曹 卉 劉 穎

胰島素抵抗對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能及順鉑敏感性的影響

曹 卉 劉 穎

目的探討胰島素抵抗對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能及順鉑敏感性的影響。方法選取卵巢癌患者200例，根據(jù)是否患有2型糖尿病分為兩組，胰島素抵抗組83例、非胰島素抵抗組127例。穿刺獲取腫瘤組織和正常組織作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用免疫組化法測(cè)定IGF-1蛋白表達(dá)量，流式細(xì)胞術(shù)法測(cè)定IGF-1R蛋白表達(dá)量，MTT法測(cè)定不同濃度順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的IC50(半數(shù)抑制濃度)值。結(jié)果①胰島素抵抗組IGF-1蛋白表達(dá)的HIS值為10.1±1.68，與非胰島素抵抗組(6.5±2.14)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；②胰島素抵抗組IGF-1R蛋白表達(dá)量為(281.1±1.78)，與非胰島素抵抗組(264.6±5.32)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；③胰島素抵抗組不同濃度順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的IC50值為(14.93±0.15)，與非胰島素抵抗組(2.41±0.08)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論胰島素抵抗能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，對(duì)臨床用藥具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

卵巢癌；胰島素抵抗；細(xì)胞生物學(xué)；順鉑敏感性

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:1606～1608)

卵巢癌(oophoroma)是由于卵巢上皮細(xì)胞或生殖細(xì)胞惡性增生而引起的1種惡性腫瘤性疾病，發(fā)病率僅次于子宮頸和子宮體癌，是常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1-2]。本病多發(fā)于35歲以上的中青年女性，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)[3]，我國(guó)卵巢癌患者的發(fā)病率為6.31/10萬(wàn)，并且以每年1.83%的速度逐年上升。卵巢癌早期癥狀不明顯，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多已診斷為晚期[4]，無(wú)法采用手術(shù)治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采取以鉑類(lèi)藥物等為主的化療療法，由于獲得性耐藥等原因，效果并不理想。研究發(fā)現(xiàn)[5]，糖尿病患者體內(nèi)存在胰島素抵抗，患子宮內(nèi)膜癌、大腸癌、乳腺癌等腫瘤的幾率明顯高于正常人，二甲雙胍等胰島素增敏劑可以明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)[6]。但目前關(guān)于胰島素抵抗對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能及耐藥性影響的研究較少，為了增強(qiáng)療效，改善其預(yù)后，為卵巢癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月至2014年1月于我院以卵巢上皮細(xì)胞癌為診斷而收入院患者200例，根據(jù)是否患有2型糖尿病分為胰島素抵抗組和非胰島素抵抗組。胰島素抵抗組83例，平均年齡(42.3±5.7)歲；非胰島素抵抗組127例，平均年齡(43.6±6.1)歲?；颊卟〕?1年。兩組患者的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?；颊咦栽竻⑴c本實(shí)驗(yàn)，并簽署知情同意書(shū)。方案獲得我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并全過(guò)程跟蹤。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)病理學(xué)檢查確診為卵巢上皮細(xì)胞癌；病理學(xué)分期為Ⅰ～Ⅱ期[7]；年齡為35～50歲；患有糖尿病的患者確診為2型糖尿病，病程>3年；患者均為首次治療。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

經(jīng)過(guò)手術(shù)、放療、化療等治療的患者；心、腦、肝、膽嚴(yán)重疾??；其他惡性腫瘤；神志異常以及近2個(gè)月來(lái)服用二甲雙胍等胰島素增敏劑；由于各種原因不能完成實(shí)驗(yàn)的患者。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

穿刺獲取所有患者的腫瘤組織作為實(shí)驗(yàn)組，正常組織作為正常對(duì)照組，制成細(xì)胞懸浮液，常規(guī)培養(yǎng)。

1.4.1 IGF-1蛋白表達(dá)的測(cè)定 采用免疫組化法測(cè)定[8]。取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后放入培養(yǎng)基中，接種在6孔板上，密度為4×105個(gè)/cm2，48 h后經(jīng)4%甲醛固定、3%雙氧水氧化，按說(shuō)明書(shū)分別加入IGF-1一抗、二抗工作液，孵育，PBS清洗后，采用DAB顯色，經(jīng)蘇木精復(fù)染后沖洗，封片。

由兩名高年資的病理醫(yī)師在高倍鏡下對(duì)切片進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度并評(píng)分，經(jīng)核對(duì)得出結(jié)果。陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞是指細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒的細(xì)胞，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為0分，1%～10%為1分,11%～50%為2分，51%～80%為3分，81%～100%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分為無(wú)染色，1分為淺黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。總評(píng)分(HIS值)=陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分。

1.4.2 IGF-1R蛋白表達(dá)的測(cè)定 應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)法測(cè)定[9]。取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化、PBS沖洗后，用離心機(jī)離心5 min，棄上清，加入PBS液，使其密度為每100 μl 11×106，將IGF-1R用FITC標(biāo)記后加入細(xì)胞液中，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)IGF-1R蛋白表達(dá)含量。

1.4.3 不同濃度順鉑對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用 取生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，稀釋成每ml含5×103細(xì)胞的細(xì)胞液，接種在96孔板，培養(yǎng)1 d，分別加入0.25 μg/ml、2.5 μg/ml、25 μg/ml的順鉑，培養(yǎng)48 h，加入20 μl噻唑藍(lán)(5 mg/ml)，4 h后棄去上清，加入150 μl的0.2%二甲基亞砜，振蕩后應(yīng)用酶標(biāo)儀[10]測(cè)定孔A490 nm值并計(jì)算存活率和IC50(半數(shù)抑制濃度)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)處理，以P<0.05為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 IGF-1蛋白表達(dá)比較

采用免疫組化法測(cè)得胰島素抵抗組IGF-1蛋白表達(dá)的HIS值為(10.1±1.68)，與非胰島素抵抗組(6.5±2.14)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 IGF-1R蛋白表達(dá)

通過(guò)流式細(xì)胞法測(cè)得胰島素抵抗組IGF-1R蛋白表達(dá)量為(281.1±1.78)，與非胰島素抵抗組(264.6±5.32)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

A為胰島素抵抗組，B為非胰島素抵抗組。

2.3 不同濃度順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的IC50值比較

通過(guò)MTT法測(cè)得胰島素抵抗組不同濃度順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的IC50值為(14.93±0.15)μg/ml，與非胰島素抵抗組(2.41±0.08)μg/ml比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

卵巢癌與宮頸癌、子宮體癌稱(chēng)為女性生殖系統(tǒng)的三大殺手，嚴(yán)重危害女性的生命健康。研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病可能與內(nèi)分泌功能、精神因素、免疫、遺傳、不良生活習(xí)慣、營(yíng)養(yǎng)不調(diào)、以及外界的化學(xué)、生物等致癌因素有關(guān)，具有較高的發(fā)病率和死亡率[11]。由于診斷手段有限加之臨床癥狀不典型，發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期，化療效果不如人意，尤其是2型糖尿病患者，由于對(duì)目前常用的順鉑具有耐藥性[12]，效果更不理想。有資料顯示[13]，2型糖尿病患者體內(nèi)存在胰島素抵抗，能夠代償性的促進(jìn)IGF-1含量增加，與IGF-1R受體結(jié)合，發(fā)揮與胰島素相似的功能。IGF-1屬于1種生長(zhǎng)因子，具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的作用，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，但需要與IGF-1R受體結(jié)合才能發(fā)揮作用，很多研究發(fā)現(xiàn)[14]，IGF-1及IGF-1R在多數(shù)惡性腫瘤組織中表達(dá)量明顯增多。另外，資料顯示[15]，IGF-1R在介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的過(guò)程中，可以影響PI3K/AKT通路，阻礙AMP蛋白酶 (AMPK)的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡，這可能與腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性增強(qiáng)有關(guān)。目前關(guān)于卵巢中IGF-1及IGF-1R表達(dá)情況研究較少，筆者做了相關(guān)研究，以探究胰島素抵抗對(duì)卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)功能及耐藥性影響。

研究結(jié)果顯示，胰島素抵抗組IGF-1蛋白表達(dá)的HIS值為10.1±1.68，與非胰島素抵抗組(6.5±2.14)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示胰島素抵抗可以使卵巢癌組織中IGF-1含量升高；胰島素抵抗組IGF-1R蛋白表達(dá)量為281.1±1.78，與非胰島素抵抗組(264.6±5.32)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示胰島素抵抗可以促進(jìn)IGF-1R表達(dá)，使IGF-1充分發(fā)揮作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖；胰島素抵抗組不同濃度順鉑作用于腫瘤細(xì)胞的IC50值為(14.93±0.15)，與非胰島素抵抗組(2.41±0.08)比較，明顯較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示胰島素抵抗可以增加卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性，影響化療效果。

總之，胰島素抵抗能夠促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖，降低卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，對(duì)臨床用藥具有指導(dǎo)意義，值得臨床推廣。

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(編輯：吳小紅)

Effect of Insulin Resistance on the Biological Function of Ovarian Cancer Cell and Sensitivity to Cisplatin

CAOHui,LIUYing.

Objective To study the effect of insulin resistance on the biological function of ovarian cancer cell and sensitivity to cisplatin.Methods 200 patients with ovarian cancer were selected,according to whether the patients had type 2 diabetes,were divided into 2 groups,the insulin resistant group 83 cases,and insulin non-resistant group 127 cases.Puncture for tumor and normal tissues was the experimental object,using immunohistochemical determination of IGF-1 protein expression,and IGF-1R protein expression was determined by flow cytometry method，MTT method for the determination of different concentrations of cisplatin on tumor cell IC50(half inhibitory concentration) values.Results ①The IGF-1 protein expression value of HIS of the insulin resistant group was 10.1±1.68,which was significantly higher compared to insulin non-resistant group (6.5±2.14)， the difference was statistically significant (P<0.05);②The expression of IGF-1R protein in insulin resistant group was 281.1±1.78,which was significantly higher compared to insulin non-resistant group (264.6±5.32),the difference was statistically significant (P<0.05);③The insulin resistant groups of different concentration of cisplatin to tumor cells IC50values was 14.93±0.15,which were significantly higher compared to insulin non-resistant group (2.41±0.08),the difference was statistically significant (P<0.05).Conclusion Insulin resistance can promote the proliferation of ovarian cancer cells,decrease the sensitivity of ovarian cancer cells to cisplatin,has guiding significance for clinical medication,and it is worthy of clinical promotion.

Ovarian cancer;Insulin resistance;Cell biology;Sensitivity to cisplatin

221004 中國(guó)人民解放軍第97醫(yī)院

劉 穎

10.3969/j.issn.1001-5930.2015.11.007

R737.31

A

1001-5930(2015)11-1606-03

2015-01-09

2015-05-21)

The97thHospitalofPLA,Xuzhou,221004