李娟，王瓊，郭侃，甘淋

（四川醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心，四川瀘州646000）

DS1226對人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30細(xì)胞增殖、凋亡和運(yùn)動的影響*

李娟，王瓊，郭侃，甘淋

（四川醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心，四川瀘州646000）

目的：檢測人參復(fù)合物制劑DS1226對人乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞ZR-75-30細(xì)胞增殖、凋亡和運(yùn)動的影響。方法：體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30，予DS1226干預(yù)組為DS1226組（實(shí)驗(yàn)組），無藥物組為對照組。CCK8檢測DS1226對ZR-75-30細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的改變，進(jìn)一步用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測劃痕愈合率。結(jié)果：與對照組相比較，CCK8結(jié)果顯示DS1226時(shí)間依賴性抑制人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的細(xì)胞增殖，24 h、48 h和72 h的細(xì)胞增殖抑制率分別是3.01±0.12%，13.10±0.51%和23.66±4.85%（P＜0.01）；FACS結(jié)果顯示DS1226干預(yù)組的凋亡率從干擾前3.20±0.14%增強(qiáng)至藥物刺激后的7.17±0.32%（P＜0.05）；劃痕實(shí)驗(yàn)顯示DS1226干預(yù)組24 h與對照組相比劃痕愈合明顯下降（P＜0.01）。結(jié)論：人參復(fù)合物制劑DS1226能顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞凋亡和降低細(xì)胞運(yùn)動能力。

DS1226;乳腺癌；增殖；凋亡；運(yùn)動

乳腺癌（Breast Cancer）是女性最常見的惡性腫瘤，其致死率居女性腫瘤死亡率第二位。近年來其發(fā)病率與死亡率不斷升高，2008年全球確診腫瘤中23%為乳腺癌，腫瘤死亡病例中約14%為乳腺癌[1]。但是乳腺癌的發(fā)病機(jī)制不明，目前仍缺乏高效敏感的早期診斷分子標(biāo)志物和治療方法，且特效的乳腺癌治療藥品也有待進(jìn)一步的研究。

人參是一種得到臨床認(rèn)可的，在國內(nèi)外都得到廣泛應(yīng)用的一種中藥，目前越來越多的應(yīng)用于造血系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和化療輔助治療等方面，但是在腫瘤治療方面的研究尚有待進(jìn)一步深入[2-3]。本研究所采用的藥物DS-1226是由人參干燥莖葉抽提的總皂苷水解而成，包括原人參二醇（aPPD）、原人參三醇（aPPT）、人參皂苷Rh2和PAM120等多種成分[4]。

本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平出發(fā)，采用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、劃痕實(shí)驗(yàn)等常用分子生物學(xué)方法研究人參制劑DS-1226對人乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、運(yùn)動能力的影響，進(jìn)而解析人參皂甙DS-1226成為乳腺癌治療藥物的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系ZR-75-30由四川醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中心保存；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清均購自美國Gibco BRL公司；Cell Counting Kit-8試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；膜連蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素凋亡試劑盒購自美國BD公司。其余試劑均為化學(xué)分析純。酶標(biāo)儀為美國Thermo公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞檢測儀為美國的BD公司；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Image Pro軟件分析。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物干預(yù)：

人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30貼壁生長于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)；以加入終濃度為5 μg/mL DS1226的細(xì)胞為DS1226組，以不加入DS1226的細(xì)胞為對照組。DS1226均是實(shí)驗(yàn)前即時(shí)配制。

1.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將3.0×103個(gè)ZR-75-30細(xì)胞/孔傳代于無菌96孔培養(yǎng)板中。須單獨(dú)設(shè)置空白孔（僅有培養(yǎng)基）、對照孔和實(shí)驗(yàn)孔（皆鋪有細(xì)胞的培養(yǎng)基）。每組設(shè)四個(gè)平行孔。次日用DS1226作用實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，同等體積PBS作用細(xì)胞組為對照組，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入Cell Counting Kit-8溶液10 μL；37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)溫育1 h。用酶標(biāo)儀讀取各孔在450 nm的吸光度，以各時(shí)間點(diǎn)的吸光度繪制生長曲線。

1.2.3 細(xì)胞凋亡（AnnexinV+PI）的流式細(xì)胞儀檢測

ZR-75-30細(xì)胞按每孔4.5×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板中，設(shè)對照組和DS1226實(shí)驗(yàn)組（DS1226作用24 h），次日收集每孔中的細(xì)胞和培養(yǎng)液后PBS漂洗2次。依次加入AnnexinV凋亡染色試劑盒中的結(jié)合緩沖液20 μL、AnnexinV和PI工作液各5 μL，室溫避光染色15 min后上機(jī)檢測。

1.2.4 細(xì)胞周期的檢測

ZR-75-30細(xì)胞按每孔4.5×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板中，設(shè)對照組和DS1226實(shí)驗(yàn)組（DS1226作用24 h）。收集細(xì)胞用預(yù)冷的70%酒精固定30 min。用PBS洗滌1次后加入RNase A(工作濃度20 μg/ mL，37℃孵育30 min。PBS洗滌后加入PI(工作濃度50 μg/mL)，避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn)

ZR-75-30細(xì)胞按每孔4.5×105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于6孔培養(yǎng)板中，形成單層貼壁細(xì)胞，設(shè)對照組和DS1226實(shí)驗(yàn)組（DS1226作用24 h）。當(dāng)細(xì)胞鋪滿孔板，用10 μL移液器槍頭在單層細(xì)胞上劃痕，孵育24 h后去除培養(yǎng)基，PBS洗滌2次后光學(xué)顯微鏡下拍照觀察。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DS1226對ZR-75-30細(xì)胞增殖的影響

Cell Counting Kit-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5.0 μg/mL DS-1226作用ZR-75-30人乳腺癌細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，DS1226組的細(xì)胞增值較對照組均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），（圖1）。DS1226組的細(xì)胞生長抑制率在作用24 h、48 h和72 h分別為3.01%±0.12%，13.10%±0.51%和23.66%±4.85%，DS1226組的細(xì)胞生長抑制率隨著時(shí)間推移逐漸增加（P＜0.01，圖1）。

圖1 DS1226對人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30細(xì)胞增殖的作用

2.2 DS1226誘導(dǎo)ZR-75-30細(xì)胞凋亡

聯(lián)合Annexin V和PI的方法檢測DS1226對乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的細(xì)胞凋亡變化。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果如圖2所示，與對照組比較，DS1226實(shí)驗(yàn)組的凋亡明顯增加，細(xì)胞凋亡從藥物干擾前的3.20%±0.14%上調(diào)至干擾后的7.17%±0.32%（P＜0.05）。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

2.3 DS1226不影響ZR-75-30細(xì)胞的細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測DS1226作用ZR-75-30后細(xì)胞周期的變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)DS1226處理之后，人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30細(xì)胞周期（G1期47.71%± 1.65%，S期32.81%±1.02%）與對照組（G1期45.71%±2.17%，S期34.65%±1.49%）沒有明顯改變（P=0.078）。

2.4DS1226抑制ZR-75-30細(xì)胞運(yùn)動

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，5.0 μg/mL DS1226作用人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30 24 h后，DS1226組的細(xì)胞運(yùn)動能力較對照組下降，細(xì)胞劃痕愈合能力下降（圖3）。

圖3 對照組與DS1226組劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x 200）

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)乳腺癌高發(fā)于經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)國家，比如美國、歐洲、日本等，如2011年美國乳腺癌新增病例為230,480例，死亡人數(shù)則高達(dá)39,520人[1]。近年來的研究提示：乳腺癌在發(fā)展中國家的發(fā)病率、死亡率正在逐漸增高，在中國的一些大城市乳腺癌已經(jīng)逐漸成為威脅婦女生命的重要?dú)⑹諿5]。故而能早期診斷、治療乳腺癌非常重要。中藥抗腫瘤可以通過多種機(jī)制參與腫瘤生長、增殖、凋亡、代謝等過程,減少患者的腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，延長患者生存期。目前在傳統(tǒng)中藥材中尋找高效、低毒的抗癌藥物已成為國內(nèi)外研究焦點(diǎn)。

人參作為一味傳統(tǒng)的中藥材，廣泛應(yīng)用于心血管、造血系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)疾病和放化療輔助治療。至今從人參中已分離鑒定40多種人參皂甙化合物，如Rb1、Rg1、Rg3、Rd等，發(fā)揮抗炎癥、抗氧化、血管舒張、抗老化、抗腫瘤等多種作用[6-8]。最近五年已有超過1100篇的論文，但是關(guān)于人參制劑對腫瘤的預(yù)防治療作用的研究甚少。然而單方的人參皂苷晶體提純過程復(fù)雜，作用單一，價(jià)格昂貴，不適合大規(guī)模臨床使用。故而本實(shí)驗(yàn)選擇了人參復(fù)合物制劑DS1226膠囊進(jìn)行試驗(yàn)。

我們以高侵襲的的ZR-75-30人乳腺癌細(xì)胞為研究對象，檢測DS1226對乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞增殖、凋亡、遷徙運(yùn)動的影響，探討DS1226作為乳腺癌治療藥物的可能性。我們的研究發(fā)現(xiàn)5 μg/mL人參復(fù)合物制劑DS1226作用ZR-75-30細(xì)胞24 h后，能抑制ZR-75-30細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示DS1226可能發(fā)揮抗乳腺癌發(fā)生的作用。這和其他一些研究小組的結(jié)果是相似的。Sharma等[9]發(fā)現(xiàn)人參根莖提取物治療皮膚癌時(shí)，可以通過降低谷胱甘肽、維生素C、超氧化歧化酶等明顯降低腫瘤的發(fā)生率，腫瘤的數(shù)目和大小。He研究小組在人肺癌、鼻咽癌及結(jié)腸癌等多個(gè)細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，人參提取物能劑量依賴性的抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)揮抗腫瘤的作用[10]。Kim也發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDAMB-435細(xì)胞中，人參單方制劑Rg3、Rg5都能通過多種信號通路調(diào)控細(xì)胞凋亡，其中Rg5促進(jìn)凋亡的能力更強(qiáng)[11]。這些結(jié)果證實(shí)人參制劑確實(shí)能發(fā)揮抗腫瘤生成的作用，為人參制劑的臨床應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。

在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DS1226抑制ZR-75-30乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞運(yùn)動，提示DS1226對乳腺癌的進(jìn)展有一定的抑制作用。Wang等[12]從人參里面提取的多糖，并進(jìn)一步在大鼠Lewis肺癌的動物模型上檢測其抗腫瘤的作用。發(fā)現(xiàn)這種多糖物質(zhì)能顯著抑制肺癌的生長，并能抑制肺轉(zhuǎn)移瘤的產(chǎn)生；同時(shí)還能增加脾臟和胸腺的重量，促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖，提高脾臟NK細(xì)胞的活性，增加白介素2和干擾素的表達(dá)，提示抽提的人參多糖物質(zhì)能激活免疫功能有效抑制肺癌的轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)一種脂溶性的人參抽提物（LSGE）能通過抑制MMP2的表達(dá)有效抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16F10的運(yùn)動和侵襲，甚至能抑制體內(nèi)的黑色素瘤細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移[13]。這些結(jié)果提示人參可能在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮治療效果。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)人參復(fù)合物制劑DS1226能顯著抑制人乳腺癌細(xì)胞ZR-75-30的細(xì)胞增殖、增強(qiáng)細(xì)胞凋亡和降低細(xì)胞運(yùn)動能力。這為進(jìn)一步探討人參的臨床推廣應(yīng)用奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和提供了臨床指導(dǎo)。

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（2015-08-31收稿）

作者投稿系統(tǒng)http∶//xb.lzmc.edu.cn/

Effects of DS1226 on proliferation,Apoptosis and migration of human breast cancer cell line ZR-75-30

Objective：To study the effect of Ginseng compound DS1226 on proliferation,apoptosis,and migration of human breast cancer cell line ZR-75-30.Methods：Cultured ZR-75-30 cells were treated with DS1226 as trial group and without DS1226 as control group.Cell proliferation was determined by CCK8 assay, cell apoptosis and cell cycle were analyzed by FACS,and cell migration was evaluated by scratch assay.Results: Compared to control group,DS1226 significantly decreased the proliferation of ZR-75-30 cells in a timedependent manner(P＜0.01),induced cell apoptosis(P＜0.05),and reduced the rate of wound closure(P＜0.01). Conclusion:DS1226 inhibits cell proliferation and migration,and enhances cell apoptosis in human breast cancer cell line,ZR-75-30.

DS1226;Breast cancer;Proliferation;Apoptosis;Migration

R737.9

A

10.3969/j.issn.1000-2669.2015.06.002

*國家自然基金項(xiàng)目（No:81341121）；四川省科技廳—瀘州市—瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合課題（14JC155）；瀘州市科技局課題（2012-S-36（3/14）

李娟(1978-)，女，副教授，碩士。

甘淋(1978-)，女，副教授，博士。E-mail：gl-gump@163.com

Li Juan,Wang Qiong,Guo Kan,Gan Lin

The Research Center for Preclinical Medicine,Sichuan Medical University，Luzhou 646000,Sichuan Province,China