王全富, 苗 苗, 侯艷華, 史永磊, 韓 涵, 吳瑩瑩, 嚴(yán)天奇, 曲俊杰

哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海 264209

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硫氧還蛋白研究進(jìn)展

王全富, 苗 苗, 侯艷華*, 史永磊, 韓 涵, 吳瑩瑩, 嚴(yán)天奇, 曲俊杰

哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,山東 威海 264209

硫氧還蛋白(Trx)是一類廣泛存在于真核及原核生物體內(nèi)的小分子多功能蛋白質(zhì)。Trx具有調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、抑制細(xì)胞凋亡及調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄等功能，并且它與硫氧還蛋白還原酶(TrxR)、煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)共同構(gòu)成了生物體內(nèi)重要的硫氧還蛋白系統(tǒng)，對維持體內(nèi)穩(wěn)定的氧化還原狀態(tài)具有重要的作用。以Trx為對象，綜述了其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、分類分布及其生物學(xué)活性等方面的研究現(xiàn)狀，以期為相關(guān)研究提供參考。

硫氧還蛋白；結(jié)構(gòu)；分類；分布；生物活性

硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)廣泛分布于微生物、植物和動物體內(nèi)，是一種熱穩(wěn)定的低分子量酸性蛋白，分子量一般在12 kDa左右。Trx在絕大多數(shù)生物中都具有保守性，一般具保守的活性位點(diǎn)Cys-Gly-Pro-Cys，能夠通過還原胞內(nèi)靶蛋白中的二硫鍵(-S-S-)參與細(xì)胞內(nèi)一系列生理生化反應(yīng)，行使著各種不同的生理功能[1]。Trx、TrxR和NADPH三者共同構(gòu)成了機(jī)體重要的抗氧化系統(tǒng)——硫氧還蛋白系統(tǒng)，該系統(tǒng)中的Trx和TrxR都含有兩個(gè)相鄰的半胱氨酸保守序列，所形成的可逆二硫鍵對Trx和TrxR發(fā)揮還原劑作用有重要影響。在信號傳導(dǎo)或是保持細(xì)胞質(zhì)蛋白還原態(tài)方面，硫氧還蛋白系統(tǒng)成為一種主要的調(diào)控機(jī)制[2]。該系統(tǒng)的存在可以避免核酸、蛋白和細(xì)胞膜的完整性受損，這對生物體可以在有氧環(huán)境中生存起著至關(guān)重要的作用[3]。除抗氧化功能外，Trx還具有許多其他的生物活性正在被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，如抑制凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、趨化因子和細(xì)胞因子等。

1 Trx的結(jié)構(gòu)及其特點(diǎn)

大多數(shù)物種的Trx蛋白氨基酸序列長度為105～110個(gè)氨基酸不等，并且與大腸桿菌Trx有27%～69%的序列相似性，大腸桿菌Trx的蛋白空間結(jié)構(gòu)是一種緊密連接的小分子球形蛋白質(zhì)，內(nèi)含一個(gè)由5個(gè)β-折疊形成的疏水中心區(qū)域，及4個(gè)α-螺旋圍繞核心的終末端，其中第2個(gè)β-折疊與第2個(gè)α-螺旋被活性位點(diǎn)保守序列Cys32-Gly-Pro-Cys35所連接，如圖1所示[4]。

圖1 大腸桿菌Trx的結(jié)構(gòu)[4]Fig.1 Structure of Trx in E.coli[4]注：Cys32和Cys35為活性位點(diǎn)

由于保守序列Cys-Gly-Pro-Cys(C-G-P-C)的存在，對Trx三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有著重要的作用，同時(shí)Trx的氧化還原活性也與其有關(guān)，在參與氧化還原反應(yīng)過程中，還原態(tài)的Trx通過巰基[-(SH)2]供氫還原其蛋白上的二硫鍵，即兩個(gè)半胱氨酸經(jīng)過可逆的氧化過程，將自身的巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，同時(shí)將還原力傳給含有二硫鍵的底物。被氧化的Trx可通過硫氧還蛋白系統(tǒng)中的NADPH供氫催化還原，還原態(tài)Trx會再一次還原靶蛋白。Ejiri等[5]通過對細(xì)菌和真核細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)鑒定，首次發(fā)現(xiàn)Trx的靶蛋白是核苷酸還原酶、3′-磷酸腺苷-5′-焦磷酸還原酶和甲硫氨酸亞砜還原酶。Nishiyama等[6]從酵母雙雜交系統(tǒng)中分離得到一種內(nèi)源性的Trx抑制物——Trx結(jié)合蛋白(TBP-2)，TBP-2能夠與還原態(tài)的Trx發(fā)生結(jié)合，作用于其催化活性中心，從而對還原態(tài)Trx的還原活性產(chǎn)生抑制。而在人和其他哺乳動物體內(nèi)的Trx保守序列上還含有另外3個(gè)Cys殘基，分別是Cys62、Cys69和Cys73，這些Cys殘基能夠可逆地催化氧化還原反應(yīng)，并且賦予Trx獨(dú)特的生物學(xué)活性。

2 Trx的分類及分布

2.1 微生物中的Trx

目前，科研人員已對部分微生物細(xì)胞中的Trx基因及其表達(dá)的Trx蛋白產(chǎn)物開展了一系列的研究，具有代表性的是大腸桿菌的Trx基因。在大腸桿菌中，Trx主要有Trx-1和Trx-2兩種類型，分別由TrxA和TrxC基因編碼，其中Trx-1在微生物Anacystisnidulans、Bacillussubtilis、Rhodobactersphaeroides和Synechocystissp.中被相繼發(fā)現(xiàn)[7]。在酵母中Trx以一種獨(dú)立的NADP-硫氧還蛋白系統(tǒng)形式在線粒體中普遍存在，它在酵母中能夠還原硫酸鹽和甲硫氨砜。王曉慧等[8]成功克隆了黑曲霉硫氧還蛋白系統(tǒng)中的Trx基因，其全長為324 bp，分子量為11.912 kDa，對其第Cys33～Cys37位保守區(qū)的活性位點(diǎn)實(shí)施定點(diǎn)突變證實(shí)，Cys33和Cys37為活性催化位點(diǎn)。

Laurent等于1964年首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了Trx可以用作核苷酸還原酶的氫供體[9]之后，人們也相繼對植物、動物的Trx進(jìn)行了大量的研究。研究發(fā)現(xiàn)，在各類生物中都普遍存在著Trx，研究者們對它們的類別與特征展開了越來越深入的研究。Trx由多基因編碼，分布在不同種類生物、同種生物中的不同類細(xì)胞以及同類細(xì)胞不同位置的Trx，其種類都會產(chǎn)生一定差異性。其中植物的Trx最為復(fù)雜，比如在擬南芥的整個(gè)基因組中發(fā)現(xiàn)至少有20個(gè)編碼Trx的全基因序列[10]。目前，有關(guān)Trx的數(shù)量、種類及表達(dá)調(diào)控研究正在不斷深入。

2.2 植物中的Trx

近些年，人們對植物的硫氧還蛋白系統(tǒng)展開了全面的研究，發(fā)現(xiàn)在煙草、楊樹、松樹、番茄、大豆和小麥等高等植物中，Trx具有多樣性與復(fù)雜性。張帆等[11]從普通小麥中克隆了一個(gè)位于5BS染色體的Trx 超家族新基因TaNRX，該基因與小麥的抗旱機(jī)制有關(guān)。

目前根據(jù)氨基酸序列的不同，可將Trx分為6大類：Trxo、Trxm、Trxf、Trxh、Trxx、Trxy。其中，Trxm、Trxf和Trxh廣泛存在于高等植物中[12]，Trxm、Trxf、Trxx和Trxy分布于葉綠體中，由于編碼基因序列的差異性，使得它們中N-末端的相應(yīng)氨基酸會折疊產(chǎn)生一個(gè)延伸區(qū)，推斷該延伸區(qū)很可能就是運(yùn)輸肽，其可識別進(jìn)入葉綠體。Collin等[13]已經(jīng)通過融合綠色熒光蛋白(GFP)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了擬南芥中的Trxm、Trxf和Trxx在葉綠體中的分布位置。

Trxm分布于需氧的原核生物、藻類、單子葉植物及雙子葉植物中，由于其最初用作依賴于NADPH的蘋果酸脫氫酶的催化劑[14]，所以稱之為Trxm，與原核生物的Trxs有高度相似性。大部分植物和綠藻中的Trxm由核酸編碼，紅藻的Trxm由葉綠體基因組編碼，這是其原核生物內(nèi)共生起源的有利證據(jù)[14]。Trxo是較晚發(fā)現(xiàn)的一種Trx，它可以通過還原二硫鍵控制部分線粒體蛋白的活動。多種h型的Trx在高等植物中都有分布，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，由于Trxh在功能和組織分布上較為復(fù)雜，除了草本模式植物擬南芥的研究較多外，對小麥的研究已有報(bào)道，曹玲瓏等[15]利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究與Trxh相互作用的未知蛋白，從而為植物抗逆機(jī)制研究提供了理論基礎(chǔ)。

2.3 動物中的Trx

2.3.1 昆蟲中的Trx 雙翅昆蟲(如黑腹果蠅和岡比亞按蚊)缺失一種谷胱甘肽還原酶，所以，存在于雙翅昆蟲的Trx已被證實(shí)具備更為廣泛的功能，關(guān)于對其重組表達(dá)的研究已有報(bào)道[16]。由于Trx可以通過其本身一對保守的半胱氨酸殘基參與多種重要的抗氧化和還原調(diào)控過程，因此，Kim等[17]利用氧化脅迫對昆蟲抗氧化酶類的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)昆蟲遭受H2O2、百草枯(農(nóng)藥)、極端環(huán)境溫度或是微生物侵染迫害時(shí)，它們的Trx基因會高效表達(dá)。

Kim等[18]通過對桑蠶B.mori的Trx基因測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BmTrx與其他昆蟲的Trx一樣，在氨基酸序列的同樣位置具有一致的保守活性位點(diǎn)(CGPC)；BmTrx基因在所有驗(yàn)證的組織內(nèi)都能表達(dá)出BmTrx蛋白，這表明BmTrx蛋白是普遍存在的，即使在有細(xì)菌或病毒侵染的昆蟲細(xì)胞中，也會表達(dá)大小約12 kDa的BmTrx短肽，依據(jù)其特性，將該蛋白視為昆蟲各類Trx中的一類。

2.3.2 其他動物中的Trx 人們對動物體內(nèi)的Trx研究發(fā)現(xiàn)，其主要有2種類型，即Trx1和Trx2，Trx1存在于細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)，Trx2存在于線粒體中，由于Trx2僅存在于線粒體中，因此被視為線粒體特異性蛋白質(zhì)。眾所周知，所有的Trx都具有1個(gè)保守活性位點(diǎn)：Cys-Gly(Ala)-Pro-Cys，其中的2個(gè)半胱氨酸殘基具有氧化還原活性，它們可以借助電子和質(zhì)子的轉(zhuǎn)移形成可逆的二硫鍵，在細(xì)胞內(nèi)對一系列的生理代謝發(fā)揮著不同的功能。梁鵬等[19]研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物Trx的結(jié)構(gòu)與大腸桿菌的結(jié)構(gòu)另一個(gè)不同之處是，半胱氨酸殘基還會存在于哺乳動物Trx活性位點(diǎn)的外側(cè)，而且當(dāng)Trx聚集和失活時(shí)，此殘基則被氧化成二硫鍵。哺乳動物的Trx被Moore首次報(bào)道后，人類的Trx也相繼得到研究。研究發(fā)現(xiàn)，人類和其他哺乳動物的Trx除了含有Cys32和Cys35外，還有Cys62、Cys69和Cys73另外3個(gè)半胱氨酸殘基，同樣能夠可逆催化各種氧化還原反應(yīng)，從而使人類和哺乳動物的Trx具備了獨(dú)特的生物學(xué)特征。人類的多個(gè)細(xì)胞因子樣分子，比如成人T-細(xì)胞白血病變細(xì)胞分化因子(ADF)、妊娠早期因子以及由EB病毒感染B-成淋巴細(xì)胞后產(chǎn)生的類白細(xì)胞介素-1(IL-1)細(xì)胞素，均被歸為硫氧還蛋白類。

3 Trx的生物學(xué)活性

Trx在生物學(xué)功能方面的復(fù)雜多樣性主要取決于其結(jié)構(gòu)的多樣性。目前已發(fā)現(xiàn)，Trx與10多個(gè)不同的生化代謝系統(tǒng)/途徑相關(guān)聯(lián)，是參與細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答反應(yīng)中多種脅迫的重要調(diào)節(jié)因子。在各生物體中，具有可逆二硫鍵氧化還原力的Trx主要涉及的生理功能：生物和非生物脅迫應(yīng)答與調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號傳導(dǎo)、葉綠體光合酶類及其他酶類活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、細(xì)胞凋亡和免疫應(yīng)答及DNA結(jié)合活性等。

絕大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)生理生化反應(yīng)的順利進(jìn)行，都需要一個(gè)正常穩(wěn)定的胞內(nèi)氧化還原平衡環(huán)境，包括DNA合成、酶活調(diào)控和基因表達(dá)及調(diào)控[20]?？墒牵?dāng)生物遭受氧化逆境脅迫等壓力時(shí)，一般會伴隨有活性氧類物質(zhì)(reactive oxygen species， ROS)的大量產(chǎn)生，比如超氧化物陰離子、過氧化氫和羥基基團(tuán)。為了避免ROS的毒害，現(xiàn)生存的生物體已經(jīng)進(jìn)化生成各種酶保護(hù)系統(tǒng)，其中的Trx即是參與去除細(xì)胞內(nèi)ROS毒害的重要功能蛋白之一，它被認(rèn)為是氧化應(yīng)激作用的生物標(biāo)志物[21]，Trx通過與過氧化物氧化還原酶的交互作用來共同清除ROS，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[22]，并維持細(xì)胞的氧化還原平衡環(huán)境。

此外，Trx在不同種類的生物體中也具有其獨(dú)特性，石巖巖等[23]研究發(fā)現(xiàn)在人體胃部的幽門螺桿菌中，Trx具有抗氧化和氮化應(yīng)激等作用，從而保護(hù)菌體長期定植于胃內(nèi)，并且Trx還可能與菌體致病作用有關(guān)。在植物葉綠體中，Trx能夠特異調(diào)控二硫化物，來調(diào)節(jié)受光活化的卡爾文循環(huán)，Pasternak等[24]已經(jīng)證實(shí)Rhodobacter的Trx參與光合作用基因的還原依賴性調(diào)控。在哺乳動物中，Trx對多種轉(zhuǎn)錄因子的活性有一定的調(diào)節(jié)作用，即能夠抑制或激活不同轉(zhuǎn)錄因子的活性，同時(shí)對轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也起到促進(jìn)作用[25]；還原態(tài)的Trx可以與凋亡信號激酶1(ASK-1)直接結(jié)合抑制其活性，進(jìn)而減少ASK1對p38MAK和JNK上游的MAPKKK的激活作用發(fā)揮抗凋亡效應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞凋亡[26]；除此之外，在妊娠、分娩及心血管疾病，以及硅肺病、動脈粥樣硬化、肺缺血再灌注損傷等多種人類疾病中，Trx均具有一定的治療和保護(hù)功能。

4 展望

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，Trx能夠與信號分子如ASK-1、PTEN(抑癌基因)、TXNIP(Trx結(jié)合蛋白)發(fā)生交互作用，從而進(jìn)行細(xì)胞調(diào)控，這說明Trx細(xì)胞信號傳導(dǎo)起到重要作用[27,28]，對抗腫瘤的研究將有重要意義。同時(shí)硫氧還蛋白功能定位及其在抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中的作用仍不是十分清楚，有待進(jìn)一步研究。

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Progress on Thioredoxin

WANG Quan-fu,MIAO Miao,HOU Yan-hua*,SHI Yong-lei,HAN Han,WU Ying-ying,YAN Tian-qi,Qu Jun-jie

SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnologyatWeihai,ShandongWeihai264209,China

Thioredoxin (Trx) is a kind of small-molecule multifunctional protein which exists widely in eukaryotic and prokaryotic organisms.It has functions of the regulation of cell growth,the inhibition of cell apoptosis and the regulation of gene transcription.Trx composes the thioredoxin system which plays an important role in maintaining redox-active stability in body with thioredoxin reductase (TrxR) and nicotinamide adenine nucleoside two phosphate (NADPH).This paper summarized the structural features,classification,distribution,biological and activity of Trx,which was expected to provide reference for related research.

thioredoxin; structure; classification; distribution; biological activity

2015-03-20; 接受日期：2015-04-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31100037)；山東省自然科學(xué)基金(ZR2011CM003)資助。

王全富，副教授，博士，研究方向?yàn)楹Ｑ蟓h(huán)境微生物學(xué)。E-mail：wangquanfu2000@126.com。*通信作者：侯艷華，副教授，博士，研究方向?yàn)闃O端環(huán)境微生物。E-mail：marry7718@163.com。

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.03.08