孫艷平 汪興軍 閆平 魚霞（西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021）

大黃具有瀉下攻積、清熱瀉火、活血化瘀等功效,現(xiàn)代研究表明，大黃中含有蒽醌衍生物、苷類化合物、鞣質(zhì)類、有機(jī)酸、揮發(fā)油、多糖等化學(xué)成分，同時(shí)具有抗菌抗病毒、抗炎祛痰、瀉下、保護(hù)胃黏膜、保肝利膽、利尿改善腎功能、降血壓、降脂減肥、抗腫瘤等藥理作用[1]。

目前,對(duì)大黃的活性組分離提取純化的研究較多，如明膠沉淀法、聚酰胺法、葡聚糖凝膠法等，但這些方法操作過(guò)程復(fù)雜，處理能力有限、成本高。近年來(lái)，大孔吸附樹脂技術(shù)由于操作簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)，在中藥的提取、分離純化方面得到了廣泛的應(yīng)用，不斷的受到研究學(xué)者的重點(diǎn)關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究D101樹脂對(duì)大黃蒽醌類組分的吸附性能和純化工藝，而獲得較高純度的組分，從而為大黃蒽醌類組分的分離純化提供參考。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器

Agilent 1220型高效液相色譜儀 （安捷倫科技有限公司），KQ-250B型超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司），電子天平（北京科學(xué)儀器有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000A（鞏義市予華儀器有限公司），SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 試劑與試藥

大黃素對(duì)照品 （中國(guó)藥品生物制品檢定所）；D101大孔吸附樹脂；磷酸、乙醇、甲醇、鹽酸、三氯甲烷（均為分析純），色譜甲醇；水為娃哈哈純凈水；大黃藥材購(gòu)自西安市萬(wàn)壽路藥材市場(chǎng),經(jīng)鑒定為蓼科植物唐古特大黃Pheum tanguticum Maxim.ex Balf.的干燥根及根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 大黃提取液的制備

稱取50g大黃粗粉，加入10倍量80%的乙醇回流提取3次，每次0.5h，濾過(guò)，合并濾液，濾液減壓回收乙醇，最終得180mL濃縮液，相當(dāng)于0.278g/mL的生藥材。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密量取大黃提取液0.6mL，加入8%鹽酸液10mL，超聲2min，再加入三氯甲烷10mL加熱回流1h，放冷，置分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液層用三氯甲烷萃取3次，每次10mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑，殘?jiān)蛹状既芙舛ㄈ葜?0mL容量瓶中，即得[2]。

2.1.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取0.001g大黃素，用甲醇溶解后定容至10mL，制成100ug/mL的大黃素對(duì)照品溶液。

2.2 含量測(cè)定方法[3]

2.2.1 色譜條件 色譜柱：UltisIlTMXB-C18(10×250mm,5um)；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（80：20）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流速：1mL/min；柱溫：室溫。在此條件下，大黃素的分離良好。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及線性范圍的考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液 4.0uL、8.0uL、10.0uL、12.0uL、16.0uL、20uL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件注入液相色譜儀中，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣量X（ug）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如下：

表-1 大黃素線性關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

得標(biāo)準(zhǔn)曲線A=507.24X-0.4699，R=0.9998（n=6），表明大黃素在0.2ug-2.0ug范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

2.3 大黃總蒽醌的分離與純化工藝

2.3.1 大孔吸附樹脂的預(yù)處理用適量蒸餾水漂洗，再用95%乙醇浸泡24小時(shí)，然后用蒸餾水將樹脂沖洗至無(wú)醇味，用2倍于樹脂體積的5%鹽酸浸泡2小時(shí)，用蒸餾水沖洗至中性；再用2倍樹脂體積的5%氫氧化鈉浸泡2小時(shí)后用水洗至中性，備用。

2.3.2 測(cè)定靜態(tài)的吸附量[4-6]取5mL預(yù)處理過(guò)的D101樹脂，置100mL具塞錐形瓶中，量取10mL大黃提取液，加入錐形瓶中，每間隔30 min振蕩3 min（6次），放置過(guò)夜，過(guò)濾，吸取濾液少量，對(duì)濾液和上樣液進(jìn)行HPLC測(cè)定大黃素含量，計(jì)算吸附量為0.4048mg/mL吸附率為80.31%。

2.3.3 測(cè)定動(dòng)態(tài)的吸附量[4-6]取5mL預(yù)處理過(guò)的D101樹脂，濕法裝柱（20cm×1.5cm）,量取10mL大黃提取液上柱，流速1mL/min，收集流出液，用HPLC法測(cè)流出液中大黃素的含量，計(jì)算吸附量為0.3816mg/mL吸附率為72.26%。

2.3.4 上樣液濃度對(duì)吸附量的影響[4-6]取4份5mL預(yù)處理過(guò)的D101樹脂分別裝柱（20cm×1.5cm），分別加入含生藥量為0.1315、0.0658、0.044、0.0329g/mL大黃提取液各20mL，調(diào)節(jié)流速為lmL/min，分別收集流出液，用HPLC法測(cè)流出液大黃素有含量，計(jì)算吸附量和吸附率。結(jié)果見表2。

表2 上樣液濃度對(duì)吸附量的影響

結(jié)果表明，在大黃提取液濃度較低時(shí)，樹脂的吸附能力隨著提取液濃度的降低而降低。當(dāng)提取液濃度為0.0658g/mL時(shí)，吸附率最高，所以選擇此濃度。

2.3.5 泄露曲線的考察[4-6]取20mL預(yù)處理過(guò)的D101樹脂吸附裝柱（20cm×1.5cm）,以濃度為0.0658mg/mL大黃溶液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，分段收集流出液，每份15mL，共收集15份，取樣測(cè)定流出液中大黃素的含量。從第5份大黃素開始明顯泄露，所以確定大黃提取液最大上柱體積為60mL，即3倍的樹脂體積。

2.3.6 洗脫劑的選擇[7]取3份20mL預(yù)處理過(guò)的D101樹脂分別裝柱，按上述所確定的吸附條件上樣，上樣結(jié)束后，分別用100mL50%、70%、90%的乙醇洗脫樹脂柱，收集洗脫液，取樣測(cè)定流出液中大黃素的含量，計(jì)算洗脫率；另外將洗脫液回收乙醇，干燥，稱定重量，計(jì)算出膏率。

結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，洗脫劑的濃度越高，對(duì)大黃素的洗脫能力越好，出膏率也越大，綜合各因素，選用70%的乙醇為洗脫劑。

2.3.7 洗脫曲線的考察[8]取20mL預(yù)處理過(guò)的D101樹脂裝柱，調(diào)節(jié)流速為lmL/min，量取60mL大黃提取液上樣，上樣結(jié)束后，用70%的乙醇洗脫，分段收集流出液，每份20mL，共收集14份,分別取樣測(cè)定流出液中大黃素的含量。前4份洗脫液中大黃素的含量經(jīng)計(jì)算85%，故確定洗脫體積的用量為4倍的樹脂體積。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

取3份20mL預(yù)處理過(guò)的D101樹脂分別裝柱，調(diào)節(jié)流速為lmL/min，分別加入60mL大黃提取液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，然后用10倍量的水洗至近澄清，最后各用80mL70%的乙醇以lmL/min的流速洗脫。計(jì)算D101樹脂對(duì)大黃蒽醌的吸附量、吸附率、解析率、浸膏收率。結(jié)果見表-3

表-3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

從表-3中可以看出，D101樹脂分離純化大黃蒽醌類組分的方法穩(wěn)定可行。

3 結(jié)語(yǔ)

D-101型大孔吸附樹脂是一類苯乙烯型非極性共聚體，適用范圍比較廣，對(duì)于不帶極性或弱極性的有機(jī)化合物，吸附能力強(qiáng)。大黃蒽醌類組分極性較弱，適宜選用此種分離、純化方法。本研究中采用D101大孔吸附樹脂對(duì)大黃蒽醌組分進(jìn)行分離與純化，吸附條件為:上樣液濃度為0.0658g/mL，最大上樣液體積為3倍樹脂體積，洗脫劑為4倍量樹脂體積的70%的乙醇。通過(guò)樹脂的富集純化的驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，測(cè)得總蒽醌浸膏收率為13.21%，表明該樹脂純化大黃總蒽醌的工藝可行。

[1]彭成.中藥藥理學(xué)[M].北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2012：141.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì)·中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：22.

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[5]朱文濤，徐超群，涂莉等.X-5大孔吸附樹脂分離純化5種大黃蒽醌的工藝研究[J].華西藥學(xué)雜志，2010,25（6）：733-735.

[6]徐晶，于艷，王曉蓉等.大孔吸附樹脂純化大黃中5種游離蒽醌及總蒽醌的含量測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（4）：862-863.

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[8]劉峰群，易毛，劉麗萍等.大孔吸附樹脂法純化大黃中結(jié)合型蒽醌總提取物的研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)藥雜志,2006,8（4）：104-105.