施镠佳，譚映軍，董景新，葉雄英，王春艷，李瑩輝

(1. 清華大學(xué)精密儀器系，北京 100084；2. 中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心，北京 100094)

影響MG-63細(xì)胞黏附和蛋白質(zhì)吸附的PDMS表面處理

施镠佳1,2，譚映軍2，董景新1，葉雄英1，王春艷2，李瑩輝2

(1. 清華大學(xué)精密儀器系，北京 100084；2. 中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心，北京 100094)

為了將聚二甲基硅氧烷(PDMS)用作空間微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片的結(jié)構(gòu)材料，需要克服其自身不利于細(xì)胞黏附以及容易吸附蛋白質(zhì)的缺陷，故必須通過(guò)簡(jiǎn)單可靠的表面處理方法改變PDMS的表面特性．為此，以航天醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究中常用人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的黏附和細(xì)胞培養(yǎng)液中常見(jiàn)蛋白質(zhì)牛血清白蛋白(BSA)的吸附為衡量指標(biāo)，比較了4種PDMS表面處理方法的效果，并初步研究了PDMS表面浸潤(rùn)性及形貌與MG-63黏附/BSA吸附之間的關(guān)系．4種方法分別為在PDMS表面自聚合聚多巴胺(PDA-PDMS)、涂覆聚賴氨酸(PLL-PDMS)、包被膠原蛋白Ⅰ型(COL-PDMS)和氧等離子體處理(ox-PDMS)．用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞黏附和鋪展，并用CellTiter 96?AQueous單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(MTS)檢測(cè)培養(yǎng)1～4,d的MG-63活細(xì)胞活性；檢測(cè)了吸附異硫氰酸熒光素標(biāo)記牛血清白蛋白(FTIC-BSA)后的PDMS表面熒光強(qiáng)度；測(cè)量了處理前后PDMS表面接觸角及表面形貌．結(jié)果表明：PDAPDMS和ox-PDMS變得親水且較粗糙，而PLL-PDMS、COL-PDMS和未處理PDMS疏水且較平滑；MG-63經(jīng)4種方法處理后，PDMS表面均能較好地黏附和聚二甲基硅氧烷鋪展，但在親水表面黏附更持久；BSA在親水表面的吸附明顯少于憎水表面．

聚二甲基硅氧烷；MG-63；牛血清白蛋白；表面處理；細(xì)胞黏附；蛋白質(zhì)吸附

相關(guān)研究表明，骨骼細(xì)胞在失重性骨質(zhì)丟失中發(fā)揮著重要作用，所以探索空間骨質(zhì)丟失機(jī)制必須研究骨骼細(xì)胞在空間特殊環(huán)境中的變化和響應(yīng)．目前用于空間在軌實(shí)驗(yàn)研究的骨骼細(xì)胞[1]中，人骨肉瘤細(xì)胞MG-63是一種具有成骨樣細(xì)胞大部分特征的永生化成骨樣細(xì)胞系，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究．

隨著航天醫(yī)學(xué)細(xì)胞學(xué)研究的發(fā)展和微流控技術(shù)的進(jìn)步，微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片逐漸成為空間細(xì)胞學(xué)研究的新平臺(tái)．聚二甲基硅氧烷(poly(dimethylsiloxane)，PDMS)因?yàn)榫哂辛己玫囊准庸ば?、生物兼容性、透光性、透氣性、熱穩(wěn)定性和無(wú)毒等特性，不但用于加工常規(guī)的微流控芯片，也逐漸用作空間細(xì)胞培養(yǎng)芯片的結(jié)構(gòu)材料；但是PDMS表面能低，表現(xiàn)出明顯的疏水特性，因而不太利于細(xì)胞的黏附和增殖[2]，且極易非特異性吸附蛋白質(zhì)，故將未經(jīng)處理的PDMS用于細(xì)胞培養(yǎng)仍有一定的局限性.

近年來(lái)許多研究結(jié)果表明，對(duì)PDMS進(jìn)行表面處理可以促進(jìn)細(xì)胞在PDMS表面的黏附和增殖，例如，用多聚左旋賴氨酸處理PDMS后培養(yǎng)纖維原細(xì)胞32,h的黏附量比未處理PDMS表面黏附量高出32%[3]；分別在氧等離子體處理、多聚右旋賴氨酸修飾的PDMS表面培養(yǎng)人類腸上皮細(xì)胞1～3,d后的黏附量依次分別比未處理PDMS表面高出93.75%、48.97%、95.56%和155%、138.46%、84.6%[4]．同時(shí)也有不少表面改性方法致力于實(shí)現(xiàn)PDMS表面的防非特異性蛋白質(zhì)吸附，例如Pluronic 68表面活性劑修飾PDMS表面對(duì)DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)吸附量比未處理PDMS表面降低82%[5]；多聚賴氨酸枝接聚乙二醇(PLLPEG)修飾PDMS表面對(duì)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的吸附量比未處理PDMS表面降低45%[6]等．同時(shí)，目前的研究多認(rèn)為能獲得防蛋白質(zhì)非特異性吸附的PDMS表面處理方法通常也會(huì)降低細(xì)胞的黏附和增殖[5]．

為了將PDMS用于空間微流控細(xì)胞培養(yǎng)芯片，必須克服其不利于細(xì)胞黏附以及容易吸附蛋白質(zhì)的缺陷，故需要通過(guò)簡(jiǎn)單可靠的表面處理方法改變PDMS的表面特性．盡管已有不少相關(guān)研究，但相同的PDMS表面處理方法對(duì)于不同細(xì)胞種類的作用并不完全相同[4]，而目前鮮有針對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG-63的相關(guān)研究．本文以MG-63細(xì)胞株為研究對(duì)象，采用4種方法[2-4]進(jìn)行PDMS表面改性處理，比較其對(duì)MG-63細(xì)胞黏附、鋪展和增殖的影響效果．4種表面處理方法分別為：在PDMS表面通過(guò)自聚合反應(yīng)生成聚多巴胺(PDA-PDMS)、物理吸附帶正電荷的聚賴氨酸(PLL-PDMS)、包被細(xì)胞外基質(zhì)蛋白膠原蛋白Ⅰ型(COL-PDMS)以及氧等離子體處理(ox-PDMS).同時(shí)，對(duì)處理后PDMS表面對(duì)培養(yǎng)液中常見(jiàn)蛋白質(zhì)BSA的吸附情況進(jìn)行比較，分析了PDMS表面蛋白質(zhì)吸附與表面特性之間的關(guān)系．

1 材料及方法

1.1 PDMS基底制備

PDMS(Sylgard 184，Dow Corning，USA)本體和固化劑按質(zhì)量比10∶1混合均勻并脫氣．制備細(xì)胞黏附研究用PDMS基底時(shí)，在48孔板(Corning 3548，USA)的每個(gè)孔中分別滴加約0.125,mL的PDMS預(yù)固物；制備蛋白質(zhì)吸附研究用PDMS基底時(shí)，將PDMS預(yù)固物傾倒于潔凈的載玻片上并用勻膠機(jī)旋涂得到厚度約1,mm的PDMS膜；65,℃加熱2,h令所有PDMS預(yù)固物徹底固化；取出孔板中部分PDMS片，揭下玻片上的PDMS膜并用手術(shù)刀切割成約26 mm×3,mm(長(zhǎng)×寬)的窄條．將帶有PDMS基底的孔板和切割好的PDMS窄條均置于70%(質(zhì)量/體積)的酒精中浸泡24,h滅菌，之后用無(wú)菌蒸餾水清洗3次，置于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)徹底風(fēng)干．

1.2 PDMS表面處理

用于細(xì)胞黏附研究的聚多巴胺、多聚賴氨酸和膠原蛋白Ⅰ型修飾PDMS表面處理方法為：室溫下分別將多巴胺鹽酸鹽(3-hydroxytyramine hydrochloride，sigma-aldrich)溶于10,mol/L、pH＝8.5的tris溶液，多聚賴氨酸(MW 70～150,K，poly-L-lysine，sigma-aldrich)溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)，鼠尾膠原蛋白Ⅰ型(5,mg/mL，rat tail tendon collagen type Ⅰ，China)溶于0.02,mol/L乙酸溶液，得到濃度依次為2.00,mg/mL、0.10,mg/mL、0.05,mg/mL的多巴胺溶液、多聚賴氨酸溶液和膠原蛋白溶液；3種溶液分別用0.22,μm濾器過(guò)濾除菌；將3種無(wú)菌溶液按照0.6,mL/孔的量分別滴加到前述滅菌后的帶有PDMS基底的48孔板中；3種溶液分別浸泡24,h、12,h、8～12,h后，吸走孔板中的溶液并用無(wú)菌水徹底沖洗未吸附于PDMS表面的溶液；置于無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)風(fēng)干．用于細(xì)胞黏附研究的氧等離子體處理PDMS表面的方法如下：將第1.1節(jié)所述從48孔板中取出的PDMS片清洗、吹干后，用濺射-刻蝕機(jī)(JR-2B型，北京金盛微納科技有限公司)按射頻功率100,W、改性時(shí)間5,min、氧氣流量200,mL/min[7]進(jìn)行氧等離子體處理；70%(質(zhì)量/體積)酒精浸泡24,h后用無(wú)菌水清洗3次；風(fēng)干后將每一片經(jīng)過(guò)氧等離子體處理的PDMS片置于無(wú)菌48孔板的每個(gè)孔中，必須保證PDMS片的平整一側(cè)與孔板底面緊密貼合．未處理PDMS表面及48孔板作為對(duì)照．

用于蛋白質(zhì)吸附研究的PDMS表面處理方法為：滅菌后的PDMS窄條分別豎直浸入前述無(wú)菌多巴胺溶液、多聚賴氨酸溶液和膠原蛋白溶液中，分別依次浸泡24,h、12,h、8～12,h后取出，徹底沖洗，風(fēng)干．氧等離子體處理時(shí)，按前述氧等離子體處理方法依次處理完P(guān)DMS窄條的兩面后，再進(jìn)行滅菌、沖洗、風(fēng)干．未經(jīng)處理的PDMS窄條作為對(duì)照．

1.3 細(xì)胞黏附

人骨肉瘤細(xì)胞MG-63接種于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的MEM(minimum essential medium)培養(yǎng)基中；于37,℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、水盤(pán)補(bǔ)濕的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞層鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部；用0.25%(體積分?jǐn)?shù))胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞直至其完全脫落，將細(xì)胞懸液在900,r/min下離心5,min；稀釋細(xì)胞懸液至細(xì)胞密度約為4×104,,個(gè)/mL；向帶有未/已處理PDMS基底的48孔板及空48孔板的每個(gè)孔內(nèi)加入500,μL細(xì)胞懸液，細(xì)胞數(shù)量約2×104,,,個(gè)/孔．

加載了細(xì)胞懸液的孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁并生長(zhǎng)；每隔24,h用倒置熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE-Ti)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；用CellTiter 96?AQueous 單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(MTS)檢測(cè)培養(yǎng)1,d、2,d、3,d和4,d后的活細(xì)胞活性并以此表征活細(xì)胞數(shù)量；每種處理表面的樣本量為5孔/天．為了觀察各表面支持細(xì)胞長(zhǎng)期黏附和增殖的能力，每隔24,h進(jìn)行1次顯微鏡觀察，持續(xù)3周．

1.4 蛋白質(zhì)吸附

蛋白質(zhì)吸附研究以異硫氰酸熒光素標(biāo)記的牛血清白蛋白(FTIC-BSA)為表征蛋白質(zhì)．由于氧等離子體處理后的PDMS表面暴露于空氣中親水性會(huì)下降，為了研究蛋白質(zhì)非特異性吸附與PDMS表面親水性之間的關(guān)系，本研究中氧等離子體處理PDMS表面包括2種方式：2種表面都經(jīng)氧等離子體處理后馬上浸入去離子水中保存，但一種是從水中取出、吹干后馬上浸入FTIC-BSA溶液，另一種是從水中取出、吹干并暴露于空氣中1,h后再浸入FTIC-BSA溶液. 將已/未處理的6種PDMS條分別浸入0.25,mg/mL的FTIC-BSA(溶于PBS)溶液，37,℃下避光孵育1,h后取出，用PBS溶液徹底沖洗未吸附到PDMS條上的熒光蛋白質(zhì)．每種處理表面的樣本量為5片．

用倒置熒光顯微鏡(Nikon ECLIPSE-Ti)拍攝前述6種PDMS表面吸附FTIC-BSA后的熒光照片，并用Image J 軟件分析其熒光強(qiáng)度．

1.5 PDMS表面特性評(píng)價(jià)

為了進(jìn)一步分析各種修飾后PDMS表面影響細(xì)胞黏附和蛋白質(zhì)吸附的原因，觀測(cè)了各種PDMS表面的潤(rùn)濕性和表面形貌．其中，表面潤(rùn)濕性用各表面的接觸角來(lái)衡量，在每種表面上隨機(jī)選取5個(gè)位置點(diǎn)，分別滴加2,μL去離子水，靜置30,s后用CCD拍照、測(cè)量接觸角并取平均值．表面形貌用原子力顯微鏡(AFM，島津spm9,600，phase模式)觀察并測(cè)量粗糙度．

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)活細(xì)胞黏附數(shù)量和蛋白質(zhì)吸附熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最終結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式表示．

2 結(jié)果和討論

2.1 細(xì)胞黏附情況

培養(yǎng)24,h后MG-63細(xì)胞在聚多巴胺(PDAPDMS)、多聚賴氨酸(PLL-PDMS)和膠原蛋白Ⅰ型(COL-PDMS)修飾PDMS表面，氧等離子體處理PDMS表面(ox-PDMS)，48孔板和未處理PDMS表面上的鋪展情況如圖1所示．細(xì)胞在未經(jīng)處理的PDMS表面上大多數(shù)仍然呈球狀，而在4種處理后PDMS表面上均能較好地黏附和鋪展，鋪展形態(tài)比較接近孔板上的觀察結(jié)果．

參照未處理PDMS表面上培養(yǎng)1,d的活細(xì)胞數(shù)量，將所有6種表面上培養(yǎng)1,d、2,d、3,d和4,d后的活細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行歸一化處理，結(jié)果如圖2和表1所示．可見(jiàn)，細(xì)胞在未處理PDMS表面上增長(zhǎng)十分緩慢，而PDA-PDMS上每一天的活細(xì)胞數(shù)量均超過(guò)了孔板，PLL-PDMS、COL-PDMS和ox-PDMS上的活細(xì)胞黏附數(shù)量也都遠(yuǎn)大于同期未處理PDMS表面上的活細(xì)胞數(shù)量，PLL-PDMS和ox-PDMS上第2、3天的活細(xì)胞數(shù)量甚至已經(jīng)比較接近孔板；未處理PDMS表面活細(xì)胞數(shù)量與其余5種表面活細(xì)胞數(shù)量之間均有顯著性差異，p＜0.01．

圖1 培養(yǎng)24,h后的MG-63細(xì)胞鋪展顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 Microscopic photographs of MG-63 spreading after 24,h of cell culture

圖3 MG-63長(zhǎng)期黏附情況的顯微鏡照片F(xiàn)ig.3Microscopic photographs of MG-63 attachment for a long time

圖2 細(xì)胞黏附和增殖Fig.2 Cell adhesion and proliferation

表1 細(xì)胞黏附增加量Tab.1 Increase of cell adhesion

對(duì)于細(xì)胞在6種表面上的長(zhǎng)期黏附和增殖情況，持續(xù)3周的顯微鏡觀察結(jié)果表明，COL-PDMS和 PLL-PDMS表面的細(xì)胞層分別從第5天和第6天開(kāi)始逐漸出現(xiàn)邊緣脫落跡象(見(jiàn)圖3(a)和3(b))、第9天～第13天和第11天～第14天脫落擴(kuò)展到內(nèi)部區(qū)域(見(jiàn)圖3(c)和3(d))、第18天～第22天和第19天～第22天逐漸完全脫落(見(jiàn)圖3(e)和3(f))；而PDA-PDMS和ox-PDMS表面的細(xì)胞一直均勻且密集(見(jiàn)圖3(g)和3(h))，類似于孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)情況(見(jiàn)圖3(i))，未處理PDMS表面的細(xì)胞始終不均勻且增長(zhǎng)緩慢(見(jiàn)圖3(j))．可見(jiàn)，PDA-PDMS、ox-PDMS表面和孔板上的細(xì)胞黏附長(zhǎng)期性明顯優(yōu)于COL-PDMS和PLL-PDMS表面，而細(xì)胞在未處理PDMS表面上的黏附性始終較差．

2.2 蛋白質(zhì)吸附情況

聚多巴胺/多聚賴氨酸/膠原蛋白I型修飾、氧等離子體處理后10,min內(nèi)、1,h后以及未經(jīng)處理等6種PDMS表面吸附了FTIC-BSA后的典型熒光照片如圖4所示．分別將5種處理后PDMS表面的BSA熒光強(qiáng)度參照未處理PDMS表面的BSA熒光強(qiáng)度進(jìn)行歸一化處理，結(jié)果見(jiàn)圖5(各種表面的熒光強(qiáng)度之間，除了PLL-PDMS和COL-PDMS分別與未處理PDMS沒(méi)有顯著性差異外，所有表面的熒光強(qiáng)度之間均有顯著性差異，且p＜0.01)和表2．可見(jiàn)，PDAPDMS、ox-PDMS(10,min內(nèi))和ox-PDMS(1,h后)表面的BSA吸附量明顯少于未處理PDMS表面的BSA吸附量；COL-PDMS和PLL-PDMS表面與未處理PDMS表面的BSA吸附量差別不大．

圖4 吸附FITC-BSA熒光照片F(xiàn)ig.4 Pictures of PDMS substrates adsorbed by FITC-BSA

圖5 接觸角及BSA黏附情況Fig.5 Contact angle and BSA absorption

表2 不同PDMS表面BSA相對(duì)熒光強(qiáng)度及接觸角Tab.2 Relative intensity and contact angle of FITC-BSA ondifferent PDMS surfaces

2.3 接觸角測(cè)量

聚多巴胺/多聚賴氨酸/膠原蛋白I型修飾、氧等離子體處理后10,min內(nèi)、1,h后以及未經(jīng)處理的PDMS表面接觸角測(cè)量結(jié)果仍見(jiàn)圖5和表2．可見(jiàn)，PDA-PDMS和氧等離子體處理后的PDMS表面變得親水，而多聚賴氨酸和膠原蛋白I型的修飾幾乎不改變PDMS表面的潤(rùn)濕性．氧等離子體處理PDMS的親水性在空氣中暴露1,h后明顯下降．

2.4 表面形貌

PDA-PDMS、PLL-PDMS、COL-PDMS、ox-PDMS和未處理PDMS表面形貌的原子力顯微鏡(AFM)照片如圖6所示，PDA-PDMS和ox-PDMS表面分別呈現(xiàn)出大小不同的溝回狀形貌，兩種表面上的溝回高、寬和間距分別為56,nm、400,nm、120,nm以及34,nm、210,nm、98,nm，PDA-PDMS表面上還有少量大小不均的團(tuán)聚凸起；而PLL-PDMS、COL-PDMS及未處理PDMS表面均比較平整，但COL-PDMS表面少量區(qū)域呈現(xiàn)出表面涂層不均勻的情況．進(jìn)一步測(cè)量PDA-PDMS、PLL-PDMS、COL-PDMS、ox-PDMS和未處理PDMS的表面粗糙度Ra，依次分別為15.229,nm、0.584,nm、1.228,nm、17.117,nm和0.662,nm．

2.5 表面特性與細(xì)胞黏附和蛋白質(zhì)吸附的關(guān)系

對(duì)比各PDMS表面接觸角與相應(yīng)表面上的BSA熒光強(qiáng)度的大小順序，可見(jiàn)越親水的PDMS表面對(duì)BSA蛋白的吸附量越少；特別地，隨著ox-PDMS表面在空氣中暴露1,h后潤(rùn)濕性降低，ox-PDMS(1,h后)表面的BSA吸附量增加．已有研究[6]表明，PDMS表面對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附隨著表面潤(rùn)濕性的增加而減少，與本文的研究結(jié)果一致．再對(duì)比各PDMS表面潤(rùn)濕性與相應(yīng)表面的活細(xì)胞黏附量發(fā)現(xiàn)，修飾后親水的PDA-PDMS和ox-PDMS表面上細(xì)胞黏附和增殖都優(yōu)于疏水的未處理PDMS表面；但修飾后依然疏水的PLL-PDMS和COL-PDMS表面也能較好地促進(jìn)細(xì)胞的黏附和增殖．對(duì)于PLL-PDMS表面，因?yàn)樗胁溉閯?dòng)物的細(xì)胞表面均帶有負(fù)電荷，而吸附于PDMS表面的聚賴氨酸帶有大量陽(yáng)離子，故細(xì)胞會(huì)因其表面與PDMS表面聚賴氨酸之間的靜電作用而貼附于PLL-PDMS表面[3]；對(duì)于膠原蛋白I型修飾的PDMS表面，因?yàn)槟z原蛋白是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的纖維蛋白之一，兼有結(jié)構(gòu)蛋白和黏著蛋白的功能，可以與細(xì)胞表面的受體連接，故吸附了膠原蛋白I型的PDMS表面變得有利于細(xì)胞的黏附和增殖[8].然而，從各表面對(duì)細(xì)胞黏附的長(zhǎng)期支持能力來(lái)看，生長(zhǎng)在疏水的PLL-PDMS和COL-PDMS表面的細(xì)胞較早地開(kāi)始出現(xiàn)脫落跡象，最終甚至從基底上完全脫離；而生長(zhǎng)于親水的PDA-PDMS和ox-PDMS表面的細(xì)胞始終均勻且密集地黏附于基底上．

圖6 不同方式處理PDMS表面形貌的原子力顯微鏡照片F(xiàn)ig.6 AFM images of PDMS surfaces treated with different modification methods

對(duì)于表面形貌與細(xì)胞黏附和蛋白質(zhì)吸附的關(guān)系，盡管PLL-PDMS、COL-PDMS及未處理PDMS表面都比較平滑，但細(xì)胞在PLL-PDMS、COL-PDMS表面的黏附明顯優(yōu)于未處理PDMS表面；同時(shí)，盡管PDA-PDMS和ox-PDMS比較粗糙，但細(xì)胞在這兩種表面上也能很好地黏附，PDA-PDMS表面的情況甚至優(yōu)于平滑的PLL-PDMS和COL-PDMS表面，可見(jiàn)細(xì)胞在PDMS表面的黏附與表面形貌的關(guān)系不大；但長(zhǎng)期來(lái)看，細(xì)胞在較粗糙的PDMS表面黏附更持久一些；對(duì)于BSA吸附，較平滑表面上的蛋白質(zhì)吸附量比較粗糙表面更多一些．

3 結(jié) 語(yǔ)

未處理的PDMS表面潤(rùn)濕性較差，不太適于細(xì)胞的黏附和增殖，而且容易非特異性吸附蛋白質(zhì)．聚多巴胺修飾和氧等離子體處理PDMS表面的親水性明顯提高且蛋白質(zhì)吸附能力降低，聚賴氨酸和膠原蛋白修飾PDMS表面潤(rùn)濕性和蛋白質(zhì)吸附能力均變化不大．聚多巴胺、聚賴氨酸、膠原蛋白修飾和氧等離子體處理PDMS表面的MG-63細(xì)胞黏附和鋪展情況都明顯優(yōu)于未處理PDMS表面，接近甚至超過(guò)孔板；但MG-63在親水的聚多巴胺修飾和氧等離子體處理表面黏附更持久．PDMS表面形貌對(duì)MG-63黏附的影響不大，但平滑表面的蛋白質(zhì)吸附更多一些．可見(jiàn)，PDMS表面對(duì)蛋白質(zhì)的吸附與表面潤(rùn)濕性密切相關(guān)，但MG-63細(xì)胞黏附和增殖的主要影響因素同時(shí)還包括表面電荷及生物特性等要素．此外，本文研究結(jié)果中，相對(duì)于表面能較低的未處理PDMS表面，修飾后表面能變高的PDMS表面上BSA蛋白質(zhì)吸附量明顯降低，但MG-63細(xì)胞的黏附和增殖反而增加，故PDMS表面細(xì)胞黏附與蛋白質(zhì)吸附之間的關(guān)系需要更進(jìn)一步深入研究．

根據(jù)本文的研究結(jié)果，需要在PDMS表面進(jìn)行長(zhǎng)期MG-63細(xì)胞培養(yǎng)且要求降低蛋白質(zhì)吸附時(shí)，宜選用能獲得較高表面能的聚多巴胺修飾和氧等離子體處理等親水式改性方法；而需要在PDMS表面進(jìn)行短期細(xì)胞培養(yǎng)、同時(shí)要求不影響PDMS表面的蛋白質(zhì)吸附能力時(shí)，可選用不改變PDMS表面浸潤(rùn)性的聚賴氨酸或膠原蛋白修飾等疏水式改性方法．本文的研究結(jié)果為基于PDMS的細(xì)胞培養(yǎng)芯片的應(yīng)用提供了參考．

Li Yinghui. Cell and molecular biology of space medicine in the 21st century[J]. Space Medicine & Medical Engineering，2003，16(Suppl 1)：588-591(in Chinese).

［1］ 李瑩輝. 21世紀(jì)的航天醫(yī)學(xué)細(xì)胞分子生物學(xué)[J]. 航天醫(yī)學(xué)與工程，2003，16(增1)：588-591.

［2］ Cunningham J J，Nikolovski J，Linderman J J，et al.Quantification of fibronectin adsorption to siliconerubber cell culture substrates[J]. Biotechnique，2002， 32(4)：876-880.

［3］ Wu Min-Hsien. Simple poly(dimethylsiloxane)surface modification to control cell adhesion[J]. Surf Interface Anal，2009，41(1)：11-16.

［4］ Wang Lin，Sun Bing，Ziemer K S，et al. Chemical and physical modifications to poly(dimethylsiloxane)surfaces affect adhesion of Caco-2 cells[J]. Journal of Biomedical Materials Research：Part A，2010，93(4)： 1260-1271.

［5］ Boxshall Keir，Wu Min-Hsien，Cui Zheng，et al. Simple surface treatments to modify protein adsorption and cell attachment properties within a poly (dimethylsiloxane)micro-bioreactor[J]. Surf Interface Anal，2006， 38(4)：198-201.

［6］ Viefhues M，Manchanda S，Chao T C，et al. Physisorbed surface coatings for poly(dimethylsiloxane)and quartz microfluidic devices[J]. Anal Bioanal Chem， 2011，401(7)：2113-2122.

［7］ 镠葉雄英，施佳，朱 榮，等. PDMS 氧等離子體表面改性工藝參數(shù)優(yōu)化[J]. 清華大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，50(12)：1974-1977，1982. Ye Xiongying，Shi Liujia，Zhu Rong，et al. Optimization of oxygen plasma treatment parameters for PDMS surface modification[J]. Journal of Tsinghua University：Science and Technology，2010，50(12)：1974-1977，1982(in Chinese).

［8］ Lee Jessamine Ng，Jiang Xingyu，Ryan Declan，et al. Compatibility of mammalian cells on surfaces of poly(dimethylsiloxane)[J]. Langmuir，2004，20(26)： 11684-11691.

(責(zé)任編輯：金順愛(ài))

Surface Treatment of Poly(Dimethylsiloxane)to Affect MG-63 Cell Adhesion and Protein Adsorption

Shi Liujia1,2，Tan Yingjun2，Dong Jingxin1，Ye Xiongying1，Wang Chunyan2，Li Yinghui2
(1. Department of Precision Instruments，Tsinghua University，Beijing 100084，China；2. China Astronaut Research and Training Center，Beijing 100094，China)

As the native poly(dimethylsiloxane)(PDMS)is unfavorable for cell adhesion and easy to adsorb proteins，the PDMS should be modified for cell-culture applications. In this study，the effectiveness of four simple PDMS surface modification methods for cell culture has been compared with the adhesion of MG-63 cells and the amount of bovine serum albumin(BSA)adsorption as indicators. The relationship between PDMS’ surface wettability and topography and the MG-63 adhesion/BSA adsorption was studied. Four groups of modified substrates included PDMS coated with poly(dopamine)(PDA-PDMS)，poly-L-lysine(PLL-PDMS)，collagen type Ⅰ(COL-PDMS)，respectively，and oxidized using oxygen plasma(ox-PDMS). The MG-63 adhesion and spreading were observed using an inverted fluorescence microscope，and the attached MG-63 at 1—4,d were quantitatively evaluated by CellTiter 96?AQueous one solution cell proliferation assay(MTS). The intensities of fluorescein isothiocyanatebovine serum albumin(FITC-BSA)adsorbed on all groups of PDMS substrates were detected. The native/treated PDMS’ surface contact angle and topography were also measured. The experimental results reveal that PDA-PDMS and ox-PDMS surfaces become hydrophilic and rough，while PLL-PDMS，COL-PDMS and native PDMS surfaces are still hydrophobic and smooth. MG-63 prefers to attach and spread on all the four treated PDMS substrates，andstays longer on the hydrophilic surfaces. BSA adsorption on the hydrophilic surfaces is significantly less than that on the hydrophobic surfaces.

poly(dimethylsiloxane)(PDMS)；MG-63；bovine serum albumin(BSA)；surface treatment；cell adhesion；protein adsorption

TQ325

A

0493-2137(2015)09-0845-07

10.11784/tdxbz201402035

2014-02-24；

2014-03-20.

“十一五”國(guó)家科技支撐重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2009BAK59B02)；航天醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與應(yīng)用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室重點(diǎn)資助項(xiàng)目(SMFA11A02)．

施镠佳（1986— ），女，博士研究生，研究實(shí)習(xí)員.

施镠佳，shilj09@mails.tsinghua.edu.cn.

時(shí)間：2014-03-20.

http：//www.cnki.net/kcms/doi/10.11784/tdxbz201402035.html．