張楹怡， 田衛(wèi)平， 梅 玫

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心， 天津 300070)

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miR-21與DNA甲基化在不同乳腺癌細(xì)胞中的相互作用*

張楹怡， 田衛(wèi)平△， 梅 玫△

(天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心， 天津 300070)

目的：探究不同乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-231)中miR-21與DNA甲基化相互調(diào)節(jié)作用。方法：將熒光標(biāo)記的miR-21抑制劑及陰性對(duì)照瞬時(shí)轉(zhuǎn)入MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞中，用熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效率，以Real-time PCR檢測(cè)miR-21的敲低水平，并以bisulfite-qMSP法檢測(cè)基因組DNA甲基化水平。同時(shí)，以2.5 μmol/L DNA甲基化酶抑制劑5-AZA處理細(xì)胞72 h，以單純二甲基亞楓(DMSO)處理做為陰性對(duì)照，觀察DNA甲基化改變對(duì)miR-21表達(dá)水平的影響，接著以Western blot檢測(cè)miR-21下游基因人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)、蛋白激酶 B(AKT)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：miR-21抑制劑可敲低MCF-7細(xì)胞中miR-21的表達(dá)水平(P<0.01)，并引起基因組DNA甲基化水平的顯著升高以及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt1、Dnmt3a以及Dnmt3b 的普遍升高(P<0.05，P<0.01)。而在MDA-MB-231細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)miR-21抑制劑則引起miR-21表達(dá)水平的小幅度升高(P<0.01)以及整體DNA甲基化水平的降低(P<0.05)，并伴隨有Dnmt3a的升高及Dnmt3b的降低。使用5-AZA處理后發(fā)現(xiàn)，其可顯著上調(diào)MCF-7以及MDA-MB-231細(xì)胞中miR-21的表達(dá)(P<0.01)，并引起其下游基因PTEN在MCF-7細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)升高，進(jìn)而下調(diào)AKT的蛋白水平。結(jié)論：瞬轉(zhuǎn)miR-21抑制劑對(duì)MCF-7與MDA-MB-231細(xì)胞DNA甲基化水平的調(diào)節(jié)截然相反，而DNA甲基化的降低則可使miR-21的表達(dá)一致上調(diào)。本研究可為以后不同類型乳腺癌的臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

microRNA-21；DNA甲基化；相互作用；乳腺癌

乳腺癌為婦女最常見(jiàn)惡性腫瘤之一。近年來(lái)，其發(fā)病率呈逐年升高趨勢(shì)，每年全球范圍內(nèi)新增乳腺癌病例約138萬(wàn)[1]，局部地區(qū)其死亡率高達(dá)40%左右[2]。微小RNA (microRNA，miRNA)是一類長(zhǎng)度為19～25 nt的內(nèi)源性小非編碼RNA[3]，其可特異識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)mRNA，促進(jìn)目標(biāo)mRNA 的降解或抑制其翻譯而負(fù)性調(diào)控基因的表達(dá)[4]。以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-21作為一種致癌基因在乳腺癌細(xì)胞(MCF-7、MDA-MB-231)中表達(dá)升高[3, 5]，并且這種高表達(dá)水平與乳腺癌病人的較差預(yù)后密切相關(guān)[6]，相反敲低miR-21的表達(dá)則可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)外生長(zhǎng)并增強(qiáng)其對(duì)紫杉醇化療的敏感性[7, 8]。DNA甲基化是以S-腺苷甲硫氨酸提供甲基，在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA Methyltransferase, DNMT)催化下，使胞嘧啶第5位碳原子甲基化而轉(zhuǎn)化為5-甲基胞嘧啶[9]。DNA甲基化的改變亦存在于乳腺癌的發(fā)生及其對(duì)紫杉醇化療耐藥之中[10]。

miR-21與DNA甲基化在乳腺癌的發(fā)生以及其藥物化療過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，然而其二者在乳腺癌中的相互關(guān)系卻知之甚少。因此，本研究旨在探究乳腺癌細(xì)胞中miR-21與DNA甲基化的相互調(diào)節(jié)關(guān)系，以期為深入了解乳腺癌的發(fā)生機(jī)制及制定合理的化療方案提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，常規(guī)培養(yǎng)。miR-21抑制劑購(gòu)自上海吉瑪公司，靶序列為：5’ -UCA ACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3’，其陰性對(duì)照序列為：5’-CAGUACUUUUGUGUAGU ACAA-3’， TRNzol總RNA提取試劑(Cat# DP405-02)、SuperReal SYBR Green熒光定量試劑(Cat# FP205-02)購(gòu)自天根生化科技有限公司，SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Cat# 18080-051)、LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑(Cat# 11668-019)購(gòu)自Invitrogen公司，EpiTect Bisulfite試劑盒(Cat# 59104)購(gòu)自QIAGEN公司，5-Aza-2’deoxycytidine(5-AZA) (Cat# A3656)購(gòu)自SIGMA公司，RIPA組織/細(xì)胞裂解液(Cat# R0010)、PMSF(Cat# P0100)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(Cat# PC0020)、ECL發(fā)光液(Cat# PE0010)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，所有抗體均購(gòu)自Affinity公司(PTEN: Cat# AF6351,AKT: Cat# AF6259 ,β-actin: Cat# AF7018)，DMEM培養(yǎng)基及血清均購(gòu)自Gibco公司。

1.2 miR-21抑制劑的細(xì)胞轉(zhuǎn)染

挑選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人乳腺癌細(xì)胞(細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化，4×105cells/well于無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基中接種于6孔板之中，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)，即可用于轉(zhuǎn)染。實(shí)驗(yàn)分組為：(1)Naive 組：細(xì)胞不做任何處理，培養(yǎng)條件、時(shí)間同處理組；(2)陰性對(duì)照(NC)組：4 μl LipofectamineTM與4 μg陰性對(duì)照(NC)于無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)基中室溫孵育20 min后加入細(xì)胞之中；(3)處理(miR-21抑制劑)組：4 μl LipofectamineTM 2000與4 μg miR-21抑制劑于無(wú)血清無(wú)雙抗DMEM培養(yǎng)基中室溫孵育20 min后加入細(xì)胞之中。轉(zhuǎn)染6 h后，使用無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行換液并拍攝熒光照片。轉(zhuǎn)染48 h后收獲細(xì)胞用以后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 亞硫酸氫鈉(bisulfite)轉(zhuǎn)化基因組DNA

使用傳統(tǒng)酚-氯仿抽提法提取基因組DNA，使用EpiTect Bisulfite試劑盒對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)化。反應(yīng)體系包括：500 ng DNA，35 μl DNA保護(hù)液以及85 μl轉(zhuǎn)化試劑。反應(yīng)條件為：95℃ 5 min，60℃ 25 min，95℃ 5 min，60℃ 85 min，95℃ 5 min，60℃ 175 min，反應(yīng)結(jié)束后使用試劑盒自帶離心柱對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化，用以后續(xù)實(shí)驗(yàn)或-20℃保存。

1.4 甲基化特異性定量PCR(qMSP)檢測(cè)基因組DNA整體甲基化水平

LINE-1 是基因組廣泛分布的長(zhǎng)散布核元件-1( long interspersed nucleotide acids element-1，LINE-1)，其在人類基因組的拷貝數(shù)大于50萬(wàn)，占人類基因組的18%，因此其甲基化程度可代表核基因組的甲基化程度[10]。β-Actin為內(nèi)參基因，其擴(kuò)增片段不含任何CpG位點(diǎn)。引物序列見(jiàn)表1。

1.5 5-AZA處理細(xì)胞

挑選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，2.5 μmol/L DNA甲基化抑制劑5-AZA處理72 h后收集細(xì)胞[11]。對(duì)照組為相同稀釋倍數(shù)的DMSO。

1.6 Real-time PCR檢測(cè)miR-21以及DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmts的表達(dá)水平

以TRN-zol氯仿法提取細(xì)胞總RNA，使用SuperScript Ⅲ反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第1鏈cDNA，其中除miR-21使用特異性反轉(zhuǎn)錄引物以外，其余基因均使用隨機(jī)引物。Real-time PCR使用SuperReal SYBR Green熒光定量試劑于ABI 7500FAST定量PCR儀進(jìn)行，反應(yīng)條件如下：95℃ 熱啟動(dòng)15 min, 95℃ 30 s, 60℃ 1 min,40個(gè)循環(huán)。所有引物序列見(jiàn)表1。使用U6、Gapdh為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.7 Western blot 檢測(cè)miR-21目標(biāo)基因蛋白表達(dá)水平

Tab. 1 Primers used in the present study

遵照操作說(shuō)明書(shū)，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。SDS-PAGE分離蛋白后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉1 h。分別加入兔抗人PTEN、AKT和兔抗人β-actin一抗，4℃孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗孵育1 h。ECL發(fā)光顯色及灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 miR-21抑制劑對(duì)乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系中miR-21表達(dá)的影響

熒光顯微鏡觀察結(jié)果(圖1)顯示， miR-21抑制劑可成功轉(zhuǎn)入MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞之中。Real-time PCR進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，瞬轉(zhuǎn)miR-21抑制劑可顯著敲低MCF-7細(xì)胞miR-21的表達(dá)水平(P<0.01)，而在MDA-MB-231細(xì)胞系中，瞬轉(zhuǎn)miR-21抑制劑則可引起miR-21表達(dá)水平的小幅度升高(P<0.01，表2)。此結(jié)果表明，瞬轉(zhuǎn)miR-21抑制劑在不同乳腺癌細(xì)胞系中對(duì)miR-21 RNA水平的表達(dá)影響略有不同。

2.2 miR-21表達(dá)的改變對(duì)基因組DNA甲基化水平的改變

為了探究miR-21表達(dá)水平改變所引起的基因組DNA甲基化水平的變化，我們檢測(cè)了LINE-1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在miR-21被顯著敲低的MCF-7細(xì)胞之中，LINE-1的甲基化水平顯著升高(P<0.05))，而在miR-21升高的MDA-MB-231細(xì)胞系中，LINE-1的甲基化水平則有較小幅度的降低(P<0.05)。在進(jìn)一步對(duì)Dnmts的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)， MCF-7細(xì)胞中Dnmt1(P<0.01)、Dnmt3a(P<0.05)、Dnmt3b(P<0.05)的表達(dá)水平均顯著升高，而在Dnmt3a(P<0.01)顯著升高的MDA-MB-231細(xì)胞中則伴隨有Dnmt3b(P<0.05)的小幅度降低。這些結(jié)果表明，miR-21表達(dá)水平的改變可引起基因組DNA甲基化以及Dnmts表達(dá)水平發(fā)生改變(表3)。

Fig. 1 Transfection efficiency observed using fluorescence microscopy( ×100)

Tab. 2 miR-21 expression level assessed by real-time PCR

GroupMCF?7MDA?MB?231Naive0．92±0．020．18±0．002NC0．98±0．020．20±0．01miR?21inhibitor0．15±0．01??##0．24+0．01??##

NC: Negative control

**P<0.01vsnaive group;##P<0.01vsNC group

2.3 甲基化酶抑制劑5-AZA對(duì)乳腺癌細(xì)胞系中miR-21表達(dá)的影響

上述研究結(jié)果顯示，miR-21可調(diào)控乳腺癌細(xì)胞基因組DNA甲基化的改變，然而miR-21自身受DNA甲基化調(diào)控的情況尚不清楚。因此使用甲基化酶抑制劑5-AZA處理細(xì)胞，結(jié)果顯示5-AZA可顯著降低MCF-7及MDA-MB-231細(xì)胞基因組DNA甲基化水平(P<0.01)，說(shuō)明細(xì)胞處理方法正確有效。同時(shí)發(fā)現(xiàn)miR-21在兩種細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平均有顯著升高(P<0.01，表4)，表明乳腺癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)可受DNA甲基化的調(diào)控。

Tab. 3 Regulation of DNA methylation by miR-21 inhibitor

NC: Negative control

*P<0.05,**P<0.01vsNC group

Tab. 4 Regulation of miR-21 expression by 5-AZA treatment

GroupMCF?7LINE?1miR?21MDA?MB?231LINE?1miR?21DMSO0．65±0．050．75±0．020．97±0．040．28±0．015?AZA0．55±0．01??0．90±0．01??0．70±0．05??0．55±0．02??

DMSO: Dimethyl sulfoxide

**P<0.01 DMSO group

2.4 甲基化酶抑制劑5-AZA對(duì)miR-21下游基因表達(dá)的影響

5-AZA處理之后，MCF-7細(xì)胞中PTEN的表達(dá)水平有顯著增加，進(jìn)而下調(diào)Akt的表達(dá)。而二者在MDA-MB-231細(xì)胞中則無(wú)明顯變化(圖2)。結(jié)果表明，在不同乳腺癌細(xì)胞中，5-AZA對(duì)miR-21目標(biāo)基因可發(fā)揮不同的調(diào)控作用。

Fig. 2 Effects of 5-AZA on the expression of downstream genes of miR-21 PTEN: Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome; AKT: Protein kinase B

3 討論

乳腺癌是一類分子表型異質(zhì)性較高的復(fù)雜疾病，根據(jù)基因表達(dá)的差異，可將其分為至少五種亞型：管腔(luminal)型, 人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her-2)過(guò)表達(dá)型，基底細(xì)胞樣(basal-like)型以及正常乳腺樣(normal-like)型，其中l(wèi)uminal型又分為A、B兩個(gè)亞型[12]。本研究中所選乳腺癌細(xì)胞分別屬于luminal A和basal-like型[13, 14]，其最大差異為MCF-7細(xì)胞為雌激素受體陽(yáng)性，而MDA-MB-231則為雌激素受體陰性細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)中，我們瞬轉(zhuǎn)miR-21抑制劑可顯著敲低MCF-7細(xì)胞系內(nèi)miR-21的表達(dá)，而在MDA-MB-231細(xì)胞系中則無(wú)明顯敲低效果，推測(cè)一方面原因可能與MDA-MB-231細(xì)胞系本身特性有關(guān)，導(dǎo)致miR-21抑制劑與miR-21結(jié)合后無(wú)法對(duì)其進(jìn)行切割降解，其具體作用機(jī)制，有待于后續(xù)深入研究；另一方面可能與轉(zhuǎn)染方式有關(guān)，瞬轉(zhuǎn)僅可使miR-21抑制劑在細(xì)胞內(nèi)一過(guò)性的存在，而不能維持其長(zhǎng)時(shí)間的作用，故可導(dǎo)致敲除效果出現(xiàn)偏差。

miRNA可通過(guò)RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑(RNA-directed DNA methylation，RdDM)沉默目標(biāo)基因[15],而啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化水平的改變亦可影響miRNA自身的轉(zhuǎn)錄[16]。本研究發(fā)現(xiàn)敲低miR-21的表達(dá)可顯著升高乳腺癌MCF-7細(xì)胞的DNA甲基化水平，與之對(duì)應(yīng)的是三類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Dnmt1、Dnmt3a以及Dnmt3b的表達(dá)均有顯著升高。而在miR-21表達(dá)水平小幅度升高的MDA-MB-231細(xì)胞系中，其DNA甲基化水平則有輕微的下降，同時(shí)伴隨有Dnmt3a的升高以及Dnmt3b的降低。DNA甲基化無(wú)疑是由DNMTs所催化的[17]，但是在一些情況下Dnmt3a亦可介導(dǎo)DNA的去甲基化過(guò)程[18]。因此，推測(cè)本研究中MDA-MB-231細(xì)胞的低甲基化可能受升高的Dnmt3a與降低的Dnmt3b同時(shí)介導(dǎo)。這些結(jié)果表明，在不同乳腺癌細(xì)胞系中，瞬轉(zhuǎn)miR-21對(duì)DNA甲基化的調(diào)控作用不盡相同。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用Dnmt抑制劑5-AZA降低基因組DNA甲基化水平，可顯著提高M(jìn)CF-7以及MDA-MB-231細(xì)胞中miR-21的表達(dá)，表明在不同乳腺癌細(xì)胞系中DNA甲基化對(duì)miR-21的調(diào)控更為一致，亦表明這種調(diào)控更為穩(wěn)定，適用性更廣。

以往研究發(fā)現(xiàn)，作為miR-21的目標(biāo)基因，PTEN同時(shí)受DNA甲基化的直接調(diào)控[19]。PTEN的抑制以及Akt信號(hào)通路的激活存在于多種腫瘤的發(fā)生過(guò)程中[20]，本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)使用miR-21抑制劑可顯著升高乳腺癌細(xì)胞中PTEN的表達(dá)并有效抑制Akt的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇化療的敏感性[7]。在本研究中，使用5-AZA處理乳腺癌MCF-7細(xì)胞，在提高miR-21表達(dá)的同時(shí)卻不能有效降低PTEN的表達(dá)，反而對(duì)其表達(dá)水平有一定促進(jìn)作用。表明DNA甲基化的調(diào)節(jié)在此過(guò)程中發(fā)揮主要作用，并與miR-21抑制劑作用相仿。進(jìn)而推測(cè)在此過(guò)程中，5-AZA發(fā)揮主要作用。

綜上所述，本研究通過(guò)瞬轉(zhuǎn)miR-21抑制劑與DNA甲基化酶抑制劑5-AZA的使用，初步闡述了乳腺癌細(xì)胞中miR-21與DNA甲基化的相互調(diào)節(jié)關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)瞬轉(zhuǎn)miR-21抑制劑對(duì)MCF-7與MDA-MB-231細(xì)胞DNA甲基化水平的調(diào)節(jié)截然相反，而DNA甲基化的降低則可使miR-21的表達(dá)一致上調(diào)。此外，在對(duì)miR-21下游基因的調(diào)控中，DNA去甲基化與miR-21抑制劑在MCF-7細(xì)胞中表現(xiàn)為相仿的作用，因而本研究可為以后不同類型乳腺癌的臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Interaction between miR-21 and DNA methylation in different breast cancer cells

ZHANG Ying-yi, TIAN Wei-ping△, MEI Mei△

(Tianjin Research Center of Basic Medical Science, Tianjin Medical University， Tianjin 300070， China)

Objective: To determine the interaction between miR-21 and DNA methylation in different breast cancer cells. Methods: Fluorescence tagged miR-21 inhibitor and its negative control (NC) were transient transfected into MCF-7 and MDA-MB-231 cell, the transfection efficiency was observed using fluorescence microscopy, and the miR-21 expression level and genome DNA methylation status before and after transfection were assessed by real-time PCR and bisulfite-qMSP respectively. To investigate the regulation effect of DNA methylation on miR-21, cells were treated with 5-AZA (2.5 μmol/L) for 72 h, with dimethyl sulfoxide (DMSO) treatment as its negative control (NC), and the expression level of phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten (PTEN) and AKT(also known as Protein Kinase B), two downstream genes of miR-21 were detected by Western blot. Results: The expression of miR-21 in MCF-7 cell was significantly knocked down (P<0.01) by miR-21 inhibitor, with the genome DNA methylation level (P<0.05) and all the three Dnmts: Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b unregulated. In contrast, the miR-21 expression in MDA-MB-231 cell was elevated (P<0.01) by miR-21 inhibitor, meanwhile, downregulated of genome DNA methylation (P<0.05) and Dnmt3b expression, upregulation of Dnmt3a were also observed. In addition, treated with 5-AZA resulted in significant increases of miR-21 expression in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells (P<0.01), with the protein level of PTEN increased in MCF-7 cell, which was further involved in the downregulation of AKT. Conclusion: The regulation effects of DNA methylation by transient transfection of miR-21 in MCF-7 and MDA-MB-231 cells are almost opposite, whilst the expression of miR-21 in two cell lines were all upregulated by decreased DNA methylation level. and our results may provide some experimental evidences for the future development of rational therapy for different breast cancer.

microRNA-21; DNA methylation; interaction; breast cancer

天津市科委項(xiàng)目(13JCYBJC21600)；天津市教委項(xiàng)目(20130601)；天津醫(yī)科大學(xué)項(xiàng)目(2012KYM10)

2015-01-07

2015-03-06

RT37.9

A

1000-6834(2015)03-220-05

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.007

△【通訊作者】Tel： 022-83336530， 022-83336519； E-mail： tianweiping@yahoo.com，meim@tijmu.edu.cn