張 梅，陳佳林，周曉穗，梁士可，李廣宏，王方海

(中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點實驗室//昆蟲學(xué)研究所，廣東廣州510275)

甲基化敏感的擴(kuò)增多態(tài)性分析方法 (MSAP)主要用來檢測樣品DNA的甲基化情況，它是在擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合用甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶消化處理樣品基因組的技術(shù)建立起來的。該方法相對其它測定DNA甲基化程度的技術(shù)有如下優(yōu)點:①可在全基因組范圍內(nèi)檢測CCGG位點的胞嘧啶甲基化情況;②不需知道被測樣品的DNA序列信息，因此可用于DNA序列未知的生物。在高等動物和許多植物上已大量應(yīng)用［1-3］，但在昆蟲上尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用該方法的相關(guān)報道。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要形式，在植物和高等動物上已有大量報道，目前在果蠅、蚜蟲、家蠶、甘藍(lán)夜蛾等昆蟲中也已發(fā)現(xiàn)基因組中存在DNA甲基化現(xiàn)象［4-5］。在螞蟻基因組中，DNA甲基化這種表觀遺傳修飾的現(xiàn)象也已得到證實，且螞蟻不同種屬間在DNA甲基化譜上存在一定的差異［6］。Patalano 等［7］在 Current Opinion in Cell Biology上曾撰文指出社會性昆蟲的多型現(xiàn)象與DNA甲基化相關(guān)。因此，昆蟲中不僅存在大量DNA甲基化現(xiàn)象，且在調(diào)控昆蟲生長發(fā)育和多型性等方面發(fā)揮著重要作用。

白背飛虱Sogatella furcifera(Horvath)為水稻重要害蟲，其成蟲有長翅型和短翅型兩種類型。長翅型成蟲具有遠(yuǎn)距離遷飛的能力，可以大范圍內(nèi)遷移擴(kuò)散;短翅型成蟲則具有產(chǎn)卵量大且產(chǎn)卵期長等特點，可以使種群數(shù)量在短期內(nèi)快速增長。因此，成蟲的長、短翅型比率發(fā)生動態(tài)是預(yù)測稻飛虱數(shù)量的一個重要參數(shù)［8-9］。長期以來人們一直致力于研究稻飛虱的性別分化和繁殖機(jī)理以及翅型分化，一旦取得重要突破，將有助于開發(fā)新的方法控制該種害蟲的危害。

本研究首先對MSAP方法進(jìn)行改進(jìn)，使其可以應(yīng)用在身體較小的昆蟲樣品中，并用白背飛虱為材料，對雌雄性別和長短翅型個體分別進(jìn)行了DNA甲基化式樣檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是雌雄性別間還是長短翅型間，DNA甲基化式樣都存在一定的差異，為今后進(jìn)一步從DNA甲基化的角度探討性別分化和翅型轉(zhuǎn)換的機(jī)理打下良好的基礎(chǔ)，同時也為今后在其它昆蟲中應(yīng)用MSAP方法提供一定的借鑒和指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx

白背飛虱采自廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻試驗田內(nèi)。挑選部分雌雄成蟲及長翅型和短翅型雌成蟲為供試?yán)ハx。

1.2 基因組DNA的提取

分別采集白背飛虱長翅型雄成蟲、長翅型雌成蟲和短翅型雌成蟲各20頭，用微型玻璃勻漿器勻漿抽提基因組DNA，儲存在-20℃的冰箱中待用，具體方法參照TaKaRa公司的基因組DNA提取試劑盒的方法和步驟。

1.3 基因組DNA的酶切

MSAP方法主要參照Xiong等［10］的研究報道，使用了兩種對甲基化敏感性不同的限制性內(nèi)切酶HpaⅡ和Msp I，以及內(nèi)切酶EcoRⅠ，并進(jìn)行了部分修改。選取每樣品基因組DNA 100 ng，分別用EcoR I/Msp I或 EcoR I/Hpa II酶切組合 (TaKaRa公司)在37℃下酶切20 h，隨后在66℃的恒溫下處理20 min使酶滅活，未甲基化的CCGG位點被切割成黏性末端，而甲基化的位點則未被切割。具體酶切體系為15 μL:樣品DNA 100 ng，10倍緩沖液1.5 μL，EcoR I酶 (15 U/μL)0.15 μL，Msp I酶 (10 U/μL)或 Hpa II酶 (10 U/μL)0.2 μL，滅菌水補(bǔ)足體積至15 μL。

1.4 接頭及引物的配制

合成了 Elink1、Elink2和 HMlink1、HMlink2共4個單鏈序列 (見表1)，分別將這些單鏈序列DNA配制成濃度為 500 pmol/μL的溶液，將互補(bǔ)的單鏈序列分別取100 μL配對混勻后于56℃孵育2 min，然后以每2 min遞降2℃的速度逐步冷卻到10℃，使其自身退火形成E接頭和HM接頭備用。引物分為預(yù)擴(kuò)增引物E0、HM0和選擇性擴(kuò)增引物E1、HM1-HM3(見表1)。將預(yù)擴(kuò)增引物配制成500 ng/μL的母液、選擇性擴(kuò)增引物配制成質(zhì)量濃度為300 ng/μL的母液備用。分別取預(yù)擴(kuò)增引物和選擇性擴(kuò)增引物的母液4 μL，加水36 μL配制成50 ng/μL和30 ng/μL的質(zhì)量濃度待用。

表1 MSAP方法中所使用的接頭和引物序列Table 1 Sequences of primers and adapters used for MSAP

1.5 DNA片段與接頭連接

選取各樣品的酶切產(chǎn)物15 μL，分別加入E接頭和HM接頭各1 μL，在T4 DNA連接酶 (TaKa-Ra公司)(350 U/μL)作用下，16℃連接14 h，隨后于65℃下恒溫處理30 min使T4 DNA連接酶失活。按照DNA片段純化試劑盒 (TaKaRa公司)純化上述連接產(chǎn)物。

1.6 連接產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增

將上述各樣品連接產(chǎn)物用ddH2O稀釋10倍，取2 μL作為模板，加入1 μL質(zhì)量濃度為50 ng/μL的E0和HM0引物，在LA Taq酶 (TaKaRa公司)(5 U/μL)作用下進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增。20 μL的反應(yīng)體系，94℃ 1 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，25個循環(huán)，72℃ 10 min，4℃ forever。

預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物用ddH2O稀釋20倍后，取2 μL作為模板，加入E1引物和HM1-3中的任一引物各1 μL，在LA Taq酶 (TaKaRa公司)(5 U/μL)作用下進(jìn)行PCR選擇性擴(kuò)增。20 μL的反應(yīng)體系，94℃1 min，94℃ 30 s，65℃ 30 s(每個循環(huán)降0.7℃)，72℃ 1 min，13循環(huán);94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃1 min，23個循環(huán)，72℃ 10 min，12℃ forever。

1.7 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

將最終得到的各樣品選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%，先50 V恒壓電泳20 min，再經(jīng)130 V恒壓電泳2.5h。電泳完畢后，小心分開兩玻璃板，將固著有聚丙烯酰胺凝膠的親水玻璃板放入預(yù)先準(zhǔn)備好的φ=10%的醋酸固定液中浸泡。隨后進(jìn)行銀染，具體銀染方法參照文獻(xiàn)［11］。

1.8 數(shù)據(jù)分析

在MSAP方法中，常用到DNA內(nèi)切酶Msp I和Hpa II，這2種酶雖然都能識別和分解同樣的5'-CCGG-3'位點，但對DNA甲基化的敏感性不同。根據(jù)EcoRI+MspI或 EcoRI+HpaII組合的酶切樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜，可以將5'-CCGG-3'位點的甲基化式樣分為以下4種類型 (表2)。I:HpaII(H)和MspI(M)泳道中均出現(xiàn)條帶，表明2條DNA鏈中的1條里面胞嘧啶被甲基化，或沒有甲基化發(fā)生，通常被看作未甲基化;II:條帶只出現(xiàn)在HpaII泳道中，在MspI泳道中沒有條帶，表明2條DNA鏈中的1條外面胞嘧啶被甲基化，通常被看作半甲基化;III:條帶只出現(xiàn)在MspI泳道中，在HpaII泳道中沒有條帶，表明2條DNA鏈中的里面胞嘧啶均被甲基化，通常被看作全甲基化;IV:在MspI和HpaII泳道中均沒有條帶出現(xiàn)，表明2條DNA鏈中的外面胞嘧啶均被甲基化。

表2 基因組DNA被Hpa II和Msp I酶切后呈現(xiàn)出的甲基化類型1)Table 2 Methylation patterns of genomic DNA digested by Hpa II and Msp I

2 結(jié)果與分析

2.1 MSAP方法的改進(jìn)

MSAP方法主要由 Xiong等［10］于1999年發(fā)展起來，該方法主要包括DNA提取、雙酶切、接頭連接、兩輪PCR、電泳等幾個步驟。我們參照了Xiong等的方法，對部分環(huán)節(jié)進(jìn)行了適當(dāng)改進(jìn)，使其適用于體型很小的昆蟲，并用白背飛虱具體進(jìn)行了實驗，結(jié)果比較理想。我們主要在如下5個方面進(jìn)行了部分改進(jìn) (見表3):①DNA提取采用了Takara基因組純化試劑盒，不僅提取時間大為縮短，且獲得的基因組DNA純度較高;②酶切時基因組DNA用量從原方法的2 μg減少到100 ng，這樣不但減少了酶的用量，節(jié)約成本，且更適合體形較小、難以收集大量樣本材料的多數(shù)昆蟲;③酶切時間比原先增加了14 h，這樣使得基因組DNA被酶解得更徹底;④接頭連接時間從原先的4 h增加到14 h，這樣可以讓多數(shù)相關(guān)DNA片段連上接頭;帶，這樣就不需要使用放射性標(biāo)記的引物，減少了放射性操作和污染。

表3 MSAP方法被改進(jìn)的5個方面Table 3 Five aspects of MSAP improved in our method

2.2 白背飛虱雌、雄成蟲的MSAP圖譜

利用改進(jìn)后的方法，對白背飛虱雌雄成蟲的基因組DNA進(jìn)行了MSAP分析，利用3對引物組合E1HM1、E1HM2和E1HM3，擴(kuò)增到很多條帶，多數(shù)介于100～600 bp之間 (圖1)，顯示出的帶型表明在白背飛虱雌雄成蟲中既有全甲基化的5'-CCGG-3'位點，也有半甲基化的5'-CCGG-3'位點。同時還發(fā)現(xiàn)白背飛虱雌雄成蟲間的帶型存在一定差異，說明雌雄蟲間基因組的甲基化式樣應(yīng)有所不同。那么基因組甲基化式樣的差異會不會影響白背飛虱的雌雄性別分化?還需今后進(jìn)一步深入研究。

圖1 雌雄白背飛虱樣品的MSAP電泳圖Fig.1 MSAP electrophoretogram of male and female sampless of Sogatella furcifera引物組合為E1HM1，E1HM2和E1HM3;H:由EcoRI+HpaII酶解;M:由EcoRI+MspI酶解;雄:雄蟲樣品;雌:雌蟲樣品;Mark:DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);I:未甲基化條帶;II:半甲基化條帶;III:全甲基化條帶

2.3 白背飛虱雌成蟲長、短翅型的MSAP圖譜

利用改進(jìn)后的方法，也對白背飛虱雌成蟲長、短翅型的基因組DNA進(jìn)行了MSAP分析，利用3對引物組合，擴(kuò)增到的條帶多數(shù)介于100～300 bp之間 (圖2)，顯示出的帶型既有全甲基化的5'-CCGG-3'位點，也有半甲基化的5'-CCGG-3'位點。同時還發(fā)現(xiàn)長翅型樣品和短翅型樣品的帶型存在明顯差異，說明不同翅型間蟲體基因組的甲基化式樣應(yīng)有所不同。那么DNA的甲基化有沒有參與白背飛虱翅型分化的調(diào)控?如果參與的話，其具體調(diào)控機(jī)制又是什么?還有待今后深入研究。

圖2 長、短翅白背飛虱樣品的MSAP電泳圖Fig.2 MSAP electrophoretogram of samples from macropterous and brachypterous female adults of Sogatella furcifera引物組合為E1HM1，E1HM2和E1HM3;H:由EcoRI+HpaII酶解;M:由EcoRI+MspI酶解;短:短翅型雌蟲樣品;長:長翅型雌蟲樣品;Mark:DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);I:未甲基化條帶;II:半甲基化條帶;III:全甲基化條帶

3 討論

MSAP是在擴(kuò)增片段長度多態(tài)性技術(shù)基礎(chǔ)上建立起來的主要用來檢測樣品DNA甲基化情況的一種方法，特別適用于全基因組范圍內(nèi)檢測CCGG位點的胞嘧啶甲基化情況，在高等動物和許多植物上已廣泛應(yīng)用。DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要形式，在脊椎動物和高等植物上已有大量研究成果［1，12］，然而，在無脊椎動物昆蟲中甲基化的研究相對較晚，文獻(xiàn)報道主要集中于這幾年［5］，目前尚未有在昆蟲中應(yīng)用MSAP方法的報道。為了能將MSAP方法應(yīng)用于體型較小的昆蟲，對該方法進(jìn)行了部分改進(jìn):采用Takara試劑盒提取樣品DNA、降低酶切時基因組DNA用量、增加酶切和接頭連接時間、用銀染方法取代放射顯影技術(shù) (具體見結(jié)果中的描述)。利用改進(jìn)后的方法，在白背飛虱中進(jìn)行了具體實驗，成功獲得了與性別或長短翅型相關(guān)聯(lián)的MSAP圖譜，這為將來在其它昆蟲中使用該方法研究基因組DNA甲基化情況提供了一定借鑒和指導(dǎo)價值。

本研究成功獲得了白背飛虱雌雄性別和長短翅型的MSAP圖譜，發(fā)現(xiàn)無論是雌雄性別間，還是長短翅型間，其基因組DNA甲基化式樣都存在一定的差異，說明DNA甲基化可能參與了性別和翅型分化的調(diào)控。這為今后從DNA甲基化的角度研究白背飛虱性別和翅型分化的調(diào)控機(jī)制打下了良好的開端。

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