武 磊， 劉曉華， 王天輝， 段瑞峰， 周學思， 劉洪濤, 張志清

(軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所， 天津 300050)

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組蛋白去乙?；敢种苿Υ笫髴ば孕募p傷的保護作用*

武 磊， 劉曉華， 王天輝， 段瑞峰， 周學思， 劉洪濤, 張志清△

(軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所， 天津 300050)

目的：觀察組蛋白去乙?；敢种苿┰趹ば孕募p傷發(fā)生過程中的作用。方法：健康雄性Wistar大鼠隨機分為3組(n=6)，用束縛應激方法建立慢性應激性心肌損傷模型，采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A (TSA)干預，觀察TSA對應激性心肌損傷的保護作用。Western blot檢測實驗各組大鼠心肌的組蛋白乙?；?，采用分光光度法動態(tài)監(jiān)測大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶-MB(CK-MB)活性以及心肌組織Caspase 3活性，Nagar Olsen染色觀察心肌的早期損傷。結(jié)果：束縛應激可以顯著降低大鼠心肌的組蛋白乙?；?P<0.05)，而TSA干預可以抑制應激所致的心肌組蛋白乙?；浇档?P<0.05)；束縛應激可以引起大鼠血清LDH和CK-MB活性、心肌組織Caspase 3活性顯著升高(P<0.05)，發(fā)生心肌早期損傷，而TSA干預可顯著降低束縛應激引起的LDH(P<0.05)、 CK-MB活性(P<0.05)、Caspase 3活性升高(P<0.05)。結(jié)論：組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA對應激性心肌損傷具有一定的保護作用。

組蛋白去乙?；敢种苿皇`應激；心肌損傷；大鼠

染色質(zhì)DNA的組蛋白乙?；揎検钦婧思毎虮碛^遺傳調(diào)控的一種重要調(diào)節(jié)方式，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT) 和組蛋白乙?；?histone deacetylase，HDACs)調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；癄顟B(tài)，以控制基因轉(zhuǎn)錄。近年來發(fā)現(xiàn)組蛋白的乙酰化修飾在心血管疾病中也具有重要的生理和病理生理意義，組蛋白去乙?；冈谛募》蚀蟆⑿募p傷、血管重塑等心血管疾病中的表達顯著升高，而組蛋白脫乙?；敢种苿┠軌蛴行Ц纳菩募》蚀筮^程中的房性心律不齊和纖維化[1]，并且能夠降低小鼠心肌缺血/再灌注損傷[2]，據(jù)此推測組蛋白去乙?；敢种苿┛赡苣軌蛞种茟ば孕募p傷的發(fā)生。本研究采用組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹 (trichostatin A，TSA)干預束縛應激大鼠，探討其對應激性損傷的保護作用，為尋找應激性心肌損傷的藥物靶標和防護措施提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級健康雄性Wistar大鼠，體重180～200 g，購自軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所動物中心。

1.2 藥品和主要試劑

血清乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒、肌酸激酶同工酶-MB(creatine kinase isoenzymes, CK-MB)購自中國北京中生北控公司，Caspase 3活性購自中國碧云天生物科技有限公司，組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA購自sigma公司，組蛋白H3乙?；?H3K9)、組蛋白H4乙?；?H4K12)、以及組蛋白H3抗體均購自美國cell signaling technology公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 動物分組及給藥

大鼠18只，隨機分為3組(n=6): 對照組、束縛應激組、束縛應激+TSA干預組。束縛應激組和束縛應激+TSA干預組采用自制的束縛倉進行束縛，束縛方法參照Galea LAM的方法[3]，每天束縛6 h(9∶00-15∶00)，共束縛3周。束縛應激+TSA干預組于每天束縛應激前1 h經(jīng)靜脈注射TSA 5 mg/kg。對照組與實驗組飼養(yǎng)條件相同，不進行束縛。

1.4 血樣采集

血樣采集采用眼眶內(nèi)眥采血。分別在束縛應激前、1周、2周、3周束縛結(jié)束后，眼眶內(nèi)眥采血，采用肝素抗凝，4℃下3 000 r/min離心10 min, 取上清，-80℃保存。

1.5 心肌組織組蛋白乙?；降臋z測

第3周束縛應激結(jié)束后，大鼠斷頭處死，剪取心尖部分，置于預冷的勻漿介質(zhì)中勻漿。700×g，離心7 min，棄上清后加入等量的裂解液裂解40 min，12 000×g離心10 min，取上清。BCA法蛋白定量后，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5 min變性。各組蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉加一抗孵育過夜、二抗室溫孵育1 h，X光膠片壓片曝光、顯影、定影。

1.6 大鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性檢測

乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(試劑ⅠNAD 6.5 mol/L；試劑ⅡTris100 mmol/L pH 8.9；KCl 100 mmol/L；L-乳酸鋰52 mmol/L)，采用生物化學法測定。LDH值計算：LDH活性(U/L)=△A/min×8095。

肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性測定采用生物化學法，按照試劑盒要求測定。 CK-MB的計算參見公式：CK-MB(U/L)=△A/min×1605。

1.7 心肌組織Caspase 3活性檢測

采用分光光度法檢測組織裂解液中Caspase 3酶活性。按照每10 mg組織加入100 μl裂解液的比例加入裂解液，在冰浴上用玻璃勻漿器勻漿，把勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5 ml離心管中，冰浴再裂解5 min，4℃ 16 000～20 000×g離心10～15 min，把上清轉(zhuǎn)移到冰浴預冷的離心管中，立即測定Caspase 3的酶活性，同時取少量樣品用BCA法測定蛋白濃度。

1.8 大鼠心肌Nagar Olsen染色的光鏡觀察

大鼠心肌石蠟切片制備：束縛3周實驗結(jié)束后，處死大鼠，取心肌固定在4%甲醛中固定24 h，酒精梯度脫水，酒精/二甲苯(體積比1∶1)15 min，二甲苯I 15 min，二甲苯II 15 min依次透明，石蠟包埋，切片，常規(guī)脫蠟，復水，染色。

Nagar Olsen染色：該方法為可以顯示心肌早期損傷的蘇木素堿性復紅苦味酸染色法。切片浸入明礬蘇木素液10～30 s，自來水沖洗5 min，堿性復紅染色液染色3 min，蒸餾水洗5～10 s，純丙酮洗5 s，1%苦味酸純丙酮液迅速分化5～15 s，純丙酮脫水，二甲苯透明和中性樹膠封固，光學顯微鏡下觀察。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 心肌組織組蛋白乙酰化水平變化

Western blot結(jié)果顯示，束縛應激組大鼠心肌組織組蛋白H3和H4的乙?；捷^對照組顯著降低至40%左右(P<0.05，圖1)，而用組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA干預后，心肌組織組蛋白乙酰化水平相對于應激組大鼠顯著升高(P<0.05，圖1)。結(jié)果表明，組蛋白去乙?；冈趹ば孕募p傷中有重要作用，而組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA可以顯著抑制HDACs的活性，抑制應激引起的組蛋白乙酰化水平降低。

2.2 心肌酶活性

心肌酶活性結(jié)果顯示，束縛應激組大鼠血漿LDH和CK-MB的活性明顯升高，而用TSA 干預的束縛應激+TSA組大鼠血漿LDH和CK-MB的活性較束縛應激組顯著降低(表1、表2)，表明TSA干預能夠降低束縛應激所造成的心肌酶活性升高。

Fig. 1 Effect of TSA intervention on the levels of histone acetylation in myocardial tissue B: Ac-H3K9 levels; C: Ac-H4K12 levels; RS： Restraint stress; RS+TSA：Restraint stress with TSA treatment group; TSA: Trichostatin; Ac-H3K9: Acetylation-Histone 3 lysine 9; Ac-H4K12: Acetylation-Histone 4 lysine 12*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsRS group

Group0week1week2week3weekControl51．12±12．5356．21±13．4554．65±14．2353．25±12．46RS52．26±11．6867．13±17．18146．51±18．48?236．11±43．08?RS+TSA47．31±8．8056．88±15．16111．48±9．12#166．68±26．09#

RS: Restraint stress group; RS+TSA: Restraint stress with TSA treatment group; TSA: Trichostatin; LDH: Lactate dehydrogenase

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsRS group

Group0week1week2week3weekControl78．68±16．5376．21±15．4781．64±21．4282．28±19．58RS81．99±22．5584．85±19．35195．70±43．23?318．65±38．09?RS+TSA82．71±26．2284．37±20．80147．45±25．56#247．17±23．33#

RS: Restraint stress group; RS+TSA: Restraint stress with TSA treatment group; TSA: Trichostatin; CK-MB: Creatine kinase isoenzymes

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsRS group

2.3 心肌組織Caspase 3活性

Caspase 3 是凋亡發(fā)生過程中所需要的一種重要的蛋白酶，同時也是凋亡發(fā)生的標志酶。為了進一步確認TSA干預對束縛應激所致心肌損傷的影響，本研究測定了大鼠心肌組織裂解物Caspase 3的活性。結(jié)果如圖所示，束縛應激組大鼠心肌組織Caspase 3活性(1063.89±121.66)較對照組大鼠心肌組織Caspase 3活性(204.05±67.86)顯著增高(P<0.05，圖2)，而TSA干預組心肌組織Caspase 3活性(693.63±118.09)較束縛應激組顯著降低(P<0.05，圖2)，結(jié)果表明TSA干預可以顯著降低束縛應激引起的心肌組織細胞凋亡。

2.4 心肌組織Nagar Olsen染色

Nagar Olsen染色能反映心肌的早期損傷。用特異堿性復紅染色方法使早期損傷的心肌細胞著色，損傷心肌呈紅色，正常心肌呈黃色或黃棕色，細胞核呈藍色。染成紅色的組織為損傷部位，紅色范圍的大小及顏色的輕重可以代表損傷程度。如圖所示，Nagar-Olsen染色結(jié)果表明，大鼠經(jīng)過6 h/d的束縛應激，3周后心肌紅色染色范圍明顯增加，表明出現(xiàn)明顯的心肌損傷(圖3B)。而用TSA干預束縛應激大鼠，心肌損傷程度明顯減弱，結(jié)果表明，TSA干預可以降低束縛應激引起的心肌損傷(圖3C)。

Fig. 3 Effect of TSA intervention on the stress-induced myocardial injury (Nagar olsen ×200) A: Control group; B: Restraint stress group; C: TSA intervention during restraint stress

3 討論

應激(stress)是機體對生存環(huán)境中多種不利因素適應過程中，實際上或認知上的要求與適應和應付能力之間不平衡導致的心身緊張狀態(tài)及其反應。適度應激可以提高機體對不良外界因素的抵抗能力，并實現(xiàn)機體對外界環(huán)境的代償性的適應；而長期或過高強度應激則會使機體發(fā)生適應不良，引起多種疾病的發(fā)生。目前的研究已經(jīng)證實，高強度的心理應激可以引起神經(jīng)精神疾病、心腦血管疾病、自身免疫性疾病、腫瘤及內(nèi)分泌疾病等多種重大致死性疾病的發(fā)生[4-6]。因此，研究應激致心肌損傷的機制及其保護性干預措施對于預防應激性疾病的發(fā)生具有重要意義。

表觀遺傳學(epigenetics)是不涉及DNA 序列改變的可遺傳的基因表達變化研究， 包括DNA甲基化、組蛋白共價修飾、非編碼RNA等。在表觀修飾的各種形式中， 組蛋白的共價修飾具有重要作用，它能夠調(diào)節(jié)基因的表達調(diào)控。組蛋白的共價修飾包括組蛋白的磷酸化、乙酰化、甲基化修飾等，組蛋白乙?；叭ヒ阴；揎検墙M蛋白共價修飾的最重要的方式，組蛋白的乙?；娇梢灾苯佑绊懴嚓P基因的表達調(diào)控[1]，這種可逆的組蛋白的動態(tài)修飾是由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶( HAT) 和組蛋白乙酰化酶(HDACs)共同催化。組蛋白的乙?；潭扰c轉(zhuǎn)錄活性密切相關：轉(zhuǎn)錄活動區(qū)域核心組蛋白的乙?；芏雀?，而不活動區(qū)域乙酰化密度低[1]。HAT能夠促進染色體的解聚，激活轉(zhuǎn)錄；而HDACs則封閉DNA抑制轉(zhuǎn)錄過程。研究表明，組蛋白去乙酰化酶在心肌肥大、心肌損傷、血管重塑等心血管疾病中有重要調(diào)節(jié)作用，而組蛋白去乙?；敢种苿┛梢燥@著改善這些心血管疾病的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)組蛋白的乙?；皆趹ぶ滦募p傷過程中顯著降低，提示組蛋白去乙?；冈趹ば孕募p傷中具有重要作用，而用組蛋白去乙酰化酶的廣譜抑制劑TSA干預束縛應激大鼠， TSA可以顯著抑制應激性心肌損傷過程中的組蛋白乙酰化水平降低，進而抑制束縛應激所引起的心肌損傷的發(fā)生，結(jié)果表明，組蛋白去乙?；冈趹に碌男募p傷中有重要作用。

以前有研究表明，心肌酶活性是心肌損傷的重要特征[7]，而本課題組以往的研究表明，線粒體介導的細胞凋亡也是應激所致心肌損傷的重要特征[8-10]。據(jù)報道，組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA可以抑制線粒體凋亡為特征的Caspase 3酶活性升高，表明組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA可以抑制以線粒體介導的細胞凋亡為特征的心肌損傷，本研究證實TSA可以抑制應激引起的以線粒體為特征的心肌損傷的發(fā)生?？赡茉蛟谟冢簯た梢砸饳C體神經(jīng)內(nèi)分泌的變化，過度分泌的相關激素通過一系列信號轉(zhuǎn)導機制引起心肌組蛋白乙?；腿ヒ阴；氖Ш?，引起相關基因表達的紊亂，進而引起心肌功能的失調(diào)，引發(fā)心肌損傷。

本研究初步證實了組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA可以抑制以線粒體介導的細胞凋亡為特征的線粒體損傷，為應激性心肌損傷的防護提供了一種新的可能的干預措施。但是，究竟是哪種組蛋白去乙?；冈趹に滦募p傷中發(fā)揮作用，這種組蛋白去乙酰化酶在應激所致心肌損傷的作用機制是什么，都有待進一步研究闡明。

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Protective effects of histone deacetylase inhibitor on stress-induced myocardial injury in rats

WU Lei, LIU Xiao-hua, WANG Tian-hui, DUAN Rui-feng, ZHOU Xue-si, LIU Hong-tao, ZHANG Zhi-qing△

(Institute of Health and Environmental Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Tianjin 300050, China)

Objective: To observe the protective effects of histone deacetylase inhibitor on stress-induced myocardial injury. Methods: Healthy male Wistar rats were randomly divided into 3 groups(n=6), and the stress-induced myocardial injury model was established with chronic restraint stress method. The protective effects of histone deacetylase inhibitor on stress-induced myocardial injury were observed with Trichostatin A (TSA) intervention. Histone acetylation levels in myocardium of rats were detected by Western blot method, spectrophotometry method was used to dynamically determine the activity of rat serum lactate dehydrogenase (LDH), serum creatine kinase isoenzyme -MB (CK-MB) and Caspase 3, and nagar Olsen staining were used to observe the early myocardial damage. Results: Restraint stress could significantly reduce the level of histone acetylation of myocardium in rats, and TSA intervention could inhibit the stress-induced reduction of myocardial levels of histone acetylation. Restraint stress could cause the significant increase of serum LDH activity (P<0.05), serum CK-MB activity (P<0.05), and the Caspase 3 activity of myocardial tissue (P<0.05), and early myocardial damage also occurred during restraint stress. TSA intervention could significantly reduce the serum LDH activity (P<0.05), the serum CK-MB activity (P<0.05), the activity of myocardial tissue caspase 3 induced by restraint stress (P<0.05), and the stress-induced myocardial injury was also attenuated by TSA intervention. Conclusion: The histone deacetylase inhibitor TSA can protect stress-induced myocardial injury.

histone deacetylase inhibitor; restraint stress; myocardial injury; rat

國家自然科學基金青年項目(81302415);天津市應用基礎及前沿技術研究計劃(12JCYBJC15800)

2014-11-18

2015-02-26

R331.3

A

1000-6834(2015)03-193-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.001

△【通訊作者】Tel: 13752585610; E-mail: camelhuifeng@126.com