楊慧榮，歐陽(yáng)徘徊，2，李桂峰，孫際佳，趙會(huì)宏，張 勇，夏 雨，王紫鈺，劉 麗，2

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院//廣東省農(nóng)業(yè)動(dòng)物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642;3.中山大學(xué)生命科學(xué)大學(xué)院，廣東廣州510275;4.中山大學(xué)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所//廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510275)

大眼鱖 (Siniperca kneri)屬鱸形目 (Perciformes)，鮨科 (Serranidae)，鱖屬 (Siniperca)，俗稱桂花魚、白桂等，是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的兇猛肉食性魚類，分布于中國(guó)長(zhǎng)江及其以南水系，為中國(guó)特有種［1］。由于經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，大眼鱖的野生種質(zhì)資源受到了很大程度上的壓迫，種質(zhì)資源呈現(xiàn)一定程度的下降趨勢(shì)。近期研究表明，在廣東的東江、西江、北江等水系的干流，大眼鱖已成偶見種，僅在一些大型湖泊和水庫(kù)中還有一定的種群數(shù)量，但大多已不能構(gòu)成漁業(yè)產(chǎn)量［1－2］。為了保護(hù)珠江水系中的大眼鱖種質(zhì)資源和促進(jìn)淡水漁業(yè)的長(zhǎng)久發(fā)展，需要摸清珠江水系中大眼鱖野生群體的家底，對(duì)該物種的保護(hù)提供理論依據(jù)。

因大眼鱖為我國(guó)特有種，國(guó)外對(duì)其研究并不多見，NCBI(The National Center for Biotechnology Information， 網(wǎng) 址 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)僅11篇文獻(xiàn)關(guān)于大眼鱖的報(bào)道，無(wú)一研究涉及其群體遺傳。國(guó)內(nèi)學(xué)者早期研究主要集中在形態(tài)［3］、食性［4］、年齡、生長(zhǎng)［5］、養(yǎng)殖［6］、繁殖［7］等基礎(chǔ)生物學(xué)方面。有關(guān)其群體遺傳多樣性研究，僅見趙金良等［8］、王偉偉等［9］和吳旭等［10－11］分別應(yīng)用線粒體 DNA(Mitochondrial DNA，Mt DNA)、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)和微衛(wèi)星標(biāo)記 (simple sequence repeat，SSR)技術(shù)進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析，均集中在長(zhǎng)江流域的翹嘴鱖群體，而有關(guān)珠江流域的大眼鱖群體，尙未見報(bào)道。

微衛(wèi)星遺傳標(biāo)記已經(jīng)在漁業(yè)群體遺傳學(xué)方面得到廣泛的應(yīng)用［12－16］。本研究選取珠江水系西江干流廣西三江段 (右江、左江及紅水河)野生大眼鱖群體，利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性研究，比較三個(gè)地理群體的遺傳多樣性狀況，旨在查明大眼鱖的遺傳多樣性狀況和群體遺傳結(jié)構(gòu)、分析其遺傳變異，為該物種多樣性保護(hù)提供必要的遺傳背景資料和數(shù)據(jù)支持 (圖1)。

1 材料與方法

1.1 材料

廣西右江大眼鱖35尾采自白色市江段，左江大眼鱖40尾采自左江崇左市江段，紅水河大眼鱖野生群體37尾采自合山市江段 (表1)，共112尾，均為野生群體?，F(xiàn)場(chǎng)取背肌，無(wú)水乙醇固定，置換3次，使其完全脫水，剩余組織福爾馬林保存?zhèn)洳椤?/p>

圖1 珠江流域大眼鱖采集江段示意圖 (3色代表不同江段，星形代表采集地點(diǎn))Fig.1 The schematic diagram of Pear River for S.kneri sampled.Three colors represented different water areas，and stars represented the places sampled

表1 實(shí)驗(yàn)樣品采集信息Table 1 Experimental materials

1.2 方法

基因組DNA的提取參考文獻(xiàn) ［17］的方法。本實(shí)驗(yàn)利用傳統(tǒng)的酚－氯仿法抽提大眼鱖肌肉組織的基因組DNA，所有抽提所得的基因組DNA都要經(jīng)過(guò)w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的完整性，并利用NanoDrop ND2000C分光光度計(jì)測(cè)定A260/280與 A260/230。

利用現(xiàn)代生物信息技術(shù)，通過(guò)NCBI網(wǎng)站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.)查找大眼鱖的已知相關(guān)序列，然后用微衛(wèi)星序列搜索軟件SSR Hunter來(lái)搜索具有微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列，最后利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物21對(duì)，以S命名;依據(jù)匡剛橋等［18］報(bào)告鱖屬魚類的微衛(wèi)星引物，選取了其中18對(duì)引物來(lái)篩選，以P命名;依據(jù)吳旭等［10－11］報(bào)告的翹嘴鱖微衛(wèi)星10對(duì)，利用10對(duì)來(lái)篩選，以C命名。所有引物由invitrogen公司合成。最終從49對(duì)引物中篩選到19對(duì)用于本研究大眼鱖SSR分析。

然后利用PCR技術(shù)，按25 μL PCR反應(yīng)體系，其中:Taq Polymerase(2.5 U/μL)0.25 μL，上游引物和下游引物 (10 μmol/L)各1 μL，2×PCR Reaction Mix 12.5 μL，模板 DNA(25 ng/μL)2 μL，無(wú)離子超純水8.25 μL。擴(kuò)增條件為:94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入40個(gè)循環(huán) (94℃ 30 s、退火溫度50 s、72℃ 1 min)，最后72℃延伸10 min。每次PCR反應(yīng)均設(shè)不含模板DNA的空白對(duì)照。PCR結(jié)束后，用w=1%的瓊脂糖凝膠電泳及w=6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (PAGE)，漂洗、銀染、顯色、終止顯色、掃描記錄6個(gè)步驟得到最終的微衛(wèi)星DNA電泳圖。

1.3 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)PAGE電泳圖，利用圖片分析軟件Gelpro 32結(jié)合人工判斷對(duì)19個(gè)位點(diǎn)在3個(gè)群體103尾大眼鱖的微衛(wèi)星片段大小進(jìn)行分析;并利用軟件POPGENE 1.32和軟件PIC-CALC計(jì)算3個(gè)群體的遺傳多樣性數(shù)據(jù)，從而得到19個(gè)位點(diǎn)在總?cè)后w及3個(gè)群體的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析并計(jì)算得出遺傳參數(shù):總?cè)后w觀測(cè)等位基因數(shù) (Na)、多態(tài)信息含量(PIC)、觀測(cè)等位基因數(shù) (Na*)、有效等位基因數(shù) (Ne*)、Shannon's Index(I)、觀測(cè)純合子(Obs_Hom)、觀測(cè)雜合子 (Obs_Het)、期望純合子 (Exp_Hom*)、期望雜合子 (Exp_Het*)、Nei期望雜合度 (Nei＊＊)、遺傳雜合度(Ave_Het)、群體內(nèi)近交系數(shù) (Fis)、總近交系數(shù)(Fit)、群體間分化系數(shù) (Fst)、基因流 (Nm)、遺傳距離 (D)。并采用Nei's遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 基因組DNA

部分大眼鱖樣品基因組DNA在w=1%瓊脂糖凝膠電泳見圖2，可見，各泳道條帶均在15000 bp以上，基因組DNA純度高、完整無(wú)剪切，進(jìn)一步采用了分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280為1.8～2.0，A260/A230為2.3～2.4，確定該基因組DNA可用作后續(xù)微衛(wèi)星DNA分析 (表2)。

圖2 部分大眼鱖基因組DNA瓊脂糖電泳圖譜Fig.2 A portion of the agarose electrophoresis of genomic DNA of S.kneri Lane M represented DNA marker，and the rest represented genomic DNA of S.kneri(M為DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)marker，其余為大眼鱖DNA)

表2 19對(duì)可用引物名稱、引物序列、微衛(wèi)星重復(fù)序列及PCR反應(yīng)退火溫度Table 2 The primer name，pimer sequence，repetitive sequence and aealing temperature of 19 pairs of primers adopted

2.2 微衛(wèi)星DNA引物篩選

從49對(duì)引物中篩選出了19對(duì)適用于本實(shí)驗(yàn)的微衛(wèi)星引物，其中:18個(gè)座位的核心序列是完全型，有5個(gè)座位點(diǎn)的核心序列是四堿基重復(fù)序列;1個(gè)座位點(diǎn)的核心序列是三堿基重復(fù);12個(gè)座位點(diǎn)的核心重復(fù)序列是兩堿基重復(fù);有1個(gè)座位點(diǎn)核心序列是復(fù)合型，即為 (GA)11… (GT)… (GA)6;最佳退火溫度范圍在49～61℃之間。引物信息見表2。

2.3 群體遺傳參數(shù)

19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)總?cè)后w的等位基因數(shù)范圍在5～33個(gè)之間，一共檢測(cè)到370個(gè)等位基因，19個(gè)位點(diǎn)的PIC值范圍在0.447～0.947之間。3個(gè)群體19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)范圍在2～26個(gè)之間，19個(gè)位點(diǎn)的PIC值范圍在0.1202～0.9393之間，絕大部分是屬于高度多態(tài)位點(diǎn) (PIC＞0.5)。

大眼鱖總?cè)后w19個(gè)位點(diǎn)的觀察雜合度范圍的平均觀測(cè)等位基因數(shù)、平均有效等位基因數(shù)及平均香農(nóng)指數(shù)分別為19.4737、10.5007、2.3998;總?cè)后w的平均觀測(cè)純合子、平均觀測(cè)雜合子、平均期望純合子、平均期望雜合子、平均Nei期望雜合度、平均遺傳雜合度分別為0.6927、0.3073、0.1431、0.8569、0.8518、0.7206，表明大眼鱖總?cè)后w19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性較為豐富。比較大眼鱖3個(gè)群體19個(gè)位點(diǎn)觀測(cè)等位基因數(shù)、香農(nóng)指數(shù)I、平均觀測(cè)雜合度均為紅水河群體＞左江群體＞右江群體;平均期望雜合子度、Nei期望雜合度和平均遺傳雜合度均為紅水河群體＞右江群體＞左江群體。3群體19個(gè)位點(diǎn)的平均遺傳參數(shù)比較結(jié)果表明，紅水河群體的遺傳多樣性比較豐富(Ave_Het=0.7715)，而左江群體和右江群體相對(duì)較低，并且二者之間遺傳多樣性水平較為接近(0.6921、0.6983)。

總?cè)后w固定指數(shù)表明:大眼鱖總?cè)后w在19個(gè)基因作為表現(xiàn)為雜合子嚴(yán)重缺失，顯著偏離Hardy-Weinberg平衡。而大眼鱖左江群體、右江群體及紅水河群體在某些位點(diǎn)上存在雜合過(guò)剩，而在大部分位點(diǎn)上存在雜合子缺失。

19個(gè)位點(diǎn)3群體間的遺傳分化指數(shù) (0.15＞Fst=0.1539＜0.25)屬于中等遺傳分化水平，群體內(nèi)雜合子缺失嚴(yán)重，群體內(nèi)的近交系數(shù)Fis為0.5761;各座位的基因流分布范圍較廣 (0.1474～8.9091)，平均Nm值為1.3745。C1座位有最大的基因流，Nm=8.9091，而座位P18有最小的基因流，Nm=0.1474。

通過(guò)軟件POPGENE1.32，采用Nei's遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析，由表3可知:右江群體和左江群體之間遺產(chǎn)距離最小 (1.0954)，其次是右江群體和紅水河群體的遺傳距離 (1.1)，遺傳距離最遠(yuǎn)的是左江群體和紅水河群體之間 (1.49)。遺傳相似度也同樣表明了3個(gè)不同地理群體之間的遺傳關(guān)系。由圖3可知:左江群體和右江群體首先聚為一支，再與紅水河群體聚為一支，結(jié)合3群體的地理位置分布，3群體的遺傳距離和遺傳相似度跟3個(gè)群體的地理位置息息相關(guān)。

表3 3個(gè)群體間Nei's氏遺傳距離 (對(duì)角線下方)和遺傳相似度 (對(duì)角線上方)Table 3 The Nei's population genetic distances(lower triangle)and similarities(upper triangle)of S.kneri from three different water areas in Pearl River

圖3 3個(gè)不同水域大眼鱖UPGMA分子系統(tǒng)樹Fig.3 The molecular phylogenetic tree of S.kneri from three water areas in Pearl River by UPGMA method based on the Nei's genetic distances

3 討論

利用生物信息學(xué)方法，自行設(shè)計(jì)了21對(duì)大眼鱖微衛(wèi)星DNA引物，通過(guò)篩選獲得了4對(duì)可應(yīng)用于本實(shí)驗(yàn)的引物。4對(duì)引物對(duì)應(yīng)的微衛(wèi)星DNA的重復(fù)序列均為完全型，其微衛(wèi)星DNA的重復(fù)序列分別為 (AC)9、(AC)39、(CA)13、 (AGG)8;重復(fù)序列次數(shù)最高達(dá)39次，最低也有8次;4個(gè)微衛(wèi)星DNA的PCR最適退火溫度范圍是49～53℃，相對(duì)于通用引物的退火溫度，自行設(shè)計(jì)的引物退火溫度較低;根據(jù)PIC結(jié)果可知，本實(shí)驗(yàn)所開發(fā)的4個(gè)針對(duì)大眼鱖總?cè)后w的微衛(wèi)星DNA標(biāo)記屬于高度多態(tài)性位點(diǎn)。與其他研究者所采用的獲得微衛(wèi)星引物方法相比較［10－11，18－20］，本實(shí)驗(yàn)采用生物信息學(xué)獲得微衛(wèi)星DNA引物的方法，可大大降低實(shí)驗(yàn)成本及提高實(shí)驗(yàn)效率。

19個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的總?cè)后w固定指數(shù)Fix范圍為0.0014～1.0000，表明19個(gè)位點(diǎn)在總?cè)后w內(nèi)表現(xiàn)為雜合子缺失，其對(duì)環(huán)境的應(yīng)對(duì)能力有所下降。遺傳參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，總?cè)后w觀測(cè)等位基因數(shù)(na=19.4737)、香農(nóng)指數(shù) (I=2.3998)、平均雜合度 (Ave_Het=0.7206)、多態(tài)信息含量(0.447＜PIC＜0.947)均顯示:在哈溫平衡下，總體遺傳多樣性水平較為豐富。但3個(gè)群體的遺傳多樣性存在差異，紅水河群體的遺傳多樣性最豐富(Ave_Het=0.7715)，而左江群體和右江群體相對(duì)較低，并且二者之間遺傳多樣性水平較為接近(0.6921、0.6983)。動(dòng)植物的遺傳多樣性受其生活史特性、繁育方式、地理分布、居群生境、物種的進(jìn)化地位等很多因素的影響，統(tǒng)計(jì)分析表明，長(zhǎng)壽命、廣域分布、遠(yuǎn)交、動(dòng)物取食傳播的物種具有較高的遺傳多樣性［21］。可能因?yàn)樽蠼陀医貐^(qū)地質(zhì)結(jié)構(gòu)類似，且相對(duì)復(fù)雜，魚類生活環(huán)境較差，均屬于珠江流域干流上的支流［22］，與外源群體間的基因交流缺乏，左江、右江群體較高的近交系數(shù)也證明了這點(diǎn);而紅水河水域位于廣西省自然保護(hù)區(qū)內(nèi)，穩(wěn)定性較好，基因庫(kù)資源豐富，人為干擾因素少，漁業(yè)自然資源保存較好，且處于珠江的干流［22－23］，便于與其他群體進(jìn)行基因交流。

大眼鱖3群體間遺傳分化指數(shù)Fst為0.1539，介于0.15和0.25之間，屬于中等遺傳分化水平，有15.39%的遺傳變異來(lái)自于群體間，84.61%的遺傳變異來(lái)自于群體內(nèi)，說(shuō)明不同群體之間的差異主要來(lái)自群體個(gè)體間的變異。遺傳分化指數(shù)與基因流呈負(fù)相關(guān)，遺傳分化程度越低，表明基因流越順暢［24］。根據(jù) Hamrick 等［25］和 Slatkin［26］的觀點(diǎn)，若每代遷入個(gè)體數(shù)Nm＞1，基因流就足以抵制遺傳漂變的作用，也同時(shí)防止了種群分化的發(fā)生;若Nm＜1，基因流不足以抵制群體內(nèi)因漂變引起的遺傳分化，即有限的基因流可以促使群體發(fā)生遺傳分化［25－26］。本研究各座位的基因流Nm分布范圍較廣 (0.1474～8.9091)，平均 Nm值為1.3745，表明基因流基本順暢，但群體內(nèi)近交系數(shù)較高(Fis=0.5761)，容易引起遺傳結(jié)構(gòu)的變化。Nei's遺傳距離的聚類結(jié)果表明左江群體與右江群體首先聚為一支，再與紅水河聚為一支。3個(gè)群體的聚類分析表明，大眼鱖微衛(wèi)星分子標(biāo)記的群體聚類與群體的地理分布呈現(xiàn)相關(guān)性:左江和右江的地理距離較近，且在南寧境內(nèi)相連，兩群體交流頻繁，不存在地理隔離導(dǎo)致的生殖隔離，同為一個(gè)小群體，但相對(duì)左江和右江，紅水河水域相對(duì)獨(dú)立，與左江和右江無(wú)近緣水網(wǎng)相交聯(lián)，另外，大眼鱖屬定居性魚類，其自然群體可以在近緣水體中自然繁殖，故紅水河大眼鱖群體與左江和右江群體因地理隔離而導(dǎo)致了相應(yīng)的生殖隔離［27］，體現(xiàn)出了適度的遺傳距離和遺傳分化。

人類對(duì)珠江流域的利用極大地改變了河流水文，而地理環(huán)境的被迫改變必將影響魚類種質(zhì)資源的遺傳多樣性。李向陽(yáng)等［28］在珠江水電開發(fā)對(duì)河流生態(tài)的影響及對(duì)策研究中，表明河流水文改變會(huì)對(duì)生物多樣性產(chǎn)生直接影響。本實(shí)驗(yàn)所選取的3個(gè)江段修建的水電站對(duì)大眼鱖3個(gè)群體遺傳多樣性的影響不容忽視。對(duì)此，在進(jìn)行水電站建設(shè)的同時(shí)，設(shè)計(jì)水電站魚類增值放流站，增設(shè)魚類洄游游道、建設(shè)相應(yīng)的庫(kù)區(qū)自然保護(hù)區(qū)等措施［29－30］，降低水電站對(duì)庫(kù)區(qū)魚類資源造成的地理隔離、群體自交嚴(yán)重或基因交流匱乏的現(xiàn)象。

下一步的研究，有必要對(duì)珠江各流域大眼鱖進(jìn)行更加全面深入地資源調(diào)查和群體遺傳多樣性研究，以期為大眼鱖種質(zhì)資源的保護(hù)和合理利用提供更加可靠的科學(xué)依據(jù)。

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