徐 紅， 安 冬， 殷盛明， 陳 薇， 趙 丹， 孟 旭， 于德欽， 孫藝平,， 趙 杰, 張萬(wàn)琴

(大連醫(yī)科大學(xué) 1. 生理學(xué)教研室， 2. 機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 3. 2012/3級(jí)， 遼寧 大連 116044)

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蝎源活性肽對(duì)帕金森病大鼠凋亡因子改變的影響*

徐 紅2， 安 冬3， 殷盛明1△， 陳 薇3， 趙 丹3， 孟 旭3， 于德欽1， 孫藝平1,2， 趙 杰1, 張萬(wàn)琴1

(大連醫(yī)科大學(xué) 1. 生理學(xué)教研室， 2. 機(jī)能實(shí)驗(yàn)室， 3. 2012/3級(jí)， 遼寧 大連 116044)

目的：研究早期帕金森病(PD)大鼠腦內(nèi)凋亡因子的改變及蝎源活性肽的保護(hù)作用。方法：選取健康雄性SD大鼠，體重為180～220 g，隨機(jī)分為4組(n=10)：早期PD模型組、假手術(shù)對(duì)照組、單獨(dú)蝎源活性肽處理組和蝎源活性肽治療組。采用6羥多巴胺(6-OHDA)制備大鼠PD早期模型，免疫組化觀察大鼠黑質(zhì)致密部和紋狀體尾狀核處Bax和Bcl-2免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒數(shù)量和光密度的變化，觀察大鼠PD發(fā)病早期腦內(nèi)促進(jìn)凋亡的Bax和抑制凋亡的Bcl-2的表達(dá)情況，進(jìn)一步觀察蝎源活性肽保護(hù)作用的抗凋亡機(jī)制。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)在6-OHDA給藥側(cè)，PD早期大鼠與對(duì)照組相比，腦內(nèi)促進(jìn)凋亡的Bax表達(dá)增強(qiáng)，而抑制凋亡的Bcl-2表達(dá)減弱，而蝎源活性肽可有效的逆轉(zhuǎn)這種異常的表達(dá)。結(jié)論：早期PD大鼠促進(jìn)凋亡的Bax表達(dá)增強(qiáng)和抑制凋亡的Bcl-2表達(dá)減弱參與PD的早期病變，而抗凋亡機(jī)制參與了蝎源活性肽對(duì)中腦多巴胺能神經(jīng)元的早期保護(hù)作用。

帕金森病； 蝎源活性肽； Bcl-2; Bax；大鼠

帕金森病(Parkinson’s disease, PD) 是以運(yùn)動(dòng)障礙為特征的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，其基本病理改變?yōu)檫x擇性中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性丟失[2]。PD從發(fā)病到有典型的臨床表現(xiàn)需要很長(zhǎng)的時(shí)間，最新研究顯示甚至在新生兒期的腦內(nèi)炎性損傷是導(dǎo)致幾十年后PD的原因之一[3]。PD的早期診斷和治療具有重要的意義，但是有關(guān)PD早期的發(fā)病機(jī)制尚未闡明。細(xì)胞凋亡參與PD的發(fā)病機(jī)制，抗凋亡也是PD治療中關(guān)注的熱點(diǎn)之一[4]?？沟蛲龌駼cl-2和促凋亡基因Bax是否參與早期PD的發(fā)病，少見(jiàn)報(bào)道。6-羥多巴胺( 6-hydrxydopamine, 6-OHDA )可在體外誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元的凋亡[5，6]。6-OHDA大鼠是研究PD防治的理想模型，將其注射到紋狀體后，大鼠黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)將發(fā)生緩慢的退行性病變，在紋狀體一側(cè)注射小劑量6-OHDA能夠建立有PD早期病理特征的動(dòng)物模型[7]。目前用于PD常規(guī)治療的左旋多巴制劑經(jīng)長(zhǎng)期使用，藥效降低，副作用大[8]。已有資料記載蝎毒可用于PD的治療[9]，但其機(jī)制尚不清楚。我們前期研究已發(fā)現(xiàn)蝎源活性肽可保護(hù)1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶(MPTP) 小鼠 PD模型[10]中腦黑質(zhì)內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元，蝎源活性肽可以保護(hù)早期6羥多巴大鼠腦內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元[11]。本研究采用6-OHDA早期PD大鼠模型，旨在觀察大鼠PD早期腦內(nèi)促進(jìn)凋亡的Bax和抑制凋亡的Bcl-2的表達(dá)情況，進(jìn)一步觀察蝎源活性肽保護(hù)作用的抗凋亡機(jī)制。為研究PD的早期診斷和防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

1.1.1 藥品與試劑 所用藥品包括6-OHDA(美國(guó)Sigma 公司)、Bcl-2與Bax抗體(Sigma公司)、生物素化的羊抗兔的IgG(武漢Boster公司)和蝎源活性肽(提取于東亞鉗蝎，本課題組專利，ZL0116116-9)。

1.1.2 儀器 所用儀器為ZPQ-86型振動(dòng)切片機(jī)(上海海天電子儀器有限公司)、DKI5600型腦立體定位儀(美國(guó))和HPIAS 系列彩色病理圖文分析系統(tǒng)(華海電子有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為SD大鼠(大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)為SCXXⅡ2008002)。健康雄性SD大鼠，體重為180～220 g，隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組(n=10)：早期PD模型組、假手術(shù)對(duì)照組、單獨(dú)蝎源活性肽處理組和蝎源活性肽治療組。

1.2.2 蝎源活性肽處理 單獨(dú)蝎源活性肽對(duì)照組和蝎源活性肽治療組在完成行為學(xué)測(cè)試后給予蝎源活性肽(2.20 mg/(kg·d), ip)一周，早期PD模型組只給予生理鹽水(NS，2 ml/kg)。蝎源活性肽劑量依據(jù)前期的研究和預(yù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 PD動(dòng)物模型制備 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛(400 mg/kg)，麻醉后將其固定在腦立體定位上，門齒桿長(zhǎng)為3.4 mm。依據(jù)大鼠腦定位圖譜(George Paxinos Charles Watson)來(lái)選取給藥的靶點(diǎn)，紋狀體為早期 PD的給藥靶點(diǎn)，具體的定位靶點(diǎn)為 AP=+1.0(前囟前)，R=3.0 mm(右旁開)，H=-4.5 mm(硬膜下)。早期PD的模型組和蝎源活性肽治療組的動(dòng)物按照前述靶點(diǎn)定位，于腦內(nèi)定點(diǎn)注射6-OHDA， 將6-OHDA溶解于Vehicle，內(nèi)含0.1%抗壞血酸和0.9% NaCl，濃度為20 μg/3 μl。藥物注射的時(shí)間約為3 min，留針約3 min之后再慢慢退出。假手術(shù)對(duì)照組的動(dòng)物在同等條件下，于靶點(diǎn)內(nèi)注射容量相同的Vehicle。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 動(dòng)物旋轉(zhuǎn)行為檢測(cè) 術(shù)后兩周，所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都在頸部皮下注射0.4 ml阿樸嗎啡，劑量為0.5 mg/kg，在30 min內(nèi)觀察并記錄誘導(dǎo)出的旋轉(zhuǎn)行為，小于7 r/min的左旋鼠視為模型成功的標(biāo)志。

1.3.2 邁步試驗(yàn) 采用1.1 m長(zhǎng)木板，將其傾斜放置，一端與鼠籠連接。在3 d內(nèi)，訓(xùn)練大鼠在木板爬行，之后回到籠內(nèi)并適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。在正式實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者用右手固定大鼠的雙后肢，將其輕輕上提，使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物離開桌面，用左手固定其一側(cè)前肢，讓其未固定的另一側(cè)前肢能夠接觸桌面。待該前肢可以自動(dòng)移動(dòng)的時(shí)候開始計(jì)時(shí)。記錄開始邁步直到返回鼠籠的時(shí)間和動(dòng)物爬行在斜面上的步數(shù)。先檢測(cè)左側(cè)，之后是右側(cè)，重復(fù)2次。

1.3.3 免疫組織化學(xué)反應(yīng) 采用免疫組織化學(xué)染色(ABC法)來(lái)檢測(cè)抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax的免疫反應(yīng)活性。選取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的切片，定位為中腦黑質(zhì)，采用PBS漂洗振蕩共3次(10 min/count)。PBS(含1%過(guò)氧化氫)處理10 min以清除內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶。PBS漂洗振蕩共3次(10 min/count)，PBS(含1%牛血清蛋白)封閉30 min。分別加入抗Bcl-2和Bax一抗抗體，在4℃下進(jìn)行孵育過(guò)夜。PBS漂洗共3次(10 min/count)，加入生物素化的二抗在室溫下孵育1.5 h；漂洗三次后再與卵白素-生物素的復(fù)合物A∶B∶PBS(1∶1∶200)在室溫下進(jìn)行振蕩孵育1 h，漂洗充分后再用現(xiàn)配的含有0.05%的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)-PBS的緩沖液顯色，顯色后終止反應(yīng)，梯度脫水，二甲苯透明之后采用中性樹脂進(jìn)行封片。

1.3.4 免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù) 采用病理圖文分析系統(tǒng)來(lái)定量分析Bcl-2和Bax免疫反應(yīng)(IR)陽(yáng)性的細(xì)胞(n=6)。根據(jù)George Paxinos Charles Watson大鼠的腦圖譜選取腦片的部位，10倍物鏡下觀察后，選取紋狀體和黑質(zhì)致密部(substantia nigra compact, SNC)，測(cè)量框的面積是20 000 μm2(100 μm×200 μm)，在上下左右四個(gè)部位進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算并采用其平均值。計(jì)算并分析框內(nèi)Bcl-2和Bax-IR陽(yáng)性的細(xì)胞個(gè)數(shù)。分別在選取腦區(qū)范圍內(nèi)的上下左右四個(gè)象限內(nèi)隨機(jī)選擇6個(gè)Bcl-2和Bax-IR陽(yáng)性的細(xì)胞，測(cè)定其胞漿的平均灰度。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

在邁步實(shí)驗(yàn)中，與蝎源活性肽治療組相比，早期PD模型組的大鼠在其左前肢邁步開始至返回到鼠籠所需總時(shí)間和邁步的數(shù)目沒(méi)有明顯的差異。

2.2 Bax和Bcl-2免疫組化的變化

2.2.1 Bax和Bcl-2免疫組化圖像結(jié)果 Bax和Bcl-2免疫組化結(jié)果顯示與假手術(shù)對(duì)照組相比，6-OHDA處理的早期PD動(dòng)物黑質(zhì)致密部SNC和紋狀體尾狀核處(striatum caudate putamen, CPu)的Bax和Bcl-2出現(xiàn)異常表達(dá)，促進(jìn)凋亡的Bax陽(yáng)性表達(dá)的免疫反應(yīng)活性增強(qiáng) (圖1B、E，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅲ)；而抑制凋亡的Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)的免疫反應(yīng)活性減弱(圖2B、E，見(jiàn)彩圖頁(yè)Ⅲ)，蝎源活性肽治療組能夠有效逆轉(zhuǎn)這種增強(qiáng)或減弱的趨勢(shì)。單獨(dú)蝎源活性肽處理組與假手術(shù)對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異，所以結(jié)果中未展示。

2.2.2 Bax和Bcl-2免疫組化陽(yáng)性顆粒數(shù)量和光密度統(tǒng)計(jì)的變化 Bax和Bcl-2免疫組化結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示，與假手術(shù)對(duì)照組相比，6-OHDA處理的早期PD動(dòng)物黑質(zhì)致密部和紋狀體處促進(jìn)凋亡的Bax的陽(yáng)性顆粒數(shù)與吸光度值均顯著增多；而抑制凋亡的Bcl-2的陽(yáng)性顆粒數(shù)與吸光度值均顯著下降，蝎源活性肽治療組能夠有效逆轉(zhuǎn)這種增多或減少的趨勢(shì)(P<0.05，P<0.01，表1、表2)。單獨(dú)蝎源活性肽處理組與假手術(shù)對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異，所以結(jié)果中未展示。

Tab. 1 Analysis of immunohistochemistry results of Bax in the SNC and CPu of the rats

GroupNumberSNCCPuODSNCCPuSham2．20±0．423．80±0．54124．20±3．71123．25±6．80EarlyPD3．85±0．60??5．45±0．84??138．15±1．96?135．75±5．28??Therapy2．00±0．59##3．30±0．89##122．95±6．98##122．50±4．03#

SNC： Substantianigra compact； CPu： Striatumcaudate putamen*P<0.05,**P<0.01vssham group；#P<0.05,##P<0.01vstherapy group

Tab. 2 Analysis of immunohistochemistry results of Bcl-2 in the SNC and CPu of the rats

GroupNumberSNCCPuODSNCCPuSham4．20±0．455．40±0．86130．22±5．33124．90±0．98EarlyPD2．50±0．18??2．40±0．20??118．36±3．66??103．90±2．08?Therapy4．10±0．60##5．15±0．52##129．47±3．66##124．00±1．36#

SNC： Substantianigra compact； CPu： Striatumcaudate putamen*P<0.05,**P<0.01vssham group；#P<0.05,##P<0.01vstherapy group

3 討論

PD是一種以靜止性震顫、動(dòng)作遲緩及減少等癥狀為主要臨床表現(xiàn)的中樞神經(jīng)退行性疾病，主要發(fā)生于中老年人。50歲之后PD發(fā)病率超過(guò)1%[12]。PD顯著的病理學(xué)特征是中腦黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元脫失引起紋狀體多巴胺分泌不足，進(jìn)而導(dǎo)致基底節(jié)神經(jīng)調(diào)節(jié)功能的紊亂[13]。目前帕金森病的發(fā)病機(jī)制尚不明確[14,15]，細(xì)胞凋亡可能是PD發(fā)生過(guò)程中多巴胺能神經(jīng)元死亡的共同通路[16]。Matus等[17]研究發(fā)現(xiàn)，PD患者的黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡明顯增加，還有報(bào)道細(xì)胞凋亡可能在PD的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡中發(fā)揮重要作用[18]，并提出了在PD治療過(guò)程中可采用抗細(xì)胞凋亡的方法。因此，對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)和抗細(xì)胞凋亡療法已成為PD治療的主要思路之一。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡，是相對(duì)細(xì)胞壞死而言的另一種細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞內(nèi)存在兩種具有相反功能的與凋亡相關(guān)的基因：促凋亡基因(Bax、Bak等)和抗凋亡基因(Bcl-2、Bcl-XL等)。在黑質(zhì)DA能神經(jīng)元凋亡的調(diào)控中，Bcl-2蛋白表達(dá)水平的下降，會(huì)引起B(yǎng)ax蛋白同源二聚體形成，從而促進(jìn)DA能神經(jīng)元凋亡；當(dāng)Bcl-2蛋白表達(dá)水平上調(diào)時(shí)，Bax蛋白同源二聚體解聚，促使Bcl-2與Bax兩種蛋白異源二聚體形成，抑制DA能神經(jīng)元凋亡。有研究表明，Bax與Bcl-2的比值影響細(xì)胞凋亡過(guò)程，Bax/Bcl-2值升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。Miyashita等[20]研究證實(shí)，Bax是包括6-OHDA所致紋狀體內(nèi)DA能神經(jīng)元損傷等各種神經(jīng)細(xì)胞損傷的啟動(dòng)因素之一，Bax的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放增多，Apaf-1變構(gòu)加速，作用于Caspase前體，使其活化，從而激活Caspase級(jí)聯(lián)凋亡程序[21]。Bcl-2能夠促進(jìn)DNA損傷修復(fù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca水平，減少線粒體釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿[22]。

目前，PD的治療多采用針對(duì)性補(bǔ)充多巴胺等對(duì)癥治療，隨著治療時(shí)間的增長(zhǎng)，藥物對(duì)癥治療效果越來(lái)越差，靜止性震顫、肌肉僵直等癥狀日漸明顯，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量并加重其經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[23]。因此，探討PD的發(fā)生機(jī)制并尋找性價(jià)比高的對(duì)癥藥物成為目前研究的熱點(diǎn)。蝎毒作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥, 早有記載可用于治療PD[8]。本研究在大鼠紋狀體一側(cè)注射小劑量6-OHDA，制備PD早期動(dòng)物模型，經(jīng)旋轉(zhuǎn)行為實(shí)驗(yàn)與邁步實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組沒(méi)有明顯的差異，可證實(shí)早期PD大鼠模型制備成功[24-26]。我們研究發(fā)現(xiàn)蝎源活性肽對(duì)早期PD大鼠多巴胺能神經(jīng)元具有保護(hù)作用[11]，進(jìn)而通過(guò)更深一步研究觀察到早期PD大鼠相對(duì)于對(duì)照組而言，其6-OHDA損毀側(cè)中腦促進(jìn)凋亡的Bax陽(yáng)性表達(dá)免疫反應(yīng)活性增強(qiáng)，而抑制凋亡的Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)免疫反應(yīng)活性減弱，而蝎源活性肽可有效的逆轉(zhuǎn)這種異常的表達(dá)。表明促進(jìn)凋亡的Bax表達(dá)增強(qiáng)和抑制凋亡的Bcl-2表達(dá)減弱參與PD的早期病變，而抗凋亡機(jī)制參與了蝎源活性肽對(duì)中腦多巴胺能神經(jīng)元的早期保護(hù)作用。推測(cè)蝎源活性肽可能通過(guò)促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)和抑制Bax的表達(dá)，達(dá)到抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡來(lái)減少多巴胺神經(jīng)元的丟失，從而發(fā)揮抗PD作用。

綜上所述，PD發(fā)病與細(xì)胞凋亡密不可分。Bax可啟動(dòng)并誘導(dǎo)黑質(zhì)DA能神經(jīng)元凋亡，是一種前凋亡蛋白，而Bcl-2可通過(guò)調(diào)控DNA損傷修復(fù)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。所以，干擾Bax蛋白表達(dá)，使其表達(dá)水平下調(diào)等抑制細(xì)胞前凋亡步驟的方法以及調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比值在臨床治療中具有重大意義。相信隨著對(duì)PD多巴胺能神經(jīng)元凋亡發(fā)病機(jī)制與蝎源活性肽藥用價(jià)值的進(jìn)一步研究，蝎源活性肽抗DA能神經(jīng)元凋亡治療PD一定會(huì)得到充分的認(rèn)識(shí)和發(fā)展，為PD的預(yù)防與治療提供了又一重要的理論依據(jù)。

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The alterations of apoptosis factor Bcl-2/Bax in the early Parkinson’s disease rats and the protective effect of scorpion venom derived activity peptide

XU Hong2, AN Dong3, YIN Sheng-ming1△, CHEN Wei3, ZHAO Dan3, MENG Xu3, YU De-qin1, SUN Yi-ping1,2, ZHAO Jie1, ZHANG Wan-qin1

(Dalian Medical University 1. Department of Physiology， 2. Functional Laboratory， 3. 2012/3 grade students， Dalian 116044， China)

Objective: To explore the alterations of apoptosis factor Bcl-2/Bax in the early Parkinson’s disease (PD) rats and the protective effect of scorpion venom derived bioactive peptide. Methods: Healthy male SD rats (180～220 g) were randomly divided into 4 groups (n=10): early PD model group, sham operation group, scorpion venom derived bioactive peptide control group, scorpion venom derived bioactive peptide therapy group. 6-hydroxydopamine (6-OHDA) was used to prepare the early PD rat model. The immunohistochemistry was used to detect the expression of Bax and Bcl-2 and further explore the mechanism of anti-apoptosis regarding the neuroprotective effect of scorpion venom derived bioactive peptide. Results: The results indicated that compared with the control rats, the immunostaining of Bax in the brain increased significantly while that of Bcl-2 decreased significantly in the lesion side of 6-OHDA treated rats. Interestingly, scorpion venom derived bioactive peptide could attenuate the above abnormal changes. Conclusion: Up-regulation of Bax and down-regulation of Bcl-2 could participate in the early stage of PD and the anti-apoptotic mechanism could be involved in the neuroprotective effect exerted by scorpion venom derived activity peptide regarding the dopaminergic neuron in the early stage.

Parkinson’s disease； scorpion venom derived activity peptide； Bcl-2； Bax； rats

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31201724)；遼寧省大學(xué)生科研創(chuàng)新活動(dòng)(201310161008)

2014-12-15

2015-02-10

R741

A

1000-6834(2015)03-225-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.008

△【通訊作者】Tel： 0411-86110288； E-mail: dlshengming@163.com