劉 威，梁婉玲，謝中梁，藍(lán)文健，3，李厚金，楊得坡，3，王來友，5

(1.廣東藥學(xué)院中醫(yī)藥研究院，廣東廣州510006;2.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東廣州510006;3.廣東省現(xiàn)代中藥工程技術(shù)研究開發(fā)中心，廣東廣州510006;4.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東廣州510275;5.廣東省中醫(yī)藥防治代謝性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510006)

長棘海星 (Acanthaster planci)屬于棘皮動物，狀似葵花，渾身長滿毒刺，是熱帶和亞熱帶海域珊瑚礁的主要破壞者，嚴(yán)重威脅海洋生態(tài)安全與生物多樣性。目前，國內(nèi)外對長棘海星的研究大多集中于長棘海星的生態(tài)及活性成分的研究。1990年，Shiomi K等［1］的研究表明長棘海星體內(nèi)的多種毒素能阻斷哺乳動物神經(jīng)肌肉的傳遞引起肝的嚴(yán)重退化;1994年，Shiroma N等［2］發(fā)現(xiàn)長棘海星分泌的毒素能能引起?？群Ｑ笊锏奶颖芊磻?yīng);1998年，Toshiaki T等［3］研究發(fā)現(xiàn)花生四烯酸和α－亞麻酸對長棘海星有誘捕作用;2009年，李厚金等［4］的研究證實(shí)花生四烯酸是長棘海星體內(nèi)主要的必需不飽和脂肪酸，而且體內(nèi)無法合成，需要不斷捕食富含花生四烯酸的珊瑚。近年來，人們發(fā)現(xiàn)共附生真菌與宿主在遺傳、生理、代謝等方面相互滲透進(jìn)化，形成互利共生關(guān)系。長棘海星體內(nèi)有豐富的微生物為其提供有效的化學(xué)防御，不僅是一個潛在的微生物多樣性寶庫，更是天然藥物的一個非常重要的來源途徑。本實(shí)驗(yàn)室多年來先后從中國三亞的長棘海星樣品中分離獲得一批能夠產(chǎn)生新穎結(jié)構(gòu)的活性真菌菌株，并從中分離得到多個新骨架類型和有顯著活性的化合物。如2012年，LAN W J等［5］從Trichoderma sp.培養(yǎng)液提取物中分離得到2個新的sorbicillinoid類似物對多種腫瘤細(xì)胞系有較強(qiáng)的毒性。2013年，Zhao Y等［6］從Ceriporia lacerate的GPY培養(yǎng)發(fā)酵液中分離得到3個新的羊毛甾烷型三萜化合物。因此，開展長棘海星共附生真菌的相關(guān)研究具有非常重要的生態(tài)意義與海洋藥物資源開發(fā)利用的價值。

本文采用平板涂布法從采自三亞珊瑚礁保護(hù)區(qū)的長棘海星樣品中分離得到近200株真菌，采用ITS-rDNA分子系統(tǒng)鑒定方法確定了16株具有代表性的真菌種屬，通過統(tǒng)計學(xué)方法研究了長棘海星共附生真菌的種群多樣性，為下一步深入研究長棘海星共生真菌的次生代謝情況奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

1.1.1 樣品 采自中國三亞珊瑚礁保護(hù)區(qū)的長棘海星活性樣本。水下采樣，將采得的樣本裝入盛有海水的塑料桶，于冰盒保存。48 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室于4℃保存。

1.1.2 試劑與儀器 Bioflux真菌基因組提取試劑盒(Fungal DNA Kit 50 T)，日本Bioflux公司;溶菌酶、蛋白酶K、dNTPs、DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，加拿大 MBI公司;Taq酶，日本 TaKaRa公司;

1.1.3 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g(煮沸0.5 h，取濾液)，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，人工海水1 L，pH 7.0～7.4。

馬丁氏培養(yǎng)基:葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，孟加拉紅 33 mg，瓊脂20 g，人工海水1 L，pH 7.0～7.4。

察氏培養(yǎng)基:蔗糖 30g，K2HPO41g，Mg SO4·7H2O 1.5 g，NaNO33 g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂20 g，人工海水1 L，pH 7.0～7.4。

以上培養(yǎng)基均在121℃下滅菌30 min，用前加入氯霉素200 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 長棘海星活體依次用無菌海水快速清洗數(shù)次，φ=75%乙醇浸泡30 s，無菌海水漂洗3次，無菌濾紙吸干。然后將長棘海星不同部位磨碎，取10 g碎片于裝有90 mL無菌海水的勻漿器中，反復(fù)震蕩，靜置取上清液備用。

1.2.2 共附生真菌的分離純化及保存 取200 μL備用上清液用無菌海水進(jìn)行梯度稀釋10－5、10－6、10－7、10－8。用滅菌涂布棒均勻涂布到相應(yīng)的分離培養(yǎng)基平板上，與25℃倒置培養(yǎng)至肉眼能觀察到真菌菌落，如此反復(fù)純化3次。

純化的菌株轉(zhuǎn)接到新鮮PDA瓊脂平板上培養(yǎng)，待菌落長滿約斜面一半時，置于4℃保存。

1.2.3 純化真菌DNA的提取與ITS-rDNA擴(kuò)增及序列分析 取少量新鮮菌體，按照日本Bioflux公司的真菌DNA提取試劑盒的方法進(jìn)行真菌基因組DNA的提取。以獲得的DNA為模板，采用真菌通用引物ITS1和ITS4對真菌的核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系 (50 μL):模板DNA 2 μL;10× PCR 緩沖液 5 μL，dNTPs 5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1.8 μL，Taq 聚合酶 2 μL，無菌超純水32.4 μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性1 min，55℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后，72℃延伸補(bǔ)齊10 min，最后冷卻至16℃。獲得的產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至廣州華大基因公司測序。

構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹:測序結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫并獲得登錄號，應(yīng)用Blast對所測系列進(jìn)行系列相似性比對，獲得相關(guān)種屬的ITS系列，使用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對，使用MEGA6軟件的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的，進(jìn)化距離的計算按照Kimura2-parameter方法進(jìn)行，可靠性通過1000次Bootstrap計算得出。

1.2.4 種群多樣性分析 以同源性大于97%的菌種定義為同一分類單元，以Shannon-wiener指數(shù)(H)和Pielou均勻度指數(shù)(E)作為計算多樣性的標(biāo)準(zhǔn)。

其中，Pi=Ni/N，H為實(shí)際求得的物種多樣性指數(shù)，Pi是第i種的多度比例，Ni是每一個屬中的菌株數(shù)，N是每個樣品中菌株總數(shù);Hmax為最大的物種多樣性指數(shù)，Hmax=ln S，S為群落中的總物種數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 長棘海星共附生真菌的分子鑒定

2.1.1 ITS序列分析 利用真菌通用引物ITS1和ITS4分別對16株長棘海星共附生真菌基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得長度500～600 bp的單一片段，擴(kuò)增結(jié)果的電泳圖 (見圖1)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，獲得的ITS序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，登錄號為KF999808-KF999822以及KJ723458。測序結(jié)果顯示，所有菌種都有完整的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列 (ITS1和ITS2)和5.8S，及部分18S rRNA和28S rRNA基因序列。用ClustalX軟件對16株真菌的ITS序列進(jìn)行比對分析，發(fā)現(xiàn)5.8S基因序列高度保守，而核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列 (ITS1和ITS2)則具有顯著的多態(tài)性。ITS序列長度范圍在440～530 bp，(G+C)%含量在51% ～61%之間，差異較大 (見表1)。其中F46－1的 (G+C)%含量約52%，與F1－2、F2－3、F16－1等8個菌株的 (G+C)%含量較為相似，但序列長度525 bp，明顯大于后者，表明了F46－1與其他菌株是不同。F1－1與F4－1A的 (G+C)%含量約56%，可能是一類;而F7－1C、F7－1B和F27－1的 (G+C)%含量高達(dá)58%以上，明顯與其他菌株不同。

圖1 長棘海星16株共附生真菌的ITS擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of ITS amplified products of isolates from Acanthaster planci泳道編號為菌株編號，M代表Marker，C為空白對照

表1 長棘海星共附生真菌ITS片段序列 (G+C)%含量Table 1 The(G+C)%content of ITS fragments from the fungi associated with Acanthaster planci

2.1.2 16株長棘海星共附生真菌的系統(tǒng)學(xué)分析將獲得的16株真菌的ITS序列通過Blast與數(shù)據(jù)庫已有序列進(jìn)行比對，均能獲得相似度大于99%的匹配序列 (見表2)。

表2 長棘海星16株共附生真菌ITS序列及其最相似菌序列信息Table 2 Phylogenetic information of ITS of 16 isolates from Acanthaster planci

選取同源性較高的模式菌序列用ClustalX軟件進(jìn)行多序列比對，運(yùn)用MEGA6以鄰接法聚類構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，外群取Mucor racemosus f.sphaerosporus(AJ878775)(見圖2)。

圖2 基于N-J鄰接法構(gòu)建的16株長棘海星共附生真菌ITS系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)1000次Fig.2 Phylogeny illustrating species relationships inferred from neighbor-joining analysis of the ITS gene.Each number indicates the percentage of bootstrap samplings，derived from 1000 samples，supporting the internal branches of 50%or higher.

圖2所示是16株長棘海星共附生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹，分支上為Bootstrap重復(fù)1000次大于50%的支持率。結(jié)果可以看出，16株真菌可以歸為8類。F7－1B、F7－1C、F27－1、F46－1、CHJ3、F10－3分別與 Leptosphaerulina sp.、Neosartorya pseudofischeri、Penicillium citrinum、Pseudallescheria boydii、Fusarium clamydosporum、Fusarium solani的支持率都達(dá)到80%以上 (其中F27－1、F46－1、CHJ3、F10－3的支持率更是達(dá)到了100%)，且分別自成一類，進(jìn)而確定其種屬。而F4－1A和F1－1聚為一類，與AF456917和NR_111837的支持率分別為52%和55%(均＞50%)，初步認(rèn)為這兩株菌分別是Trichoderma atroviride和Trichoderma erinaceum。剩下的8株真菌從進(jìn)化樹上看，親緣關(guān)系非常接近，與Fusarium fujikuroi species complex聚成一個大類，但無法與已知菌株得到有力的支持，只能鑒定為Fusarium屬而無法鑒定到種，需要借助其他方法進(jìn)一步確定。這表明ITS序列對Fusarium fujikuroi species complex不能進(jìn)行很好的區(qū)分。

相似列來源于GenBank，CBS:荷蘭真菌菌種保藏中心;NRRL:美國農(nóng)業(yè)部北方利用研究開發(fā)部;T:典型菌株。

2.2 長棘海星共附生真菌的種群多樣性分析

根據(jù)ITS序列及系統(tǒng)學(xué)分析結(jié)果，可知長棘海星共附生真菌主要集中在 Ascomycota門的4目(Hypocreales、 Eurotiales、 Pleosporales、 Microascales)，5屬 (Trichoderma、Penicillium、Neosartorya、Leptosphaerulina、Pseudallescheria)，以及Deuteromycota門的 1目 (Meliolales)，1屬 (Fusarium，有性型為Gibberella)。其中，F(xiàn)usarium是長棘海星共附生真菌的優(yōu)勢種群 (10株)，屬于Fusarium fujikuroi species complex。

長棘海星共附生真菌多樣性指數(shù)為1.247，均勻度指數(shù)為0.450，由此可見，長棘海星樣品上菌株種類較少，而且菌體的個體數(shù)在鐮刀屬上表現(xiàn)為高度富集，均勻度比較低。

3 結(jié)論

基于ITS-rDNA的多態(tài)性的序列分析可獲得相對足夠的信息進(jìn)行生物親緣關(guān)系的研究，廣泛應(yīng)用于真菌的屬種間及部分種內(nèi)水平的系統(tǒng)學(xué)研究［7－9］。但對于ITS區(qū)差異小的菌株如某屬種的復(fù)合體，ITS就不適合屬內(nèi)種的鑒定，此時必須結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征，或進(jìn)行多態(tài)位點(diǎn)基因序列的分析。

本文從南海三亞珊瑚礁保護(hù)區(qū)的長棘海星樣品中分離純化得到近200株共附生真菌，并對16株進(jìn)行鑒定，但所選的ITS-rDNA片段不能很好區(qū)分其中的8株鐮刀屬，它們均屬于復(fù)合種Fusarium fujikuroi species complex(GFC)。GFC是由至少10個不同的交配群組成，種內(nèi)形態(tài)特征非常相似，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類方法難以區(qū)分［10］。Ma等［11］發(fā)現(xiàn)利用 TEF－1基因片段可將 F.fujikuroi、F.veticillioides和 F.proliferatum很好地區(qū)分開來，而且重復(fù)性好。因此，TEF－1基因可用于GFC復(fù)合種內(nèi)的分子生物學(xué)鑒定［12］。

基于ITS序列分析的海洋生物共附生真菌的分子鑒定方法表明長棘海星是微生物群落多樣性豐富的宿主。對長棘海星進(jìn)行深入的共附生真菌研究，尤其是天然產(chǎn)物分子多樣性的研究具有潛在而重要的藥物開發(fā)價值和生態(tài)意義。

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