、48、72 h大鼠腦組織中TASK3 mRNA表達均較假手術組顯著降低，且通過Longa 5分制評分法對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠在上述時間點進行神經(jīng)功能缺陷評分，發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠在再灌注后各時間點神經(jīng)功能缺陷評分均顯著高于假手術組，這些提示腦缺血/再灌注損傷后TASK3 mRNA的低表達可能與大鼠腦缺血/再灌注損傷后神經(jīng)功能缺陷相關。

Fig. 3 Amplification curve of TASK3 and GAPDH at different time points rats brain after focal cerebral ischemia/reperfusion of each groups TASK3: Two-pore domain K channel 3; a: 0 h; b: 24 h; c: 48 h; d: 72 h; 1: Sham-operated group; 2: MCAO group; 3: PROG+MCAO; MCAO: Middle cerebral artery occlucsion; PROG: Progesterone

作為神經(jīng)保護甾體的PROG具有良好的抗腦缺血損傷引發(fā)的神經(jīng)細胞凋亡的能力[3]。本實驗觀察了PROG(8 mg/kg)對大鼠腦缺血2 h，再灌注0、24、48、72 h神經(jīng)功能缺陷評分和腦組織中TASK3 mRNA表達的影響，結果發(fā)現(xiàn)，PROG可顯著降低大鼠腦缺血2 h，再灌注24、48、72 h的神經(jīng)功能缺陷評分，提示PROG對局灶性腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的恢復有促進作用；并且還發(fā)現(xiàn)PROG + MCAO組腦缺血/再灌注各時間點大鼠腦組織中TASK3 mRNA的表達顯著高于MCAO組，這些提示PROG可能通過上調腦缺血/再灌注損傷大鼠腦組織中TASK3 mRNA的表達，減少TASK3介導的鉀離子依賴性的凋亡，從而改善腦缺血/再灌注損傷后的神經(jīng)功能缺陷癥狀，這可能是PROG對腦缺血/再灌注損傷大鼠發(fā)揮神經(jīng)保護作用的機制之一，而這種保護機制是否還通過調節(jié)腦缺血/再灌注損傷后腦組織中TASK3通道的開放而起作用？這值得進一步研究。

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Neuroprotective effect of progesterone on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats and its mechanism

LI Xin-juan, WEI Lin-yu, LI Chao-kun△, LI Dong-liang

(Department of Physiology and Neurobiology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, China)

Objective: To observe the neurological protective effects of progesterone ( PROG ) on focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats and to explore its possible mechanism. Methods: One handred and twenty male SD rats were divided into three groups randomly: sham-operated group, middle cerebral artery occlusion ( MCAO ) group and PROG + MCAO group(n=40). The right temporary MCAO model was established by the line-embolism method. The PROG + MCAO group rats were according to 8 mg/kg intraperitoneal injection PROG , after that 30 min, the rats were suffered ischemia/reperfusion. After rats were suffered ischemia for 2 h and reperfusion 0, 24, 48, 72 h stress, the nervous functional defect degree were evaluated by longe scoring, and the expression of two-pore domain K channel 3 (TASK3) mRNA in brain tissue were detected by the real-time PCR. Results: PROG ( 8 mg/kg ) could significantly reduced the nervous functional defect degree in rats after ischemia/reperfusion 24, 48, 72 h (P<0.05). The results of real-time PCR showed that the TASK3 mRNA expression in the brain tissue at all time points significantly decreased in MCAO group compared with sham-operated group (P<0.05). However, compared with MCAO group, the expression of TASK3 mRNA in brain tissue at all time points dramatically increased in PROG + MCAO group (P<0.05). Conclusion: PROG can improve the nervous functional defect degree after focal cerebral ischemia/reperfusion injury in rats, and the mechanism might be associated with up-regulating the expression of TASK3 mRNA in brain tissue.

progesterone; cerebral ischemia； ischemia/reperfusion injury; TASK3

國家自然科學基金資助項目(81100912，81271376)

2014-12-29

2015-02-28

R329.26；R743

A

1000-6834(2015)03-231-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.010

△【通訊作者】Tel: 0373-3029104； E-mail： lichaokun@hotmail.com