李雪飛，江洪，胡笑容，馬瑞松

論著·基礎(chǔ)

橙皮苷對大鼠心肌缺血/再灌注損傷誘導自噬的影響機制研究

李雪飛，江洪，胡笑容，馬瑞松

目的 探討橙皮苷對大鼠心肌缺血/再灌注損傷誘導的心肌細胞自噬的影響及其可能機制。方法 24只雄性SD大鼠隨機均分為假手術(shù)組、缺血/再灌注(I/R)組及橙皮苷組，每組8只。假手術(shù)組予0.5%羧基纖維素鈉灌胃3 d后，開胸暴露冠狀動脈左前降支(LAD)，并不結(jié)扎，I/R組及橙皮苷組予以阻斷LAD血流30 min后再灌注4 h，建立大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型。術(shù)后，檢測大鼠血清中肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)，心肌組織中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及自噬蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(LC3Ⅱ)和Beclin1的水平。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠血清中CK及LDH水平均顯著升高，心肌組織SOD活性顯著降低，MDA含量顯著升高(P均<0.05)；與I/R組比較，橙皮苷組大鼠血清中CK及LDH水平明顯降低，心肌組織SOD活性顯著升高，MDA含量明顯降低(P均<0.05)。與假手術(shù)組比較，I/R組大鼠心肌組織LC3Ⅱ及Beclin1表達水平顯著增高，與I/R組比較，橙皮苷組上述2項指標表達水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 橙皮苷可抑制心肌缺血/再灌注損傷誘導的心肌細胞自噬，其機制與橙皮苷減輕氧化應激相關(guān)。

橙皮苷；心肌缺血再灌注損傷；自噬；氧化應激；大鼠

對于急性心肌梗死患者，再灌注治療是拯救缺血心肌及改善臨床預后的最佳手段。而再灌注本身可使尚存活的心肌細胞死亡，進而加重心肌損傷[1]。自噬作為維持細胞穩(wěn)態(tài)的一種自我保護機制，在生理情況下可降解及再利用老化的長壽蛋白質(zhì)及膜包被的細胞器[2]。然而過度的自噬可溶解正常的蛋白質(zhì)及細胞器，導致細胞死亡[3]。研究表明，自噬在心肌缺血/再灌注損傷中有著重要的作用[4]。在心肌缺血期間，自噬可降解無重要功能的蛋白質(zhì)為細胞的生命活動提供能量，起到保護心肌的作用；而在再灌注期間，自噬可被過度激活從而導致細胞損傷及死亡，進而加重心肌缺血/再灌注損傷[5]。

橙皮苷屬于黃烷酮類化合物，在橘柑類的水果中含量豐富，具有抗氧化、抗炎、抗電離輻射等多重生物活性[6～8]。有研究報道，橙皮苷可減輕心肌缺血/再灌注損傷，表現(xiàn)為抑制心肌細胞凋亡及減輕氧化應激，但其對自噬的影響目前尚未見報道[9，10]。故本實驗旨在探討橙皮苷在心肌缺血/再灌注期間對自噬的作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物：SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量200～250 g，購于武漢大學動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境維持25℃、黑暗與照明各交替12 h。術(shù)前12 h禁食、不禁飲。(2)主要試劑：橙皮苷(HPLC>90.0 %)及羧基纖維素鈉(購于國藥集團化學試劑有限公司)，戊巴比妥鈉(購于美國Sigma公司)。主要儀器：Biopac多導生理記錄儀、計算機圖像分析系統(tǒng)(Image-Pro Plus3.0，Media Cyerneties公司)，熒光顯微鏡(BX53，中國奧林巴斯有限公司)。

1.2 動物模型建立及分組 (1)建立模型： 0.5%羧基纖維素鈉或橙皮苷混懸液灌胃3 d后，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，將其固定于解剖臺，氣管插管，連接動物呼吸機通氣(70次/min)，連續(xù)監(jiān)測肢體II導聯(lián)的心電圖。左胸廓切開術(shù)暴露心臟，剪開心包膜，在肺動脈圓錐與左心耳下緣之間找到左前降支(LAD)，將5-0絲線用手術(shù)彎針穿至LAD下，結(jié)扎處放置微小塑料管。阻斷LAD 30 min后，剪斷結(jié)扎線，取出塑料管，再灌注4 h。造模成功標準：缺血時肢體II導聯(lián)ST段抬高及心臟表面變蒼白或紫紺，再灌注后ST段回落1/2以上，心臟表面蒼白或紫紺區(qū)變紅。(2)實驗分組：24只大鼠隨機均分為假手術(shù)組、缺血/再灌注(I/R)組及橙皮苷組，每組8只。假手術(shù)組：0.5%羧基纖維素鈉灌胃3 d后，只穿線，不結(jié)扎[11]；I/R組：0.5%羧基纖維素鈉灌胃3 d后，阻斷LDA 30 min，再灌注4 h；橙皮苷組：0.5%羧基纖維素鈉與橙皮苷(200 mg/kg)混懸液灌胃3 d后，阻斷LAD 30 min，再灌注4 h[12]。

1.3 觀測指標 術(shù)后大鼠均取頸靜脈血離心，取上清液備用；取出心臟，剪取左心室缺血區(qū)心肌組織存于-80℃冰箱備用。

1.3.1 血清心肌酶的測定： 大鼠再灌注后，經(jīng)頸靜脈采血2 ml，3 000 r/min離心15 min，收集上清液，采用全自動生化分析儀測定血清中肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)含量(試劑盒購于南京建成生物工程研究所)。

1.3.2 心肌組織氧化應激指標的測定: 冰凍缺血區(qū)心肌組織勻漿，4 000 r/min離心，取上清液。根據(jù)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)說明書步驟檢測超氧化物歧化酶(SOD)的活力及丙二醛(MDA)的含量。

1.3.3 心肌組織自噬蛋白檢測: 冰凍缺血區(qū)心肌組織勻漿，取適量組織裂解液提取心肌組織總蛋白，BCA法檢測總蛋白濃度。取50 μg總蛋白上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE分離，4℃下恒壓轉(zhuǎn)膜，室溫下用含5%脫脂奶粉TBST封膜2 h，加入抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)抗體(稀釋1∶1 000)或抗Beclin1(稀釋1∶1 000)(皆購于美國Cell Signaling Technology 公司)，4℃孵育過夜；TBST充分洗膜，加入辣根過氧化酶標記二抗，室溫孵育2 h；漂洗后滴加適量化學發(fā)光(ECL)底物液，孵育數(shù)分鐘后常規(guī)顯影。使用計算機圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，磷酸甘油醛胱氫酶(GAPDH)標準化待測蛋白的表達。

1.3.4 免疫熒光法觀察心肌組織LC3 II表達: 10%甲醛固定心肌，石蠟包埋后切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟、抗原修復、血清封閉后，滴加鼠抗兔抗LC3 II抗體(稀釋1∶100)(購自美國Cell Signaling Technology 公司)，4℃孵育過夜；PBS沖洗玻片后，滴加熒光標記的羊抗兔IgG(購自武漢博士德生物工程有限公司)，濕盒中37℃孵育1 h。在暗室中滴加細胞核染色劑4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，購自中國碧云天生物公司)孵育5 min，PBS沖洗后擦干封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。其中細胞核呈藍色，LC3 II呈綠色。

2 結(jié) 果

2.1 血清心肌酶水平 與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠血清中CK及LDH水平均顯著升高(t=-4.273、-7.894，P均<0.05)，提示再灌注后心肌損傷加重；而橙皮苷組大鼠血清中CK及LDH的水平明顯低于I/R組(t=4.179、6.430，P均<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清心肌酶CK及LDH的變化

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與I/R 組比較，bP<0.05

2.2 心肌組織SOD及MDA水平 與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠心肌組織SOD的活性顯著降低,而MDA含量顯著升高(t=10.097、-6.863,P均<0.05)，表明心肌缺血/再灌注后心肌組織氧化應激反應增高。與I/R組比較，橙皮苷組SOD活性顯著升高且MDA含量降低(t=-11.062、7.974，P均<0.05)。見表2。

表2 3組大鼠心肌組織SOD及MDA的變化

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與I/R 組比較，bP<0.05

2.3 心肌組織LC3II及Beclin1 與假手術(shù)組大鼠心肌組織Beclin1(0.108±0.026)及LC3II(0.136±0.013)的表達水平比較，I/R組大鼠心肌組織Beclin1(0.518±0.050)及LC3II(0.517±0.062)的表達水平顯著增高(t=-18.919、-14.560，P均<0.05)，提示再灌注后缺血心肌自噬增強。與I/R組比較，橙皮苷組大鼠心肌組織Beclin1(0.198±0.019)及LC3II(0.234±0.034)的表達水平明顯低于I/R組(t=17.489、10.815，P均<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織Beclin1及LC3II的表達變化

2.4 心肌組織LC3II表達 假手術(shù)組大鼠心肌組織LC3II的表達極少，幾乎不可見；I/R組大鼠心肌組織可見大量的LC3II表達，提示缺血/再灌注后心肌自噬被顯著激活。而橙皮苷組大鼠心肌組織LC3II的表達明顯低于I/R組。圖2見封3。

3 討 論

正常情況下，自噬在心肌細胞中處于低水平狀態(tài)，起著維持細胞穩(wěn)態(tài)的作用。而在心肌缺血/再灌注損傷中，隨著缺血、低氧時間的延長，自噬在心肌缺血期被激活，此時自噬可降解心肌細胞中無重要功能物質(zhì)，給缺血缺氧心肌提供營養(yǎng)物質(zhì)，對心肌細胞起著保護作用；而再灌注期間，自噬進一步增強，過度的自噬可降解心肌細胞中關(guān)鍵成分，引發(fā)心肌細胞結(jié)構(gòu)及功能障礙，促進心肌細胞死亡[5]。故自噬在心肌缺血/再灌注損傷中有著重要的作用。Beclin1是自噬體形成過程中不可或缺成分，而LC3則直接參與自噬體的形成[13]，Beclin1和LC3的表達越多則表明自噬越強。在本實驗中，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠心肌組織自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表達顯著增加，且這種變化在心肌組織LC3B熒光染色中得到進一步證實，提示再灌注后心肌組織的自噬顯著增強。同時，I/R組大鼠血清心肌酶CK及LDH的水平也顯著高于假手術(shù)組，提示缺血再灌注后過度自噬可加重心肌細胞損傷，表明自噬在再灌注期間起著心肌損傷作用。

橙皮苷是一種在橘柑類水果中含量豐富的黃烷酮類化合物，近年來因其多樣的生物活性引起了許多研究者的關(guān)注。Huang等[14]報道了在β樣淀粉蛋白誘導的神經(jīng)細胞糖代謝損傷模型中，橙皮苷可下調(diào)自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表達，抑制自噬的激活，改善神經(jīng)細胞糖代謝損傷，促進神經(jīng)細胞的存活。而Saiprasad等[15]研究表明橙皮苷可上調(diào)自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的表達，觸發(fā)結(jié)腸腫瘤細胞自噬，抑制氧化偶氮甲烷誘導的結(jié)腸惡性腫瘤的發(fā)生。在本實驗模型中，與I/R組相比，橙皮苷組大鼠心肌組織LC3Ⅱ和Beclin1的表達顯著下降，且血清CK和LDH的水平也顯著降低，表明橙皮苷可能通過抑制心肌細胞自噬，進而減輕心肌缺血/再灌注損傷。

心肌缺血/再灌注期間誘發(fā)自噬的因素很多，包括低氧、缺血、ATP耗竭、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及氧化應激等[16]。Hariharan等[17]報道了在心肌細胞缺氧/復氧模型中，過氧化氫所致氧化應激損傷可顯著升高自噬蛋白LC3的表達，而巰丙酰甘氨酸(一種抗氧化劑)可顯著減輕氧化應激的同時降低LC3的表達，表明氧化應激可激活自噬，且減輕氧化應激可抑制自噬。SOD作為胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的主要抗氧化酶之一可體現(xiàn)細胞抗氧化的能力，其活性越高則細胞抗氧化能力越高；而MDA作為脂質(zhì)過氧化反應的主要代謝產(chǎn)物反映了脂質(zhì)過氧化反應的嚴重程度，其含量越多則脂質(zhì)過氧化反應越重；兩者皆可作為氧化應激的指標。在本實驗中，與假手術(shù)組相比，I/R組大鼠心肌組織的抗氧化酶SOD活性顯著降低且脂質(zhì)過氧化指標MDA顯著升高，提示再灌注后心肌組織氧化應激嚴重；且同時伴隨著自噬蛋白LC3Ⅱ和Beclin1的增加，提示心肌缺血/再灌注后，氧化應激誘發(fā)自噬的過度激活，與上述文獻結(jié)果一致。Gandhi等[9]報道了橙皮苷在心肌缺血/再灌注模型中可顯著減輕氧化應激，提示橙皮苷具有較強的抗氧化活性。在本實驗中，橙皮苷組大鼠心肌組織SOD的活性顯著增高，MDA的含量明顯降低，同時LC3Ⅱ和Beclin1的表達也顯著降低，提示橙皮苷可能通過抑制氧化應激，進而抑制過度自噬的發(fā)生，從而減輕心肌缺血/再灌注損傷。

綜上所述，橙皮苷可抑制心肌缺血/再灌注損傷誘導的心肌細胞自噬，進而減輕心肌缺血/再灌注損傷，其機制與橙皮苷減輕氧化應激有關(guān)[17～19]。但本研究只觀察了橙皮苷對再灌注時期自噬的影響，而橙皮苷對單純?nèi)毖谧允傻淖饔蒙形搓P(guān)注。另外，橙皮苷抑制心肌缺血/再灌注損傷所誘導自噬的具體分子機制也仍待進一步研究。

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The effects of hesperidin on myocardial ischemia/reperfusion injury induced by autophagy

LIXuefei,JIANGHong,HUXiaorong,MARuisong.DepartmentofCardiology,RenminHospital,WuhanUniversity,HubeiProvince,Wuhan430060,China

Correspondingauthor:JIANGHong,E-mail:jianghwurm@163.com

Objective To investigate the effect of hesperidin on myocardial ischemia/reperfusion injury of myocardial cells induced by autophagy and its possible mechanism.Methods 24 male SD rats were randomly divided into sham operation group, ischemia / reperfusion (I/R) group and hesperidin group with 8 rats in each group. Sham operation group were treated with 0.5% carboxymethylcellulose sodium orally, after 3 days, thoracotomy were performed to expose the left anterior descending coronary artery (LAD) but not ligation, in I/R group and hesperidin group were blocking LAD’s flow for 30 min, then with 4 hours of reperfusion to establish the rat myocardial ischemia / reperfusion injury model. After the operation, detected the serum creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) and autophagy protein, microtubule associated protein 1 light chain 3 II (LC3 II) and Beclin1 level in the myocardial tissue. Results Compared to sham operation group, I/R group rats’ serum CK and LDH levels were significantly increased, SOD activity of myocardial tissue were significantly decreased, MDA content significantly increased (P<0.05), compared with I/R group, hesperidin group’s serum CK and LDH levels significantly decreased, SOD activity of myocardial tissue was significantly increased, MDA content decreased significantly (P<0.05). Compared with the sham group, I/R group rats’ myocardial tissue LC3 II and Beclin1 levels increased significantly, compared with I/R group, hesperidin group’s index expression levels were significantly lower (P<0.05).Conclusion Hesperidin can inhibit myocardial ischemia / reperfusion injury induced cardiomyocyte autophagy, and the mechanism is related with hesperidin reduce the oxidative stress.

Hesperidin; Myocardial ischemia-reperfusion injury; Autophagy; Oxidative stress; Rats

430060 武漢大學人民醫(yī)院心血管內(nèi)科

江洪，E-mail:jianghwurm@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2015.10.024

2015-05-30)