楊慧倫綜述 張宗峰審校

綜 述

人乳頭瘤病毒16型E5蛋白的生物學活性研究進展

楊慧倫綜述 張宗峰審校

人乳頭瘤病毒16型；E5蛋白；生物學活性；宮頸癌

宮頸癌發(fā)病率位于女性腫瘤的第3位，全球每年有約27萬女性死于宮頸癌[1]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)持續(xù)感染是宮頸癌的主要危險因素，90%以上的宮頸癌伴有高危型HPV感染。HPV是一種乳頭瘤空泡病毒，為球形DNA病毒，能引起皮膚黏膜的鱗狀上皮增殖。目前已分離出130多種HPV，根據(jù)其致癌危險性不同可分為低危型(low-risk human papilloma virus, LR-HPV)和高危型(high-risk human papilloma virus, HR-HPV)兩大類。其中，HR-HPV除可引起生殖器疣病外，更重要的是還可引起外生殖器癌、高度宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)和子宮頸癌[2]，較常見的是HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35等，而又以HPV16最普遍, 部分地區(qū)宮頸癌組織中HPV16檢出率可高達77．6%～82．6%。HPV16感染宮頸上皮基底層細胞后病毒基因組復制，并以游離體形式引發(fā)宮頸上皮內(nèi)瘤變，然后以結(jié)合體形式整合到宮頸上皮細胞基因組中，進而使原癌基因過度表達、抑癌基因失活，最終導致宮頸細胞癌變。HPV16基因可編碼9個開放閱讀框架，根據(jù)其功能不同可分為：早期區(qū)(E)、晚期區(qū)(L)和非編碼區(qū)(NCR)，其中早期區(qū)(E)共編碼E1-E7共7個蛋白，它們共同參與病毒復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯及細胞轉(zhuǎn)化等[3]。對E6和E7蛋白的致癌作用已有較深入的研究，它們分別與p53和Rb蛋白結(jié)合使其降解，導致細胞周期失調(diào)、無限增殖而呈永生化，最終形成腫瘤[4]。然而對E5蛋白的致癌作用研究相對較少。本文將結(jié)合最近研究對E5蛋白的生物學活性進行綜述如下。

1 HPV16 E5蛋白的生物學活性

HPV16 E5蛋白是由83個氨基酸組成的一種較小的疏水膜蛋白，處于E2開放閱讀框架下游。HPV16型E5蛋白有廣泛的序列相似性和共同的特征，即都有較高疏水性的氨基端和親水性的羧基端。其中，氨基端疏水結(jié)構域與其在細胞膜的插入位置有關，它通過與表皮生長因子受體(EGFR)、血小板生長因子受體等相互作用，引起病毒生物學活性改變。將羧基端部分注射至休止細胞，能夠誘導細胞DNA 合成，尤其是羧基端的2個半胱氨酸(Cys)殘基，能明顯誘導細胞DNA合成，這說明親水羧基端是E5產(chǎn)生細胞轉(zhuǎn)化所必需的部分[5]。在轉(zhuǎn)化細胞中，E5形成同源二聚體后主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，少量分布于細胞質(zhì)膜。

Liao等[6]通過免疫組化法對宮頸病變組織標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)E5蛋白在CIN I、CIN II、CIN III和宮頸鱗狀細胞癌中表達率分別為93.33%、86.96%、66.66%和12.00%，提示在宮頸病變早期存在豐富的E5蛋白表達，但并不是所有的宮頸病變都存在E5蛋白的過表達, 表明它不是形成惡性腫瘤必要條件。在HPV16感染的宮頸病變早期，E5蛋白mRNA含量較高，而到宮頸病變晚期常因HPV整合入宿主細胞基因組而使E5蛋白表達缺失，這表明E5蛋白可能在宮頸癌發(fā)病早期有一定作用。Maufort等[7]建立了高危型HPV16蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠模型，定量檢測上皮細胞永生化水平，證實有E5協(xié)同作用時，細胞的永生化能力提高了4～10倍，腫瘤的進展明顯；而單獨用E5蛋白基因轉(zhuǎn)染小鼠時，延長其作用時間，也能夠發(fā)生癌變，提示E5蛋白存在一定的致癌作用。

2 HPV16 E5蛋白的機制作用

2.1 E5蛋白激活EGFR信號通路 EGFR在多種良、惡性腫瘤中存在過度表達，其過表達與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預后密切相關，應用EGFR抑制劑可明顯抑制腫瘤生長。研究證實，E5蛋白能夠以配體依賴的形式激活EGFR信號通路，刺激細胞的增殖及分化，增加腫瘤發(fā)生的風險[8]。在上皮細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染E5蛋白并用EGF處理，發(fā)現(xiàn)EGFR磷酸化明顯增強，然而EGFR的數(shù)量并不是在所有細胞中均增加。用結(jié)合有對pH敏感熒光劑的EGF處理細胞并進行追蹤，發(fā)現(xiàn)EGFR磷酸化增強的主要機制是抑制胞內(nèi)體融合進而抑制其酸化。此外，轉(zhuǎn)染人上皮細胞還發(fā)現(xiàn), E5蛋白能夠綁定V-ATP酶16kD的c亞基，抑制V-ATP酶的酸化作用，為胞內(nèi)創(chuàng)造堿性環(huán)境并激活EGFR。

最新研究表明，E5蛋白還能以非配體依賴的形式激活EGFR，活化絲裂原活化蛋白激酶—胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MAPK-ERK1/2)。MAPK的激活主要通過2種途徑：(1)為激活酪氨酸激酶調(diào)節(jié)受體途徑；(2)為蛋白激酶C(PKC)依賴途徑。ERK1/2的激活主要通過山梨醇依賴途徑，用山梨醇糖處理E5蛋白轉(zhuǎn)染的細胞，使其形成一種高滲透壓沖擊波，發(fā)現(xiàn)ERK1/2途徑被激活，該作用僅部分被特異性EGFR抑制劑AG1478抑制，間接證明了E5蛋白在對EGFR的激活途徑存在非配體依賴途徑[8]。

c-Cbl(c-Casitas B-lineage lymphoma)基因編碼的c-Cbl蛋白在細胞增殖分化中具有重要作用，c-Cbl基因突變可影響信號轉(zhuǎn)導通路。實驗發(fā)現(xiàn)在E5蛋白轉(zhuǎn)染的細胞中，c-Cbl的下降水平與EGFR及其泛素化升高水平成正比，提示E5蛋白可能通過抑制c-Cbl減少EGFR的降解，從而促進EGFR介導的信號轉(zhuǎn)導，促進細胞增殖作用。E5蛋白還可以通過其羧基末端介導胞內(nèi)核小體堿化, 延緩EGFR的降解而增加細胞表面受體循環(huán)量和活性。

E5蛋白除了能激活EGFR外，對Erb家族其他成員也有一定影響。實驗證明，在E5蛋白轉(zhuǎn)染的細胞中，Erb2、Erb4的活性存在不同程度的改變，但具體機制不詳。此外E5蛋白對與G蛋白耦聯(lián)的內(nèi)皮素受體(ET-A)通路也有一定干預，在缺乏生長因子的角質(zhì)細胞中，E5蛋白的出現(xiàn)能明顯增強ET的作用，進而刺激細胞有絲分裂，導致細胞大量增殖、分化，增加腫瘤發(fā)生的風險。

CD1d和CD1d限制性自然殺傷T細胞是先天性免疫和適應性免疫反應之間的橋梁，許多病毒能下調(diào)CD1d水平而使感染的宿主細胞能逃避免疫監(jiān)視。大量體內(nèi)外實驗證實，在HPV陰性的上皮組織中CD1d的免疫活性明顯較強，而在HPV16陽性的CIN上皮組織中明顯減弱。在HPV陰性的宮頸癌C-33A細胞系中建立CD1d的免疫模型后轉(zhuǎn)染E5蛋白，發(fā)現(xiàn)CD1d水平下降，應用共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中E5蛋白能夠與調(diào)節(jié)CD1d的鈣連蛋白結(jié)合，使其積聚于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，使病毒感染的細胞逃避宿主的免疫監(jiān)視及免疫清除作用[13]。

2.3 E5蛋白對炎細胞通路的激活 環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)在CIN及宮頸癌中均存在過度表達。研究表明，COX-2宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移密切相關，應用COX-2抑制劑可明顯抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，提示COX-2可能與宮頸癌預后及治療方案的制定有指導意義[17]。HPV16 E6、E7能增強COX-2啟動子中AP-1活化蛋白對環(huán)磷酸腺苷反應因子(cAMP reaction element, CRE)的綁定作用，使COX-2的過度表達。研究證實，E5蛋白對于COX-2的表達也有一定作用，E5蛋白能激活EGFR通路，增強NF-κB和AP-1的綁定作用，從而上調(diào)COX-2的表達水平，不同于E6、E7的是，E5蛋白調(diào)節(jié)COX-2是通過NF-κB發(fā)揮作用的。

前列腺素E2(PGE2)是COX-2的主要產(chǎn)物，其表達水平與多種腫瘤惡性程度呈正相關，可影響細胞增殖分化、血管生成及腫瘤細胞遷移和擴散等。PGE2的受體在腫瘤組織中存在異常表達，該受體有4種亞型(EP14)，不同亞型與配體結(jié)合的親和力不同而在下游信號轉(zhuǎn)導通路中產(chǎn)生不同效應，其中EP-4受體在乳腺及腸道腫瘤中已被證實與腫瘤進展相關。實驗證實，E5蛋白通過COX-2的過度表達來促進PGE2的分泌。PGE2的激活加強了環(huán)磷酸腺苷反應因子結(jié)合蛋白對CRE的綁定作用，進而激活EP-4受體基因的啟動子，促進EP-4受體的表達。此外，E5蛋白還可以通過激活EGFR來上調(diào)EP-4的水平。應用AG1478(EGFR抑制劑)和NS-398(COX-2抑制劑)分別處理宮頸癌C-33A細胞，發(fā)現(xiàn)EP-4水平下降，證實E5蛋白對EP-4受體的激活作用與EGFR和COX-2信號通路有關。

2.4 E5蛋白對血管內(nèi)皮生成因子的上調(diào)作用 血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)家族的不同成員對腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移有重要影響，其過表達直接導致腫瘤細胞的擴散和轉(zhuǎn)移。研究表明，VEGF蛋白表達與宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移和脈管轉(zhuǎn)移明顯相關[17]。HPV16型E6、E7已被證實通過HIF-1α依賴途徑激活VEGF。研究證實，E5蛋白對于VEGF也有一定影響。在HEK293、HaCaT 和HT-3 等多種宮頸癌細胞系中轉(zhuǎn)染E5蛋白，發(fā)現(xiàn)各細胞系中均存在VEGF過表達，提示E5蛋白對于VEGF上調(diào)作用存在普遍性。為進一步研究E5蛋白對VEGF的調(diào)節(jié)機制，分別用EGFR、MEK-ERK1/2及PI3K/Akt抑制劑處理細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VEGF啟動子的活性受到抑制，其表達也明顯降低，提示E5蛋白對VEGF的上調(diào)作用與EGFR、ERK1/2及PI3K-Akt傳導途徑的激活有關。

2.5 E5蛋白的抗凋亡作用 研究表明，E5蛋白能夠通過多種途徑抑制細胞凋亡[18]，延長細胞壽命致其永生化，使已經(jīng)發(fā)生癌變的及有明顯癌變傾向的細胞壽命延長、堆積，從而形成癌性腫塊。B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)是細胞凋亡中最重要的癌基因之一，其前體蛋白Bax、Bak的下調(diào)能抑制細胞凋亡。在人宮頸癌C-33A細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染E5蛋白能激活泛素蛋白酶體通路，從而縮短Bax的半衰期，使Bax表達明顯降低。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Bax的mRNA含量并無明顯改變，提示E5蛋白主要是從翻譯水平下調(diào)Bax含量，從而抑制細胞凋亡[19]。E5蛋白還可通過抑制細胞凋亡蛋白酶-3(CAS-3)及細胞色素c(cyt-c)釋放入胞液，來抑制過氧化氫(H2O2)介導的細胞凋亡。

Fas及其配體FasL是細胞凋亡的膜表面分子，其水平下降導致細胞凋亡程序的阻斷。在HaCaT 細胞中轉(zhuǎn)染E5蛋白，應用早、晚期監(jiān)測半胱氨酸蛋白酶-3的裂解和DNA片段法對細胞凋亡進行評價，發(fā)現(xiàn)Fas表達減少，證實E5蛋白能夠削弱降低Fas-FasL之間作用及腫瘤促凋亡因子配體(TRAIL)數(shù)量，抑制細胞凋亡。此外，E5蛋白還能激活PI3K和ERK1/2途徑，使細胞免于受到紫外線等物理刺激所引發(fā)的凋亡。

2.6 E5蛋白對抑癌基因的抑制作用 P21和P27是2種細胞周期蛋白激酶抑制物(cyclin-dependent protein kinases inhibiter, CKI)，E5蛋白對它們有抑制作用。E5蛋白可在轉(zhuǎn)錄水平抑制p21的表達，使p21啟動子處于失活狀態(tài)，使細胞永生化。E5蛋白能縮短p27 Kip1的半衰期，加速p27 Kip1的降解，使細胞進入S期，逃避細胞凋亡而呈永生化。此外，HPV16 E5蛋白還能影響原癌基因c-jun的活性，在轉(zhuǎn)錄水平影響p21Wafl/Sdil/Cipl的表達，導致細胞周期調(diào)控失調(diào)，細胞永生化[20]。研究顯示，E5蛋白與EGF同時存在時，對p27 Kip1抑制作用更加明顯，而當存在EGFR抑制劑作用時，這種抑制效應則消失，提示E5蛋白對抑癌基因的抑制作用可能與EGFR信號通路有關。

2.7 E5蛋白對細胞核形態(tài)及大小的影響 Hu等[21]在HaCaT上皮細胞中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染E5蛋白并在顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測細胞分裂及體積變化，發(fā)現(xiàn)E5高表達的細胞存在細胞核增大及有絲分裂速度加快等現(xiàn)象。對核消除至細胞分裂間期進行監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)細胞核體積改變與有絲分裂進程無關，且細胞融合后核質(zhì)并未融合，提示E5高表達導致的核增大與細胞間融合無關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，用羥基脲培養(yǎng)細胞來抑制DNA的合成可使核增大的現(xiàn)象消失，證實E5蛋白高表達主要是通過核內(nèi)復制來增大細胞核體積。此外，最新研究表明HPV16 E5蛋白表達是雙核細胞形成的必要和充分條件[22]。盡管E5蛋白誘導的大多數(shù)雙核細胞不能繁殖，但共表達E6和E7基因可促進這些細胞繁殖，進而增加雙核細胞的形成率。此過程可能使細胞基因組不穩(wěn)定，導致細胞不斷增殖而形成腫瘤。

2.8 E5蛋白對上皮間質(zhì)化的作用 上皮間質(zhì)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是細胞上皮細胞極性喪失和間質(zhì)細胞特性獲得為表現(xiàn)，伴隨多個分子標志物改變，例如上皮細胞標志物E鈣黏蛋白(E-cadherin)等表達下調(diào)及間質(zhì)細胞標志物Vim-1、Snail及Twist等表達上調(diào)，與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關。實驗證實，HPV16癌蛋白能和成纖維生長因子(fibroblast growth factor, FGF)協(xié)同作用，抑制E-cadherin及激活Vim-1來促進EMT，進而增強腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[23]。在此基礎上，Rehana對E5蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)HPV16 E5蛋白能使成纖維生長因子受體2b(fibroblast growth factor recepter 2b, FGFR2b)轉(zhuǎn)換為FGFR2c，這種轉(zhuǎn)變所導致細胞應答及配體特異性改變促進上皮細胞失去上皮表型，獲得降解細胞外基質(zhì)能力等間質(zhì)表型[24]，使腫瘤細胞獲得遷移和侵襲能力。

3 小 結(jié)

盡管HPV16型E5蛋白很多的致病機制尚不明確，但不可否認的是，它作為一種病毒致病基因在宮頸癌早期病變中發(fā)揮一定作用。HPV16 E5蛋白除了能激活相關信號通路及抑制免疫反應外，還能對腫瘤血管、上皮間充質(zhì)化、細胞凋亡及細胞核形態(tài)等多方面發(fā)揮顯著作用。未來，針對HPV16 E5蛋白的深入研究可能為宮頸癌早期防治及靶向治療的提供重要理論依據(jù)，具有廣闊的臨床應用前景。

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黑龍江省自然科學基金面上項目(No.200906)；黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(No.2009-112)；哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院 博士科研基金項目(No.BS2009-15)

150001 哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院婦科腫瘤科

張宗峰，E-mail：viaac1973@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.10.029

2015-01-08)