楊栗坤，孫雯娜，王心靜，王仲元，程小星

結(jié)核分枝桿菌臨床株對利福霉素類藥物的耐藥特點分析

楊栗坤，孫雯娜，王心靜，王仲元，程小星

目的比較分析臨床標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）對利福霉素類藥物的耐藥特點，為含利福霉素類藥物的抗結(jié)核治療方案的改進(jìn)提供細(xì)菌學(xué)基礎(chǔ)。方法用絕對濃度法檢測470份臨床標(biāo)本中Mtb的耐藥情況。結(jié)果180份培養(yǎng)陽性的標(biāo)本中，41份對利福霉素類耐藥，對利福平和利福噴汀的耐藥水平高度一致，對二者的耐藥水平顯著高于對利福布汀的耐藥水平，對低濃度和高濃度利福布汀耐藥的數(shù)量差異顯著。結(jié)論臨床標(biāo)本中的Mtb對利福平和利福噴汀的耐藥水平表現(xiàn)出高度一致性，提示利福噴汀不適于作為利福平耐藥的后備藥物，利福布汀可以作為利福平的后備藥物，但服用劑量可能影響治療效果。

結(jié)核分枝桿菌；利福霉素類；抗藥性；治療學(xué)

利福霉素類藥物對細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外、任何生長環(huán)境和生長狀態(tài)的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）均有殺菌作用，是完全殺菌藥，毒性低，不良反應(yīng)小，在結(jié)核病的藥物治療中仍具有無可替代的地位，我國將利福平、利福噴汀和利福布汀全部歸為一線口服藥[1]。目前結(jié)核病治療上，對利福平、利福噴汀和利福布汀的使用較大程度上憑借經(jīng)驗，本研究比較臨床標(biāo)本中Mtb對3種利福霉素類藥物的耐藥分布，以期為其應(yīng)用提供細(xì)菌學(xué)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、標(biāo)本及培養(yǎng)基H37Rv標(biāo)準(zhǔn)株由解放軍第三〇九醫(yī)院結(jié)核重點實驗室提供。臨床標(biāo)本系2014年8—12月實驗室接收的臨床檢測標(biāo)本。Mtb藥物敏感性（藥敏）羅氏培養(yǎng)基（絕對濃度法）購自珠海銀科醫(yī)學(xué)工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備用10%Tween-80水溶液將傳代后培養(yǎng)2～3周的新鮮培養(yǎng)物配置成1mg/ml的菌懸液，用0.9%氯化鈉溶液稀釋至0.01mg/ml。

1.2.2 接種分別接種0.1ml如上菌液至無藥對照和各含藥培養(yǎng)基斜面上，每管接種菌量為0.001mg。

1.2.3 觀察和報告結(jié)果接種后第28天檢查無藥對照和含藥培養(yǎng)基，記錄菌落生長情況。在無藥對照培養(yǎng)基上菌落生長旺盛的前提下，含藥培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)多于20個，判定為耐藥[2]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件對檢測指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計分析。不同組間耐藥程度的比較采用秩和檢驗，2組率的比較采用四表格χ2檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床標(biāo)本來源及檢測結(jié)果檢測臨床標(biāo)本470份，培養(yǎng)Mtb陽性180份，其中2份標(biāo)本（1份痰標(biāo)本和1份支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本）來自同一例患者，耐利福霉素類藥物的標(biāo)本共41份，耐藥標(biāo)本均來自肺結(jié)核患者，其中1份胸腔積液標(biāo)本的患者伴發(fā)支氣管胸膜瘺。標(biāo)本性狀和檢測結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)本來源及檢測結(jié)果(份)Table 1 Clinical isolate types and numbers of positiveculture of M tb and rifamycin-resistant isolates(samp les)

2.2 耐3種利福霉素類藥物分布情況定義菌落生長占斜面面積1/4為A，菌落生長占斜面面積1/2為B，菌落生長占斜面面積3/4為C，全斜面生長、菌落融合為D（用生長面積大小表示耐藥程度的大小，耐藥程度按A、B、C、D依次增強(qiáng)）。每種藥物分為高低2個濃度，41份標(biāo)本表現(xiàn)為對低濃度和高濃度藥物同時耐藥，或僅對低濃度藥物耐藥。其中1份標(biāo)本對利福噴汀耐藥，但對利福平敏感，其余40份標(biāo)本對高、低濃度的利福平和利福噴汀的耐藥水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。對高、低濃度利福布汀的耐藥水平均顯著低于對利福平和利福噴汀的耐藥水平（P均＜0.01），對低濃度和高濃度利福布汀耐藥數(shù)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.765,P=0.003）。對3種利福霉素類藥物的耐藥水平分布見表2和表3。

表2 M tb對3種低濃度利福霉素類藥物的耐藥情況(份)Table 2 Distribution of drug resistance levels of M tb to 3 kinds of rifam ycins at low concentration(samples)

注：Kruskal-Wallis秩和檢驗，H c=25.488，P=0.000。兩兩比較，利福噴汀組vs利福平組，P＞0.05；利福布汀組vs利福平組，P＜0.01；利福布汀組vs利福噴汀組，P＜0.01

3 討論

結(jié)核病在世界范圍內(nèi)是第二大致死性傳染病[3]，2013年中國大陸報告結(jié)核病發(fā)病數(shù)為904 434例，居當(dāng)年傳染病發(fā)病數(shù)的第二位[4]。

根據(jù)藥物的殺菌活性、臨床療效和安全性，抗結(jié)核藥物被分為一線和二線藥物。WHO在原有分類的基礎(chǔ)上將抗結(jié)核藥物分為5組，我國在WHO分組的基礎(chǔ)上將口服一線藥物（第1組）增加了利福噴汀，因此，目前利福平、利福噴汀和利福布汀全部為一線抗結(jié)核藥物[1]。利福霉素類藥物在初治結(jié)核病和復(fù)治結(jié)核病中均發(fā)揮重要作用[5]。

表3 M tb對3種高濃度利福霉素類藥物的耐藥情況(份)Table 3 Distribution of drug resistance levels of M tb to 3 kinds of rifam ycins at high concentration(sam ples)

利福霉素及其衍生物的作用機(jī)制是通過與細(xì)菌RNA聚合酶β亞基結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄開始，從而發(fā)揮殺菌作用[6]。利福噴汀是利福霉素C-3位腙類衍生物，抗菌譜與利福平相同，但利福噴汀的抗結(jié)核活性比利福平強(qiáng)2～10倍，具有比利福平更強(qiáng)的殺菌效力，且對Mtb的延緩生長期明顯長于利福平，是利福平的1.56～1.70倍，間歇治療活性高[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)對利福平耐藥的Mtb，仍有部分對利福噴汀具有一定的敏感性，因此認(rèn)為對利福平低耐藥的結(jié)核病患者給予利福噴汀可能有效，對利福平高耐藥的結(jié)核病患者則可能無效[8]。基于利福噴汀的藥效特點和實驗研究，目前在臨床上，當(dāng)包含利福平的治療方案失敗時，利福平常常被更換為利福噴汀。有作者認(rèn)為當(dāng)出現(xiàn)對利福平耐藥時可選用利福噴汀或利福布汀，但對后者耐藥時則不可選用前者。但是，在本研究的41例耐利福霉素的患者中，27例按醫(yī)囑服藥，初治失敗后，利福平被更換為利福噴汀，治療效果不佳，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)對利福平耐藥的臨床標(biāo)本，全部對利福噴汀耐藥，且耐藥程度呈現(xiàn)高度的一致性，而且其中1份對利福噴汀耐藥，但對利福平敏感。由于利福噴汀的高效和長效性，有益于提高患者的依從性，有研究比較了利福噴汀和利福平作為初治一線藥物的臨床應(yīng)用，結(jié)果顯示利福噴汀的治療效果與利福平無顯著差異或優(yōu)于利福平，而且不良反應(yīng)少[9-10]。這些研究結(jié)果提示，臨床上利福噴汀不適宜作為利福平的后備藥物使用，但可能代替利福平成為初治方案的一線藥物。

利福布汀是螺哌啶利福霉素類衍生物，體外抗菌活性是利福平的2～4倍，但對肝微粒體酶的影響比利福平小，在組織細(xì)胞內(nèi)容易吸收[11]。利福布與利福平存在交叉耐藥性，但不同作者報道的二者交叉耐藥率結(jié)果有所差異，多為70%～80%。有研究發(fā)現(xiàn)對低濃度利福平耐藥時更易于對利福布汀敏感，而當(dāng)對高濃度利福平耐藥時，會出現(xiàn)對兩藥的完全交叉耐藥[12]。本研究的結(jié)果是對低濃度利福布汀和利福平的交叉耐藥率為82.5%，對高濃度利福布汀和利福平的交叉耐藥率為57.6%。對高濃度利福平耐藥的33份標(biāo)本中，1份對利福布汀敏感，32份標(biāo)本對低濃度利福布汀全部耐藥，但耐藥水平顯著低于對利福平的耐藥水平，其中僅19份對高濃度利福布汀耐藥。相關(guān)的臨床研究表明，作為耐多藥結(jié)核病聯(lián)合化療的藥物之一，利福布汀在痰菌陰轉(zhuǎn)方面優(yōu)于利福噴汀[13]，本研究結(jié)果從細(xì)菌學(xué)角度支持了這個臨床研究結(jié)論。

90%～95%對利福平耐藥菌株的rpoB基因存在突變，因此rpoB基因突變分析已經(jīng)作為利福平的快速藥敏檢測方法，但有研究發(fā)現(xiàn)rpoB基因某些位點的突變可能僅與對利福平耐藥有關(guān)，而不引起對利福布汀耐藥，而且23.9%對利福布汀敏感菌株存在rpoB基因突變[11]。因此Mtb對利福霉素的耐藥機(jī)制尚須進(jìn)一步研究。

[1]中國防癆協(xié)會.耐藥結(jié)核病化學(xué)治療指南（2009）［J］.中國防癆雜志,2010，32(4):181-198.

[2]趙雁林，劉志敏.結(jié)核病實驗室標(biāo)準(zhǔn)化操作與網(wǎng)絡(luò)建設(shè)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：277-279.

[3]World Health Organization.Global tuberculo s i s report 2014［EB/ OL］.［2015-02-10］.http://www.who.int/tb/publication s/glo-bal_ report/en/.

[4]王永怡，王姝，盧福昱，等.2013年感染性疾病熱點回顧［J］.傳染病信息，2014，27(1):1-7.

[5]胡越凱，盧洪洲.耐藥結(jié)核病的藥物選擇［J］.傳染病信息，2014，27(3):139-142.

[6]羅忠枚，夏小冬，崔玉彬，等.利福霉素類抗生素及其構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展［J］.中國抗生素雜志，2012，37(4):308-319.

[7]馬玙，朱莉貞，潘毓萱.結(jié)核?。跰］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：513-514.

[8]端木宏謹(jǐn)，劉宇紅，姜廣路，等.結(jié)核分枝桿菌對利福噴汀與利福平交叉耐藥的實驗研究［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2005，28 (3):192-194.

[9]穆克利，陳紅兵.利福噴汀與利福平治療肺結(jié)核的臨床對比研究［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2014，29(9):1007-1010.

[10]李進(jìn)升，王福生.利福噴汀替代利福平治療129例老年初治涂陽肺結(jié)核的臨床觀察［J］.中國防癆雜志，2009，31(8):473-476.

[11]韓喜琴，黃海榮，李艷靜，等.利福布汀抗結(jié)核分枝桿菌活性及其耐藥性與rpoB基因突變關(guān)系的探討［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2011，34(10):762-765.

[12]韓喜琴，黃海榮，李艷靜，等.利福平和利福布汀對結(jié)核分枝桿菌交叉耐藥率的初步探討［J］.中國防癆雜志，2010，32(11): 740-743.

[13]朱莉貞，傅瑜，初乃惠，等.利福類聯(lián)合多種藥物長療程方案治療耐多藥肺結(jié)核［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2006，29(8):520-523.

（2015-03-10收稿2015-06-09修回）

（責(zé)任編委曲芬本文編輯王姝）

Characteristics of resistance of Mycobacterium tuberculosis to rifam ycins in clinical isolates

YANG Li-kun,SUNWen-na,WANG Xin-jing*,WANG Zhong-yuan,CHENG Xiao-xing
Institute of Tuberculosis,309 Hospital of PLA,Beijing 100091,China
*Corresponding author,E-mail:xinjing15@163.com

Objective To provide the bacteriologicalbasis for improving the use of rifamycinsby analyzing the characteristics of resistance of clinically isolated Mycobacterium tuberculosis(Mtb)to rifamycins.M ethods Absolute concentration method was performed to detect resistance of Mtb in 470 clinical isolates.Results Of 180 samples positive for Mtb,41 were resistant to rifamycins. The resistance levels ofMtb in clinical isolates to rifampicin and rifapentine were highly consistent,and they were significantly higher than that to rifabutin.The numbers of sampleswith resistance ofMtb to rifabutin ata low concentration were significantly different from those to rifabutin ata high concentration.Conclusions The result that the resistance ofMtb to rifampicin ishighly consistentwith that to rifapentine suggests that rifapentine should not be suitable to replace rifampicin after Mtb is resistant to rifampicin;rifabutin should be able to replace rifampicin,but the dose of rifabutinmay affect the therapeutic efficacy.

Mycobacterium tuberculosis;rifamycins;drug resistence;therapeutics

R378.911

A

1007-8134(2015)04-0215-03

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.04.007

國家自然科學(xué)基金面上項目（81071319）；國家“十二五”科技重大專項（2013ZX10003006-003）

100091北京，解放軍第三〇九醫(yī)院結(jié)核病研究所（楊栗坤、孫雯娜，王心靜、王仲元、程小星）

王心靜，E-mail:xinjing15@163.com