楊桂英，吳敬濤

(1.濟南大學(xué)圖書館;2.濟南大學(xué)學(xué)報編輯部(自然科學(xué)版)，山東濟南250022)

桔梗皂苷對高膽固醇血大鼠低密度脂蛋白受體的調(diào)節(jié)

楊桂英1，吳敬濤2

(1.濟南大學(xué)圖書館;2.濟南大學(xué)學(xué)報編輯部(自然科學(xué)版)，山東濟南250022)

以高脂乳劑誘導(dǎo)高膽固醇血大鼠模型，研究肝臟膽固醇代謝相關(guān)的低密度脂蛋白受體(LDL－r)的活性.灌喂SD大鼠高脂乳劑飲食42d，建立高膽固醇血模型;隨機將高膽固醇血大鼠分成4組:空白組、高脂組、低皂苷劑量組、高皂苷劑量組，分別按每千克體質(zhì)量30、100 mg給以桔梗皂苷降膽固醇，連續(xù)21d;分別利用免疫組織化學(xué)方法和免疫印跡方法檢測LDL－r的蛋白變化，利用PCR方法檢測LDL－r基因表達水平.結(jié)果表明，低、高劑量桔梗皂苷均能顯著降低(P＜0.01)高脂乳劑誘導(dǎo)的高膽固醇血大鼠的LDL－r，提示桔梗皂苷降低血膽固醇的作用是通過LDL－r轉(zhuǎn)運膽固醇的作用實現(xiàn)的.

桔梗;皂苷;低密度脂蛋白受體;低密度脂蛋白;膽固醇

低密度脂蛋白膽固醇(LDL－C)在心血管疾病發(fā)病過程中起到重要作用［1］.低密度脂蛋白受體(LDL－r)的約50%以上位于肝細(xì)胞膜，其含量和活性是LDL－C代謝的關(guān)鍵因素，抑制LDL－r活性是導(dǎo)致高膽固醇血癥的重要原因，且膽固醇代謝的LDL－r途徑，是血清中膽固醇代謝的主要途徑［2－3］.LDL－r途徑表現(xiàn)為LDL－r先與LDL－C結(jié)合，將胞外LDL－C跨膜至胞內(nèi)，進一步進行生化反應(yīng)［4］.

降血脂藥物能有效調(diào)節(jié)LDL－r的活性和表達，相同的研究也證實，多種傳統(tǒng)中草藥也能夠調(diào)節(jié)LDL－r活性或降低和減少LDL－C濃度［5－6］.研究證實，桔梗是一種藥食兩用資源，其中所含皂苷D具有降低膽固醇的作用［7－9］.基于上述認(rèn)識，本文中利用桔梗提取物桔梗皂苷，建立高膽固醇血大鼠，在蛋白和基因水平上檢測肝細(xì)胞LDL－r活性和表達水平，以期明確桔梗皂苷肝組織內(nèi)調(diào)節(jié)膽固醇的藥理.

1 實驗

1.1 材料試劑與儀器設(shè)備

雄性大鼠SD 60只，體質(zhì)量250g左右，購于山東大學(xué)實驗動物中心;桔梗皂苷，自提;LDL－r免疫組織化學(xué)試劑盒，武漢博士德;牛血清白蛋白(BSA)、蛋白定量試劑盒，Sigma;PCR試劑，日本TaKaRa.

Leica－cm3050s冰凍切片機，德國.Cx51Olympus光學(xué)顯微鏡，日本.5804REppendorf冷凍離心機和Primus 96 Plus PCR儀，德國.HMIAS－2000醫(yī)學(xué)彩色圖像分析系統(tǒng)，千屏影像.

1.2 方法

1.2.1 動物造模及分組

SD大鼠45只，高脂乳劑飲食灌胃，每天5mL，42d，測定生化指標(biāo)，建立高膽固醇模型.高脂乳劑成分為膽固醇100g、大油250g、硫氧嘧啶10g、吐溫250mL、丙二醇200mL、膽酸鈉20g、蒸餾水300mL.

隨機將SD大鼠分成4組，每組10只:空白組、模型組、低皂苷劑量組、高皂苷劑量組.每日低、高皂苷劑量組分別按每千克體質(zhì)量30和100 mg皂苷給藥，空白組、模型組以同體積生理鹽水灌胃，連續(xù)21d.

1.2.2 冰凍切片制作

取藥物處理21d后的大鼠，麻醉，處死，取出肝組織，修剪成5mm3方塊，入－80℃液氮.調(diào)節(jié)切片機溫度為－20℃，置肝組織塊于支承器，周邊滴包埋劑，轉(zhuǎn)置冷凍臺，冰凍并修平.切片厚度為6μm.

1.2.3 免疫組織化學(xué)

以10%甲醛固定冰凍切片，H2O2和甲醇混合液溫室孵育30min，后以BSA孵育.先后滴加PBS液、按1:300體積比稀釋的兔抗鼠LDL－r抗體，37℃孵育1h;羊抗鼠IgG，30℃孵育20min;滴加SABC，25℃孵育15min.滴加顯色液，洗片.每組顯色切片置400倍顯微鏡觀察，采集圖像(圖1).測定黃色的陽性表達的低密度脂蛋白受體.

1.2.4 免疫印跡

制備肝微粒體，測定其中的總蛋白質(zhì)含量.蛋白行凝膠電泳，轉(zhuǎn)置聚偏二氟乙烯膜，封閉1.8 h(脫脂奶粉，質(zhì)量比為4.8%)，按體積比1∶1000加入羊抗人LDL－r抗體，4℃孵育，次日Tris－HCl緩沖鹽溶液(Tween)(TBST)洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(體積比為1∶2000)，孵育1h，TBST液再次洗膜并顯影，測定積分光密度值，內(nèi)參β－actin蛋白.

圖1 皂苷對肝臟LDL－r蛋白表達水平的免疫組化結(jié)果(×400)

1.2.5 PCR

提取肝組織總RNA，檢測完整性與純度.反轉(zhuǎn)錄DNA，滴加DEPC水、RNA、oligo(dt)混合，水浴，冰浴，后依次加入5×Buffer、dNTP、RNase抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶、DEPC水，水浴，95℃反應(yīng)5min終止.

大鼠LDL－r的基因序列來源于美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI).稀釋引物，反應(yīng)體系為:PCR緩沖液2.5μL、2mmol dNTP混合物0.5μL、DNA聚合酶0.5μL、LDL－r正向引物0.5μL、LDL－r反向引物0.5μL、GADPH正向引物0.4μL、GADPH反向引物0.4μL、四酰胺0.5μL、cDNA1.5μL、無菌水17.7μL，首輪循環(huán)變性90℃3.5min;后續(xù)35個循環(huán)，變性90℃45sec，退火50℃30sec，延伸71℃70sec，73℃10min.瓊脂糖電泳分析，對上述圖像進行灰度值分析，進行量化.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

以13th SPSS處理實驗數(shù)據(jù)，具有統(tǒng)計學(xué)意義的差異為P＜0.05，One－way ANOVA決定差異顯著性，以平均值形式表示.

2 結(jié)果

2.1 肝組織LDL－r表達水平

免疫組化結(jié)果見圖1，從圖中可看出，模型組大鼠肝臟組織的免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果中黃色染色區(qū)域明顯低于空白組，說明LDL－r的表達高，皂苷2組染色區(qū)域明顯高于模型組(P＜0.01).表明2種濃度的皂苷處理高膽固醇血大鼠，其肝臟LDL－r蛋白表達水平不同程度的被降低.

利用圖像分析系統(tǒng)對圖1的免疫組給圖進行灰度值分析，每組求出的平均值，代表每組LDL－r蛋白表達水平，結(jié)果見圖2.

圖2 皂苷對肝臟LDL－r蛋白表達水平的免疫組化結(jié)果分析(圖中#表示與空白組相比P＜0.01，*表示與空白組相比P＜0.01)

從圖2中可看出，模型組大鼠肝臟組織LDL－r蛋折的表達量顯著降低(P＜0.01)，為空白組的42%，而皂苷2組LDL－r蛋白的表達水平分別為72%和89%，顯著高于模型組(P＜0.01).表明2種濃度的皂苷能改變高膽固醇大鼠肝臟LDL－r蛋白的表達.

肝臟細(xì)胞LDL－r的免疫印跡反應(yīng)結(jié)果的灰度分析見圖3.

由圖3可以看出，與空白組對比，模型組顯著地(P＜0.01)降低了LDL－r蛋白的表達，而其升高，又能被皂苷組顯著(P＜0.01)地降低.結(jié)果同上.

2.2 肝臟LDL－r基因表達

瓊脂糖凝膠電泳和核酸檢測結(jié)果說明提取的LDL－r RNA純度滿足分子生物學(xué)實驗的要求.紫外燈照射PCR凝膠，并拍下圖片，利用圖像分析系統(tǒng)分析圖片灰度值，反映LDL－r RNA的表達水平，結(jié)果見圖4.

圖3 皂苷對肝臟LDL－r蛋白表達水平的免疫印跡結(jié)果分析

圖4 皂苷對肝臟LDL－r蛋白表達水平的免疫印跡結(jié)果分析

從圖4中可以看出，與空白組對比，高膽固醇血大鼠的LDL－r在基因水平上的表達會顯著(P＜0.01)下降，為空白組的29.8%左右，灌胃皂苷處理后發(fā)現(xiàn)，皂苷能顯著升高(P＜0.01)高膽固醇血大鼠的LDL－r在基因水平，低、高皂苷組分別提升40.1%和52.3%.

3 結(jié)論

低密度脂蛋白膽固醇受體LDL－r為肝細(xì)胞跨膜糖蛋白，與低密度脂蛋白膽固醇LDL－C結(jié)合，轉(zhuǎn)運膽固醇至細(xì)胞內(nèi)，從而清除血清膽固醇，調(diào)節(jié)體內(nèi)膽固醇水平.本文中高膽固醇血大鼠肝組織LDL－r蛋白和基因高表達水平，被每千克體質(zhì)量30和50mg的桔梗皂苷處理后，能顯著地降低(P＜0.01)，說明桔梗皂苷降低體內(nèi)膽固醇的作用，是通過LDL－r途徑，提示其為桔梗皂苷降低膽固醇的藥理之一.

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Regulation of PlatycodonGrandiflorumSaponin on Low Density Lipoprotein Receptor in High Blood Cholesterol Rats

YANG Gui－ying1，WU Jing－tao2
(1.Library of Jinan University;2.Editorial Office of Journal of Jinan University(Science and Technology)，Jinan，250022，China)

The high cholesterol blood model of the rats induced by high fat emulsion was established to study the activity of platycodongrandiflorumsaponin on cholesterol metabolism－related low density lipoprotein receptor(LDL－r)in liver.After SD rats were fed foods with high fat emulsion 42 d，high cholesterol blood model was set up.Random，high cholesterol blood rats were divided into 4 groups:Blank group，High fat and Low saponin dose group.Respectively，according to 30 or 100 mg of saponin per kilogram of body to drop cholesterol，continuous 21 d.Immunohistochemical method and Western blot method to detect changes of LDL－rprotein expression levels in liver，Polymerase chain reaction(PCR)to detect of LDL－r gene expression levels were used.The results show that the low and high dose of saponin can significantly(P＜0.01)reduce the LDL－r of high cholesterol blood rats induced by high fat emulsion，which prompt that the action of platycodongrandiflorumsaponin on highcholesterol blood rats can be come true is the modulatory role of LDL－r transporting cholesterol.

platycodongrandiflorum;saponin;low density lipoprotein receptor;low density lipoprotein; cholesterol

R285

A

1672－2590(2015)06－0104－05

2015－09－29

濟南大學(xué)博士基金項目(XBS1321)

楊桂英(1976－)，女，山東金鄉(xiāng)人，濟南大學(xué)圖書館館員.