胡志剛，周 蕾，丁樹哲

（1.江西師范大學(xué)體育學(xué)院，江西南昌330022；2.南昌工學(xué)院，江西南昌330108；3.華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海200241）

運動人體科學(xué)

有氧訓(xùn)練對力竭運動大鼠線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔的影響

胡志剛1，周 蕾2，丁樹哲3

（1.江西師范大學(xué)體育學(xué)院，江西南昌330022；2.南昌工學(xué)院，江西南昌330108；3.華東師范大學(xué)體育與健康學(xué)院，上海200241）

從肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）的角度，探討有氧訓(xùn)練抗運動疲勞的效應(yīng)和機(jī)制。方法：24只SD大鼠隨機(jī)分成對照組（D）、力竭運動組（L）和有氧訓(xùn)練組（T），每組8只，T組進(jìn)行6周有氧訓(xùn)練后，將L組進(jìn)行力竭游泳運動，記下至力竭時間，T組再進(jìn)行同等時間的游泳運動，運動結(jié)束后即刻處死大鼠，并進(jìn)行MPTP開放檢測、線粒體膜電位檢測及線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測。結(jié)果：1）與D組相比，T組和L組MPTP開放檢測吸光值顯著性下降（P＜0.01）；與T組相比，L組MPTP開放檢測吸光值顯著性下降（P＜0.05）。2）與D組相比，T組和L組線粒體膜電位檢測熒光值顯著性升高（P＜0.01）；與T組相比，L組線粒體膜電位檢測熒光值顯著性升高（P＜0.05）。3）與D組相比，T組和L組線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測吸光值顯著升高（P＜0.05和P＜0.01）；與T組相比，L組線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測吸光值顯著升高（P＜0.05）。結(jié)論：力竭運動會引起MPTP的高通透性開放，造成線粒體膜電位降低，線粒體Ca2＋大量釋放，而有氧訓(xùn)練可以顯著性地降低MPTP的開放程度，減少線粒體膜電位和Ca2＋的丟失，從而減少線粒體的損傷。

有氧訓(xùn)練；力竭運動；線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔；膜電位；鈣離子轉(zhuǎn)運

線粒體通透性轉(zhuǎn)運孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）低通透性開放在維持線粒體和細(xì)胞正常的生理功能方面起非常重要的作用。它參與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控及生理性鈣振蕩，同時可能防止線粒體鈣超載；它還參與ATP／ADP的轉(zhuǎn)運和能量代謝。但MPTP高通透性開放是一種病理性的不可逆開放，會造成線粒體膜電位降低、ATP衰竭、氧化磷酸化去偶聯(lián)、線粒體大幅度腫脹、外膜破裂、內(nèi)外膜間促凋亡因子的釋放等，從而細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死［1］。劇烈的運動會導(dǎo)致機(jī)體活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）的生成急劇增加，不及時清除就會導(dǎo)致ROS的堆積。高濃度的ROS是一種有效的MPTP誘導(dǎo)劑［2－3］，它會導(dǎo)致MPTP的高通透性開放。此外，在ROS及其他機(jī)械或代謝等各方面的影響下，會導(dǎo)致運動時Ca2＋的轉(zhuǎn)運失去平衡，細(xì)胞漿中高濃度的Ca2＋導(dǎo)致線粒體大量攝取Ca2＋，使得線粒體Ca2＋超載，引起Ca2＋誘導(dǎo)的線粒體Ca2＋釋放現(xiàn)象（Ca2＋－induced release of Ca2＋from mitochondria，mCICR），使得MPTP開放［4］。而有氧訓(xùn)練可顯著提高機(jī)體的有氧代謝水平，增進(jìn)有氧工作能力，并提高機(jī)體線粒體基質(zhì)酶及呼吸鏈酶活性，降低糖酵解酶活性，減少線粒體的氧化損傷，降低線粒體DNA缺失突變率，使線粒體產(chǎn)生適應(yīng)性變化，提高氧化磷酸化功能［5］。通過觀察力竭運動后疲勞狀態(tài)下MPTP的變化，以及有氧訓(xùn)練對MPTP的積極影響，進(jìn)一步揭示運動疲勞的機(jī)制及預(yù)防。

1 材料和方法

1.1 材料

HEPES，D－甘露醇，牛血清蛋白，α－硫辛酸（LA），羅丹明123，偶氮砷為Sigma公司產(chǎn)品，Bradford試劑盒由上海朝瑞生物科技有限公司提供，實驗用SD大鼠購自江西醫(yī)學(xué)院，嚴(yán)格按動物實驗規(guī)定飼養(yǎng)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組和訓(xùn)練方案 健康雄性SD大鼠24只，體重（221±14）g，隨即分成對照組、力竭運動組和有氧訓(xùn)練組，每組8只。對照組和力竭運動組正常飼養(yǎng)，僅有氧訓(xùn)練組進(jìn)行無負(fù)重游泳訓(xùn)練，每周訓(xùn)練6 d，每天1次，共6周，第一、二周每次訓(xùn)練45 min，第三、四周增加為每次訓(xùn)練60 min，最后兩周每次訓(xùn)練90 min。有規(guī)律的有氧訓(xùn)練可以延長大鼠運動至力竭的時間［6］，因此，6周訓(xùn)練結(jié)束后，力竭運動組大鼠進(jìn)行力竭游泳運動，記下至力竭時間，有氧訓(xùn)練組再進(jìn)行同等時間的游泳運動，運動結(jié)束后即刻處死大鼠。食用飼料按60 g／800 g體重供給［7－9］。

1.2.2 線粒體的提取 所有大鼠斷脊椎處死后，迅速取出股四頭肌，剪碎置于10倍線粒體分離介質(zhì)中（225 mmol／L甘露醇、75 mmol／L蔗糖和20 mmol／L Hepes，0.5 mmol／L EGTA和1%牛血清白蛋白（p H7.2））用勻漿機(jī)勻漿（除非注明，實驗均于冰水浴中操作）。勻漿液于4℃，800 g離心10 min，除去細(xì)胞碎片及細(xì)胞核，取上清進(jìn)一步以10 000 g離心10 min，所得沉淀即為線粒體。線粒體蛋白含量用Bradford檢測試劑盒進(jìn)行檢測，得到的線粒體按12 mg／ml蛋白濃度用MPTP測試介質(zhì)懸浮并置冰上保存，使用前用MPTP測試介質(zhì)稀釋至0.3 mg／ml蛋白濃度。MPTP測試介質(zhì)含230 mmol／L甘露醇、70 mmol／L蔗糖和3 mmol／L Hepes（p H7.4）。

1.2.3 MPTP開放檢測 MPTP開放引起的線粒體內(nèi)膜對甘露醇和蔗糖高通透性造成線粒體膨脹，表現(xiàn)為線粒體光密度（optical density）減少。因而可通過測定光密度值變化反映MPTP開放。參照Petronilli等［10］方法，石英杯中加入3 ml MPTP測試介質(zhì)，然后根據(jù)線粒體的蛋白濃度加入一定量的線粒體，用紫外分光光度計檢測540 nm處的吸光值，檢測溫度為20℃。

1.2.4 線粒體膜電位檢測 線粒體膜電位（ΔΨm）敏感探針羅丹明123（Rh123）由于ΔΨm電負(fù)性儲積在線粒體內(nèi)，MPTP開放會引起ΔΨm的崩潰［11］，導(dǎo)致儲積在線粒體內(nèi)的Rh123釋放出來，使得熒光強(qiáng)度升高。因此，檢測測試體系內(nèi)Rh123的熒光變化可反映ΔΨm的變化。參照Emaus等［12］的方法，EP管中加入3 ml MPTP測試介質(zhì)，然后分別加入一定量的線粒體和Rh123（終濃度為30 nmol／L），37℃避光染色45 min，然后在熒光光度計上檢測Rh123的熒光強(qiáng)度值，激發(fā)波長—發(fā)射波長：488 nm～525 nm，測試溫度為20℃。

1.2.5 線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測 偶氮砷Ⅲ（AⅢ）是一種Ca2＋指示劑，具有靈敏度高，對Ca2＋選擇性強(qiáng)，膜不通透等特點，可靈敏地反映Ca2＋的連續(xù)變化［13］。參照Frei等［14］方法，EP管中加入一定量的線粒體和3ml MPTP測試介質(zhì)，然后分別加入50 μmol／L AⅢ作為Ca2＋指示劑，室溫避光染色45 min，在雙光束紫外分光光度計上檢測675～685處的吸光值，測試溫度為20℃。測試系統(tǒng)內(nèi)的Ca2＋濃度降低和升高表明線粒體攝取和外排Ca2＋，從而反映線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)用Excel和SPSS 13.0進(jìn)行處理和統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差分析對組間差異進(jìn)行比較。

2 實驗結(jié)果

2.1 MPTP開放檢測結(jié)果

由表1可以看出，與對照組相比，有氧訓(xùn)練組和力竭運動組MPTP開放檢測吸光值顯著性下降P＜0.01；與有氧訓(xùn)練組相比，力竭運動組MPTP開放檢測吸光值顯著性下降P＜0.05。

表1 各組大鼠MPTP開放檢測吸光值

2.2 線粒體膜電位檢測結(jié)果

由表2可以看出，與對照組相比，有氧訓(xùn)練組和力竭運動組線粒體膜電位檢測熒光值顯著性升高P＜0.01；與有氧訓(xùn)練組相比，力竭運動組線粒體膜電位檢測熒光值顯著性升高P＜0.05。

表2 各組大鼠線粒體膜電位檢測熒光值

2.3 線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測結(jié)果

由表3可以看出，與對照組相比，有氧訓(xùn)練組線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測吸光值顯著升高P＜0.05；與對照組相比，力竭運動組線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測吸光值顯著升高P＜0.01；與有氧訓(xùn)練組相比，力竭運動組線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測吸光值顯著升高P＜0.05。

表3 各組大鼠線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測吸光值

3 討論

MPTP是線粒體膜上的一種通道，Zam zamin等［7］報道MPTP至少由胞質(zhì)的己糖激酶（hexokinase－1）、外膜的外周苯二氮卓受體（peripheral benzodia－zepine receptor，PBR）、電壓依賴性陰離子通道（voltage－ependent anion channel，VDAC）、肌酸激酶、內(nèi)膜的腺苷酸轉(zhuǎn)運蛋白（adenine nucleotide translocator，ANT）及基質(zhì)的親環(huán)素D（cyclophilin D）組成［15］。但目前公認(rèn)的觀點是VDAC與ANT是MPTP的必要和主要組成部分［16］。MPTP受到多種因素的調(diào)控，Ca2＋、NAD（P）＋、ROS等能促使轉(zhuǎn)運孔的開放，而Mg2＋、小于7的p H值環(huán)境以及環(huán)孢菌素A（Ciclosporin A，CsA）等能抑制轉(zhuǎn)運孔的開放［2－3］。

力竭運動對線粒體產(chǎn)生損傷并削弱線粒體的功能，線粒體在短時間內(nèi)結(jié)構(gòu)功能下降，MPTP膜通透性發(fā)生改變，造成線粒體膜電位降低、ATP衰竭、氧化磷酸化去偶聯(lián)、線粒體大幅度腫脹、外膜破裂、內(nèi)外膜間促凋亡因子的釋放等，從而細(xì)胞發(fā)生凋亡或壞死［1］，而線粒體的這一系列變化，也是引起運動疲勞的主要因素［17］。力竭運動導(dǎo)致MPTP膜通透性改變的機(jī)制尚不清楚，但在ROS及其他機(jī)械或代謝等各方面的影響下，會引起mCICR現(xiàn)象，從而導(dǎo)致MPTP開放，并且高濃度的ROS本身就是一種有效的MPTP誘導(dǎo)劑。有氧訓(xùn)練可以提高機(jī)體有氧代謝能力，提高有氧代謝酶的活性，加快ROS的清除速度，對線粒體的結(jié)構(gòu)和功能也能產(chǎn)生積極的效應(yīng)，亦可在一定程度上對MPTP的通透性產(chǎn)生積極的影響。

從實驗結(jié)果可以看出，力竭運動組和有氧訓(xùn)練組與對照組相比，MPTP開放檢測吸光值顯著性下降，表明MPTP不再處于生理性的低通透性開放，而是處于或接近于不可逆的高通透性的開放，引起了線粒體本身的膨脹反應(yīng)。有氧訓(xùn)練組和力竭運動組進(jìn)行了同樣時間的游泳運動，而有氧訓(xùn)練組MPTP開放檢測吸光值要顯著高于力竭運動組，也即表明有氧訓(xùn)練組MPTP的開放程度要顯著性低于力竭運動組。線粒體膜電位和線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運能夠進(jìn)一步反映MPTP的變化情況。與對照組相比，有氧訓(xùn)練組和力竭運動組線粒體膜電位檢測熒光值顯著性升高，熒光值升高反映的是MPTP開放引起ΔΨm的崩潰，說明有氧訓(xùn)練組和力竭運動組MPTP都處于開放狀態(tài)，但是有氧訓(xùn)練組膜電位的變化要顯著低于力竭運動組的變化，從而反映的是有氧訓(xùn)練組MPTP的開放程度要顯著性低于力竭運動組，而通過線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測情況能夠進(jìn)一步確定這一結(jié)果。與對照組相比，有氧訓(xùn)練組和力竭運動組線粒體Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測吸光值均顯著升高，吸光值升高反映MPTP開放引起線粒體釋放Ca2＋，但是有氧訓(xùn)練組Ca2＋轉(zhuǎn)運檢測熒光值要顯著低于力竭運動組。三項檢測指標(biāo)的結(jié)果出現(xiàn)高度一致，故推測力竭運動會引起MPTP的高通透性開放；有氧訓(xùn)練組大鼠顯然并未力竭，但也會引起MPTP不同程度的開放；有氧訓(xùn)練組在經(jīng)過系統(tǒng)的有氧訓(xùn)練后，進(jìn)行力竭運動組同等強(qiáng)度的運動，對比未訓(xùn)練的力竭運動組，MPTP開放程度明顯降低，有效地抑制了MPTP的開放程度。

MPTP高通透性的開放是結(jié)構(gòu)功能下降的消極反應(yīng)。潘華山等人的研究也發(fā)現(xiàn)，運動疲勞組線粒體結(jié)構(gòu)與周圍組織分界不清，基膜缺損，線粒體數(shù)較少，嵴嵴破壞溶解改變、消失明顯，嵴上顆粒減少或消失，肌絲雜亂、溶解，無明顯完整的肌節(jié)結(jié)構(gòu)，持續(xù)運動對骨骼肌線粒體產(chǎn)生了損傷［18］。付玉等人的研究也發(fā)現(xiàn)，從線粒體呼吸鏈逸出形成的活性氧導(dǎo)致線粒體膜通透性升高，線粒體跨膜電位降低，ATP合成減少，持續(xù)的活性氧氧化作用使線粒體DNA損傷增多，導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)功能嚴(yán)重受損，促進(jìn)細(xì)胞衰老甚至死亡［5］。這都與本文研究結(jié)果高度一致。在力竭運動中，不論MPTP的高通透性開放是機(jī)械摩擦的刺激引起還是代謝產(chǎn)物活性氧引起，都會造成線粒體的損傷，降低運動能力。而有氧訓(xùn)練可以提高有氧代謝能力，減少線粒體的損傷，降低MPTP的開放程度，使之更趨近于生理性的開放狀態(tài)，加強(qiáng)物質(zhì)代謝的轉(zhuǎn)運和能量代謝，而非病理性的高通透性狀態(tài)。有氧訓(xùn)練的這種積極作用，可能是通過提高線粒體相關(guān)酶活性、降低線粒體DNA缺失突變率、使線粒體產(chǎn)生適應(yīng)性變化、提高氧化磷酸化功能來實現(xiàn)的［5］。

4 結(jié)論

實驗結(jié)果提示，力竭運動會引起MPTP的高通透性開放，造成線粒體膜電位降低，線粒體Ca2＋大量釋放，而有氧訓(xùn)練可以顯著性地降低MPTP的開放程度，減少線粒體膜電位和Ca2＋的丟失，從而減少線粒體的損傷。

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責(zé)任編輯：郭長壽

Effects of Aerobic Training to Exhaustive Exercise Rat Mitochondrial Permeability Transition Pore

HU Zhigang1，ZHOU Lei2，DING Shuzhe3
（1.Jiangxi Normal University，Nanchang 330022，Jiangxi，China；2.Nanchang Institute of Science and Technology，Nanchang 330108，Jiangxi，China；3.East China Normal University，Shanghai 200241，China）

From the mitochondria permeability transition pore perspective，we study effect and mechanism of aerobic training on sports fatigue.Methods：24 SD rats were randomly divided into control group（D），exhaustive exercise group（L）and aerobic training group（T），8 rats in each group，T group for 6 weeks of aerobic training，group Lperformed exhaustive swimming exercise time to exhaustion，note，T group again the same time swimming exercise，the rats were sacrificed immediately after exercise and MPTP open detection，detection of mitochondrial membrane potential and mitochondrial Ca2＋translocation detection.Results：（1）compared with Dgroup，T group and Lgroup MPTP open detection light absorption value decreased significantly（P＜0.01）；compared with Tgroup，L group，MPTP open detection light absorption value decreased significantly（P＜0.05）.（2）compared with D，T group and L group，the mitochondrial membrane potential measured fluorescence values increased significantly（P＜0.01）；compared with Tgroup，L group of mitochondrial membrane potential detection fluorescence values increased significantly（P＜0.05）.（3）compared with Dgroup，T group and Lgroup of mitochondrial Ca2＋transport detection light absorption values significantly increased（P＜0.05 and P＜0.01）；compared with Tgroup，L group of mitochondrial Ca2＋transport detection light absorption value was significantly increased（P＜0.05）.Conclusion：exhaustive exercise can cause MPTP high permeability open，resulting in decreased mitochondrial membrane potential，mitochondrial Ca2＋release，whereas aerobic training can significantly reduce the degree of openness of MPTP，reduce the loss of mitochondrial membrane potential and Ca2＋，thereby reducing the mitochondrial damage.

aerobic exercise；exhaustive exercise；mitochondria permeability transition pore；membrane potential；calcium ion transport

G804.7

A

1004－0560（2015）03－0064－04

2015－02－12；

2015－03－09

胡志剛（1984—），男，講師，碩士，主要研究方向為機(jī)能評定、運動疲勞的恢復(fù)與機(jī)制。