秦亞東，周娟娟，汪榮斌,3

（1安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，2蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心，3安徽中藥資源研究所，安徽蕪湖241317）

白芍多糖顆?；钚蕴棵撋囼?yàn)研究*

秦亞東1，周娟娟2，汪榮斌1,3

（1安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校藥學(xué)系，2蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心，3安徽中藥資源研究所，安徽蕪湖241317）

目的：優(yōu)化白芍多糖顆?；钚蕴棵撋に嚒７椒ǎ阂远嗵敲撋屎投嗵潜Ａ袈蕿橹笜?biāo)，探索顆粒活性炭用量、pH值、吸附時(shí)間、脫色溫度對(duì)白芍多糖脫色效果的影響。結(jié)果：顆?；钚蕴繉?duì)白芍多糖最優(yōu)脫色工藝為：顆?；钚蕴坑昧繚舛?.5%，溫度為25℃，調(diào)節(jié)pH=7.5，脫色2 h。白芍多糖脫色率為64.25%，保留率為71.33%。結(jié)論：顆?；钚蕴靠捎糜诎咨侄嗵堑拿撋?。

白芍；多糖；顆?；钚蕴浚幻撋囼?yàn)

糖是自然界中含量最豐富的生物聚合物，絕大部分生物都含有多糖。近些年來從中藥提取出來的多糖已被證實(shí)具有多種生物活性并已經(jīng)在臨床上正式應(yīng)用的藥物，如靈芝多糖[1]、香菇多糖等[2]。隨著對(duì)中藥多糖研究的不斷深入，從中藥材中提取出來的多糖一般多為總多糖，由于多糖中存在著一些核酸、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)的存在嚴(yán)重干擾和阻礙了多糖的進(jìn)一步研究。故而多糖除雜，提高其純度，更利于多糖的理化性質(zhì)、生物活性等方面的深入研究。大部分中藥多糖溶液具有顏色，不僅影響了多糖的純度，更給多糖的深入研究帶來了一定的困難。因此中藥多糖脫色工藝就成了精制多糖的重要環(huán)節(jié)。

多糖溶液脫色方法[3-4]主要有有氧化法（過氧化氫、次氯酸鈉等）、離子交換法（各種不同型號(hào)的樹脂）、金屬絡(luò)合法、吸附法（活性炭、硅藻土等）。氧化法有可能對(duì)多糖的三維空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，離子交換樹脂法可能對(duì)不同類型的多糖產(chǎn)生的作用不同。顆?；钚蕴枯^易于從多糖溶液中濾除，活性炭比表面積較大，物理吸附，一般不會(huì)對(duì)多糖的空間結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。基于以上原因，本文選擇活性炭作為脫色劑研究其對(duì)白芍多糖脫色效果的影響。為白芍多糖的脫色工藝提供一些參考。

1 材料與儀器

美國(guó)Agilent紫外分光光度計(jì)Cary60、德國(guó)SIGMA離心機(jī)3-18K、瑞士梅特勒電子天平MS104S、河北武強(qiáng)縣億達(dá)儀表廠華強(qiáng)酒精計(jì)；試驗(yàn)所用白芍采集于安徽亳州地區(qū)白芍種植基地，由安徽中藥資源研究所劉曉龍研究員鑒定為Paeonia lactiflora Pall；葡萄糖(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110833-201205)、苯酚等試驗(yàn)用試劑均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 白芍多糖的制備

取白芍干燥根莖約100 g，粉碎，過60目篩，加10倍量無水乙醇浸泡過夜，濾過，濾渣再加8倍量無水乙醇浸泡過夜，濾過，除去可以溶于醇部分的小分子雜質(zhì)、部分色素等雜質(zhì)。

保留藥渣、置于通風(fēng)處，自然干燥，分別使用8倍量、6倍量蒸餾水回流提取2次，每次2 h，合并濾液，水浴濃縮至適量。放至室溫，慢慢加入無水乙醇同時(shí)振搖，調(diào)節(jié)乙醇濃度為90%，置于冰水浴中，靜置過夜，離心得到多糖沉淀，使用無水乙醇反復(fù)沖洗數(shù)次，真空減壓干燥即得白芍多糖粉末。

2.2 白芍多糖溶液的配制

取“2.1”項(xiàng)下制備的白芍多糖干燥粉末約100 mg，用蒸餾水定容于50 mL量瓶中，60℃加熱以促進(jìn)溶解，然后5 000 r/min離心，去除不溶部分。即得橙黃色白芍多糖溶液，濃度為2 mg/mL。

2.3 色素最大吸收波長(zhǎng)的選擇

取“2.2”項(xiàng)下制備的溶液在可見光區(qū)（400 nm-700 nm）進(jìn)行掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒有最大吸收，色素吸收呈現(xiàn)普遍吸收的特點(diǎn)。從溶液互補(bǔ)色角度考慮，選擇450 nm為色素吸收檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制備

精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL分別置于具塞棕色試管中，于上述5只試管中按順序分別加入0.9、0.8、0.6、0.2、0.0 mL蒸餾水，再加6.0%的苯酚溶液1.0 mL，振搖均勻，最后加濃硫酸5.0 mL，立即振搖均勻后，100℃水浴中加熱20 min，取出放至室溫，490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（A）值。以蒸餾水同法操作，作為空白對(duì)照。以葡萄糖濃度(C, μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，得到回歸方程：A=8.3643C+0.0285（r=0.9995）。試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在2.4～14.4 μg/mL之間，其濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.5 多糖脫色率、保留率的測(cè)定

多糖含量采用經(jīng)典的硫酸-苯酚顯色法進(jìn)行測(cè)定，顯色后在490 nm下測(cè)定A值，并按多糖保留率（%）=脫色后多糖含量/脫色前多糖含量×100%來計(jì)算，多糖含量依據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行計(jì)算，顯色操作方法見“2.4”；在450 nm下測(cè)定脫色前后多糖溶液吸光度A值，脫色率按脫色率（%）=（溶液脫色前吸光度值-溶液脫色后吸光度值）/溶液脫色前吸光度值×100%來進(jìn)行計(jì)算。

2.6 顆粒活性炭脫色單因素試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下制備的白芍多糖溶液（2 mg/mL），每組取20 mL進(jìn)行顆?；钚蕴棵撋珕我蛩卦囼?yàn)，分別考察加入量、pH、溫度、時(shí)間對(duì)脫色率、多糖保留率的影響。

2.6.1 顆?；钚蕴考尤肓繉?duì)多糖脫色效果的影響

取“2.2”項(xiàng)下制備的白芍多糖溶液（2 mg/mL）6份，每份20 mL，用0.1%NaOH調(diào)節(jié)pH=8，分別加入不同百分含量（顆?；钚蕴抠|(zhì)量/多糖質(zhì)量百分比）的顆?；钚蕴?，25℃下脫色處理3 h。按“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算脫色率及保留率。

圖1 活性炭濃度對(duì)脫色效果的影響

由圖1可見，當(dāng)顆?；钚蕴繚舛葟?.5%增大到1.5%的過程，多糖的脫色率增加幅度較大，多糖的保留率緩慢降低；當(dāng)顆?；钚蕴繚舛瘸^1.5%后，多糖脫色率增加幅度大大降低，同時(shí)多糖保留率下降較為劇烈。因此，顆?；钚蕴坑昧坎灰顺^1.5%。2.6.2脫色時(shí)間對(duì)多糖脫色效果的影響

取“2.2”項(xiàng)下制備的白芍多糖溶液（2 mg/mL）6份，每份20 mL，用0.1%NaOH條件pH=8，加入1.5%的顆粒活性炭，在25℃下考察不同脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響。按“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算脫色率及保留率。效果的影響。按“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算脫色率及保留率。

由圖2可見，脫色時(shí)間在1～2 h內(nèi)隨著時(shí)間的增加，脫色率增加幅度較大，多糖保留率迅速降低；當(dāng)脫色時(shí)間超過2 h以后脫色率及多糖保留率均變化緩慢。因此脫色時(shí)間為2 h，效果較理想。

2.6.3 pH對(duì)多糖脫色率及保留率的影響

取“2.2”項(xiàng)下制備的白芍多糖溶液（2 mg/mL）6份，每份20 mL，用0.1%NaOH條件pH=8，加入1.5%的顆粒活性炭，在25℃下考察不同脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響。按“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算脫色率及保留率。

由圖3可見，多糖溶液pH值從酸性6.5增加到堿性9.0的過程中多糖保留率在逐漸下降，而多糖脫色率在pH=7.5時(shí)有一峰值，再繼續(xù)增加pH，脫色率緩慢降低而后趨于穩(wěn)定。綜上考慮pH=7.5較為合適。

2.6.4 溫度對(duì)多糖脫色率及保留率的影響

取“2.2”項(xiàng)下制備的白芍多糖溶液（2 mg/mL）6份，每份20 mL，用0.1%NaOH條件pH=8，加入1.5%的顆粒活性炭，分別在不同的溫度下考察脫色時(shí)間對(duì)脫色效果的影響，脫色時(shí)間為3 h。按“2.5”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算脫色率及保留率。

由圖4可見，在25～45℃范圍內(nèi)，脫色率及保留率變化均不明顯，且溫度逐漸增高后多糖保留率呈下降趨勢(shì)。另外從節(jié)能角度綜合考慮，確定25℃為脫色溫度。

2.7 正交試驗(yàn)

由單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取顆?；钚蕴繚舛取⒚撋珪r(shí)間、pH為因素，設(shè)計(jì)3因素3水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交設(shè)計(jì)表L9（33）表1、3，考慮到脫色作用體現(xiàn)在脫色率及多糖保留率兩個(gè)方面，故各賦予50%加權(quán)，求得加權(quán)后的綜合得分=脫色率/2+多糖保留率/2。

圖2 脫色時(shí)間對(duì)對(duì)脫色效果的影響

圖3 pH對(duì)對(duì)脫色效果的影響

圖4 溫度對(duì)對(duì)脫色效果的影響

表1 因素水平表

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

表3 方差分析表

由表2、3可以看出，各因素對(duì)脫色率的影響主次為A＞C＞B、對(duì)多糖保留率影響主次為B＞C＞A；其中A因素為主要因素，且具有呈顯著性差異，故應(yīng)選A3、B因素從脫色率角度看應(yīng)選B2，且在保留率方面無顯著性差異，故選B2；C因素分析同B因素，故選C2。故最佳脫色條件為A3B2C2,即：加入多糖的1.5%顆?；钚蕴?，脫色溫度為25℃，調(diào)節(jié)pH= 7.5,吸附2 h。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下制備的多糖溶液，按照最優(yōu)脫色方案A3B2C2進(jìn)行脫色試驗(yàn)，測(cè)得脫色率及多糖保留率平均值分別為65.16%、71.53%,RSD分別為1.36%（n =5）、2.07%（n=5）。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)上述方案為最優(yōu)方案，結(jié)果重復(fù)性符合要求。

3 討論

本文使用水提醇沉技術(shù)得到白芍多糖，呈黃色粉末狀。制備成2 mg/mL溶液使用紫外可見分光光度法在可見光區(qū)掃描未發(fā)現(xiàn)色素存在最大吸收波長(zhǎng)，根據(jù)溶液的顏色及互補(bǔ)色，選擇450 nm作為色素吸收波長(zhǎng)。

中藥多糖一般多具顏色，這些顏色為不同色素所形成，由于色素的存在，嚴(yán)重影響了中藥多糖的進(jìn)一步研究和利用。目前中藥多糖提取液脫色的方法主要包括化學(xué)法、物理吸附法等，化學(xué)法一般采用雙氧水、次氯酸鈉等試劑對(duì)多糖溶液進(jìn)行脫色，由于在脫色過程中可能對(duì)多糖產(chǎn)生氧化作用，為了較好的保留多糖活性，故應(yīng)慎用；樹脂脫色成本高、操作復(fù)雜，難于工業(yè)化使用，因此工業(yè)化使用較少；而活性炭具有無毒、無味、可反復(fù)使用、效率高、速度快、成本較低等特點(diǎn)[5]，對(duì)多糖空間結(jié)構(gòu)較少產(chǎn)生影響，因此為進(jìn)一步研究多糖結(jié)構(gòu)提供了可靠的脫色方法。一般脫色機(jī)理認(rèn)為是物理吸附，當(dāng)有色成分直徑小于活性炭孔入口直徑，即可被吸附。當(dāng)然也存在一些缺點(diǎn)，例如對(duì)分子直徑較小的多糖也產(chǎn)生一點(diǎn)的吸附作用，這樣是否會(huì)改變多糖組成成分還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)，另外活性炭再生較為困難等。為了盡量保持脫色后多糖的生物活性，另外考慮脫色后活性炭的濾除難度，故沒有研究粉末活性炭的脫色部分，課題組在前期研究的基礎(chǔ)上[6-7]，繼續(xù)研究了顆粒活性炭的脫色工藝，經(jīng)試驗(yàn)研究，本工藝具有較好的操作性，工業(yè)化可實(shí)施性。

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3.付學(xué)鵬,楊曉杰.植物多糖脫色技術(shù)的研究.食品研究與開發(fā)[J],2007,28(11):166-169.

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（2015-02-05收稿）

Experimental studies on the decoloration of Paeoniae Radix Alba Polysaccharide using granular activated carbon

Qin Yadong1,Zhou Juanjuan2,Wang Rongbin1，31Department of Pharmacy,Anhui Higher Institute of Traditional Chinese Medicine,2Preparation Center，Wuhu Hospital of Traditional Chinese Medicine,3Anhui Institute of Chinese Medicine Resources,Wuhu 241317,Anhui Province,China

Objective：To optimize the decoloring conditions for Paeoniae Radix Alba Polysaccharide using Granular activated carbon.Methods：The decoloring effect of granular activated carbon was studied and the conditions for decoloring were optimized through single factor test.Results:The optimal conditions are∶temperature 25℃,1.5%granular activated carbon adjusted to pH=7.5,and maintained for 2 hours.The decolorization rate and polysaccharide retention rate of Paeoniae Radix Alba polysaccharide are 64.25%and 71.33% respectively.Conclusion：Granular activated carbon can be used for decolorization of polysaccharides of Radix Paeoniae Alba.

Paeoniae Radix Alba;Polysaccharide;Granular activated carbon;Decoloring experiment

R284

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.06.004

安徽省高校省級(jí)科研項(xiàng)目(KJ2013B114)；安徽省高職高專院校專業(yè)帶頭人（皖教秘人〔2011〕2號(hào)）

秦亞東(1979-)，男，講師，碩士。E-mail:qydgy2007@163.com