殷菱，任曉軍，唐莉，劉珉甬，程基焱

(1四川醫(yī)科大學醫(yī)學基礎研究中心，2四川醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，3四川醫(yī)科大學護理研究室，四川瀘州646000)

金創(chuàng)抗菌膏對糖尿病難愈性皮膚潰瘍的療效觀察及VIM表達的影響*

殷菱1，任曉軍1，唐莉2，劉珉甬3，程基焱1

(1四川醫(yī)科大學醫(yī)學基礎研究中心，2四川醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，3四川醫(yī)科大學護理研究室，四川瀘州646000)

目的：探討金創(chuàng)抗菌膏對糖尿病難愈性皮膚潰瘍的療效及其可能的分子機制。方法：48只健康雄性SD大鼠，適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為生理鹽水組、表皮生長因子組、金創(chuàng)抗菌膏治療組（分別16只）。糖尿病模型造模成功后，三組大鼠同時制作皮膚潰瘍模型，造模成功后，每天每組分別換藥，于第7、14 d，分別處死8只老鼠。觀察創(chuàng)面愈合情況及使用HE染色觀察壓瘡皮膚形態(tài)結構改變；免疫組織化學技術檢測波形蛋白（Vimentin，VIM）的表達。結果：①潰瘍愈合情況及HE染色顯示，金創(chuàng)抗菌膏組較生理鹽水組、表皮生長因子組潰瘍恢復快，膠原排列整齊，炎癥反應少；②免疫組化第7、14 d的結果顯示，與生理鹽水組、表皮生長因子組比較，金創(chuàng)抗菌膏組VIM表達最弱，差異具統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論：金創(chuàng)抗菌膏能促進大鼠糖尿病皮膚潰瘍的愈合，其作用優(yōu)于表皮生長因子，其機制可能是通過控制炎癥反應、調節(jié)波形蛋白的表達進而影響膠原蛋白的合成。

金創(chuàng)抗菌膏；糖尿??；難愈性潰瘍；波形蛋白

糖尿病潰瘍是糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）臨床常見并發(fā)癥之一，屬于難愈性潰瘍，迄今仍是需攻克的醫(yī)學難題。因此，探索有效治療DM難愈性皮膚潰瘍的方法具有極大的臨床意義。在前期的動物實驗及臨床試用中，我們發(fā)現(xiàn)金創(chuàng)抗菌膏對不同皮膚難愈性潰瘍的治療具有良好的效果[1-2]，并顯示出炎癥反應小，創(chuàng)口愈合快，疤痕組織少等優(yōu)良特性，但其作用機理尚不明確。金創(chuàng)抗菌膏是否對DM難愈性皮膚潰瘍同樣也有良好治療作用還不得而知，為觀察金創(chuàng)抗菌膏對DM難愈性皮膚潰瘍的療效，特設計了本實驗，同時對其發(fā)揮作用的可能機制做初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康雄性SD大鼠48只，二級、清潔，體重220～260 g（重慶騰鑫生物技術有限公司提供）。

1.1.2 主要試劑

鏈脲佐菌素：上海信然生物科技有限公司。

金創(chuàng)抗菌膏：瀘州天泰生物科技開發(fā)有限公司提供。

兔抗鼠VIM單克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒及DAB顯色試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 動物模型的建立

大鼠48只，隨機分為金創(chuàng)抗菌膏組（實驗組），表皮生長因子組（對照組），生理鹽水組（空白組），每組16只。

1.2.1 糖尿病大鼠模型

經普通飼料適應性喂養(yǎng)1周后，大鼠在空腹3 h狀態(tài)下，稱重。以枸櫞酸鈉緩沖液(濃度：0.1 mmol/ L，pH∶4.6)溶解鏈脲佐菌素(STZ)，配成1%溶液，按照35 mg/kg尾靜脈注射1%鏈脲佐菌素(STZ)，1周后剪尾取血，檢測血糖，隨機血糖超過11.1 mmol/L，繼續(xù)喂養(yǎng)4個月。3組實驗動物自由飲水進食。記錄各組大鼠進食量及水量進出情況，4個月后，稱其體重并剪尾采血檢測血糖，造模大鼠隨機血糖大于11.1 mmol/L則視為糖尿病大鼠模型成功。

1.2.2 皮膚潰瘍模型

三組大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，背部用8%硫化鈉脫毛。常規(guī)消毒，于大鼠背部脊柱附近腰背部兩側，標記出2.0 cm的圓形圖案，用手術剪沿著標記范圍剪去全層皮膚和皮下結締組織，避開較大血管，深至筋膜，造成缺損創(chuàng)面。止血后以無菌紗布包扎固定。3組動物均自由飲水與進食。每日用50%冰醋酸涂抹創(chuàng)面一次，1周后形成皮膚潰瘍大鼠模型。

從造模成功次日起，每天分組換藥，金創(chuàng)抗菌膏組用金創(chuàng)抗菌膏換藥，生理鹽水組用生理鹽水沖洗后包扎處理，表皮生長因子組使用表皮生長因子凝膠處理潰瘍創(chuàng)面。各組換藥后均在創(chuàng)面上加蓋一層薄膜，用醫(yī)用膠帶固定。在造模后第7、14 d各處死一半大鼠，取材，并進行相關實驗。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 療效觀察

用硫酸銅板紙每天繪制創(chuàng)面大小，計算創(chuàng)面面積及創(chuàng)面愈合率；用相機記錄創(chuàng)面變化(顏色、干濕度、肉芽組織生長狀態(tài)、有無瘢痕)；記錄創(chuàng)面愈合時間（創(chuàng)面完全上皮化作為愈合依據(jù)）。

1.3.2 形態(tài)學檢測

標本以4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片。①常規(guī)HE染色；②免疫組化染色：采用SABC法。切片脫蠟脫水→3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶10 min→0.02 mol/L檸檬酸微波修復5 min→滴加非免疫性動物血清封閉非特異性抗原10 min→滴加VIM一抗(1∶100稀釋)4℃孵育過夜→滴加二抗(1∶200稀釋)37℃孵育20 min→滴加標記過氧化酶的鏈霉親和素37℃孵育30 min→DAB(棕色)顯色，鏡下觀察、自來水終止顯色。顯微鏡下觀察、照相、分析。

1.4 結果觀察、圖像分析

根據(jù)盲法原則，采用日本OLYMPUS公司的BX-53顯微成像系統(tǒng)進行觀察分析及照相。每只大鼠取2張切片，每張切片自表皮向真皮深沉按系統(tǒng)抽樣法隨機抽取8個視野照相。利用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，測定VIM表達的平均光密度值（Average optical density；AOD）。

1.5 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 潰瘍愈合效果觀察。

7 d時可見，生理鹽水組潰瘍愈合一般情況最差，傷口邊緣可見明顯瘢痕組織生長，凸起，基底部顏色暗紅，幾乎看不到肉芽組織，滲出明顯。金創(chuàng)抗菌膏組潰瘍愈合一般情況較其它兩組好，傷口直徑均勻縮小，周邊無瘢痕生成，潰瘍基底面紅潤，有光澤，可見肉芽組織生長，滲出較少。而表皮生長因子組潰瘍愈合一般情況比生理鹽水組好但比金創(chuàng)抗菌膏組差，潰瘍基底部稍暗紅，傷口周邊可見少量肉芽組織及滲出。

14 d時，金創(chuàng)抗菌膏組，傷口幾乎愈合，無滲出，無紅腫，與正常皮膚無明顯差異。表皮生長因子組潰瘍愈合情況不及金創(chuàng)抗菌膏組，有少許瘢痕突起，與正常皮膚略有差異。生理鹽水組愈合情況最差，瘢痕組織明顯，突起于正常皮膚。7、14 d時測潰瘍面積，結果具統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。根據(jù)公式潰瘍愈合速率=（始建潰瘍面積-測定時潰瘍面積）/始建潰瘍面積×100%計算7、14 d時創(chuàng)面愈合百分比，結果顯示金創(chuàng)抗菌膏組愈合速率最快，表皮生長因子組次之，生理鹽水組最慢（圖1、表1）。

圖1 糖尿病大鼠皮膚潰瘍7、14 d時愈合效果觀察

表1 糖尿病大鼠皮膚潰瘍7、14 d時潰瘍面積（±s，n=8，cm2）

表1 糖尿病大鼠皮膚潰瘍7、14 d時潰瘍面積（±s，n=8，cm2）

注：與生理鹽水組比：a.P＜0.05,與表皮生長因子組比：b.P＜0.05

分組7 d14 d金創(chuàng)抗菌膏組1.2756±0.0708ab0.0423±0.0051ab表皮生長因子組1.5843±0.0776a0.1268±0.0066a生理鹽水組2.0895±0.12510.3675±0.0112

2.2 HE染色結果。

7 d時可見：生理鹽水組真皮層底部成纖維細胞較少，膠原纖維排列紊亂，有大量炎性細胞聚集；表皮生長因子組潰瘍底部真皮層成纖維細胞較多，呈梭形，膠原纖維較細，排列沒有金創(chuàng)抗菌膏組整齊，網狀結構不明顯，有較多炎性細胞聚集；金創(chuàng)抗菌膏組潰瘍底部真皮層成纖維細胞數(shù)量增多，呈長梭形，細胞體積增大，膠原纖維較細且排列整齊，呈松散疏松的網狀結構，真皮層炎性細胞較少。14 d時可見：金創(chuàng)抗菌膏組，成纖維細胞數(shù)量減少，膠原整齊，再生復層扁平上皮細胞排列整齊，炎性細胞較少；生理鹽水組，成纖維細胞大量聚集，膠原排列紊亂，再生上皮細胞不明顯，較多炎性細胞；表皮生長因子組的表現(xiàn)介于其余二組之間（圖2）。

圖2 潰瘍組織7、14 d時HE染色（×400）

2.3 免疫組織化學染色結果。

VIM在潰瘍組織中的表達強于周圍正常組織，由潰瘍表面真皮乳頭層至深層陽性表達逐漸減弱；同時在真皮層成纖維細胞胞質中表達，細胞外基質中基本無表達，陽性細胞胞質呈現(xiàn)棕黃色。7、14 d時，金創(chuàng)抗菌膏組表達最弱，空白組表達最強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；14 d時陽性率高于7 d時，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），（圖3、表2）。

圖3 潰瘍組織7、14 d時VIM免疫組化染色（×400）

表2 7、14 d時VIM表達的平均光密度值比較（±s，n=8）

表2 7、14 d時VIM表達的平均光密度值比較（±s，n=8）

注：與生理鹽水組比：a.P＜0.05；與表皮生長因子組比：b.P＜0.05，與7 d時比：c.P＜0.05

組別7 d14 d生理鹽水組0.325±00.00710.3412±0.0116c表皮生長因子組0.3132±0.0089a0.3243±0.0083ac金創(chuàng)抗菌膏組0.3020±0.0098ab0.3029±0.0100ab

3 討論

全球流行病學調查顯示，25%的糖尿病患者一生中伴隨著皮膚潰瘍，特別是在末梢血運不足的下肢[3]，5%～15%的皮膚潰瘍患者又面臨截肢問題；與非糖尿病患者相比，同樣的足部感染，糖尿病患者的治療時間大大延長。金創(chuàng)抗菌膏是一種純中藥制劑[2]，在清熱解毒消腫，活血化瘀止痛，去腐生肌斂瘡等方面具優(yōu)良特性。通過本實驗觀察，在治療糖尿病難愈性潰瘍時，不管是和以往報道對潰瘍有治療作用的表皮生長因子相比較[4-6]，還是和空白對照生理鹽水組相比較，金創(chuàng)抗菌膏在促進肉芽組織生長，加速創(chuàng)面愈合，控制炎癥反應等方面均表現(xiàn)出更優(yōu)良的特性，同時創(chuàng)面上皮重建更良好。

波形蛋白（Vimentin，VIM）是間質細胞的標志物，在皮膚創(chuàng)傷后ECM重構中具有非常重要的作用。VIM作為中間纖維的主要成分，與微絲、微管構成了成纖維細胞的網狀骨架系統(tǒng)，在維持成纖維細胞形態(tài)和功能方面具顯著作用。在正常皮膚組織中，VIM表達于表皮的基底層和真皮層中的成纖維細胞中，因此，VIM可用于成纖維細胞增殖數(shù)量和活躍程度的鑒定[7]。而在病理性增生的創(chuàng)傷性瘢痕中，VIM的表達量增加[8]，真皮層明顯增厚，膠原纖維排列呈團塊狀，膠原束紊亂，因此有人提出VIM與瘢痕增生相關。Gharbi等[9]發(fā)現(xiàn)，前列腺素A1(PGA1)作為創(chuàng)傷的重要炎性介質，可與波形蛋白以共價方式結合于第328個氨基酸殘基，并減輕炎癥反應，從而減少成纖維細胞的增殖和膠原分泌，達到減少瘢痕的目的。本次實驗中，與另外兩組相比，金創(chuàng)抗菌膏組在7、14 d時VIM表達最弱，膠原排列整齊，炎癥反應少，成纖維細胞增殖最少，潰瘍恢復的最快；同時與7 d時相比，在14 d時，生理鹽水組和表皮因子組VIM均不同程度升高，并具統(tǒng)計學意義，而金創(chuàng)抗菌膏組VIM表達略微升高，而無統(tǒng)計學意義。可推測金創(chuàng)抗菌膏具有抑制VIM表達，調控膠原纖維排列，控制炎癥反應，減少成纖維細胞的增殖和膠原分泌，抑制潰瘍愈合過程中瘢痕增生的作用，從而促進糖尿病皮膚潰瘍的愈合。

創(chuàng)面的愈合是一個多因素參與的綜合過程，受各種因素的調控，而金創(chuàng)抗菌膏的使用，為糖尿病難愈性皮膚潰瘍提供了一種有效的臨床治療方案，同時為我國傳統(tǒng)中藥的發(fā)展提供了更多的研發(fā)空間，只是其具體治療機制還需要進一步深入研究。

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（2015-09-18收稿）

Jinchuang antiseptic ointment promotes wound healing of recalcitrant diabetic ulcer through inhibition of vimentin in rat

Yin Ling1,Ren Xiaojun1,Tang Li2,Liu Minyong3,Cheng Jiyan11Research Center for Preclinical Medicine of Sichuan Medical University，2Experimental Center of Affiliated Hospital of Sichuan Medical University，3Nurse Research Center of Affiliated Hospital of Sichuan Medical University，Luzhou 646000,Sichuan province,China

Objective：To investigate the therapeutic effects of Jinchuang antiseptic ointment to diabetic pressure ulcers and to explore its potential molecular mechanism.Methods：Fourty-eight male model rats of diabetic ulcer were randomly divided into 3 groups(16 per group)∶epidermal growth factor group,physiological saline group,and Jinchuang antiseptic ointment treatment group respectively.The changes of morphological structure were examined by HE staining,and the expression of vimentin were determined by immunohistochemical staining.Results:①Compared with the physiological saline and the epidermal growth factor groups,Jinchuang antiseptic ointment significantly increased the rate of wound healing of ulcers（P＜0.05).②The expression of vimentin was inhibited remarkably in Jinchuang antiseptic ointment group compared to the other two groups（P＜0.05）.Conclusion：Jinchuang antiseptic ointment promotes wound healing of recalcitrant diabetic ulcer in rat model.

Jinchuang of antiseptic ointment;Diabetic ulcer;Vimentin

R242

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.06.003

四川省衛(wèi)生廳科研項目（編號：130267），瀘州市科技局科研項目（瀘市科【2012】177號）

殷菱（1979-），女，講師，碩士。

程基焱（1971-），男，教授，碩士。E-mail:49046804@qq.com