Prabhat Pramanik Pil Joo Kim 著 文 靜 林啟美 * 譯

(1 韓國慶尚大學(xué)應(yīng)用生命科學(xué)部 晉州 660-701 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院 北京 100193)

全球土壤碳庫分別是大氣碳庫和生物碳庫的3.3倍和4.5倍。土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)是農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)基本組成要素，在土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)等多種特性中起著重要的作用。有機(jī)碳約占全球土壤碳庫的62%，其中至少50%為化學(xué)穩(wěn)定形態(tài)的腐殖物質(zhì)?？商崛「迟|(zhì)在自然界中普遍存在，并在可持續(xù)農(nóng)業(yè)中起著重要作用。一般來說，腐殖質(zhì)為無結(jié)晶、褐色至黑色、酸性的多分散性物質(zhì)，分子量在幾百至幾千之間。根據(jù)其溶解性，腐殖質(zhì)可分為胡敏酸(HAs)和富里酸(FAs)。胡敏酸是土壤有機(jī)質(zhì)最穩(wěn)定的組分，是有機(jī)殘體經(jīng)過微生物分解的產(chǎn)物。一些研究者利用精密儀器，如傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和核磁共振(NMR)，研究其化學(xué)特性。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，胡敏酸由富含多種官能團(tuán)的有機(jī)物質(zhì)組成，包括芳香族、脂肪族、酚類和對苯二酚類化合物，這些物質(zhì)含量和比例因腐殖化程度而異。根據(jù)分子大小，胡敏酸可分為高分子量和低分子量兩大組分。也可根據(jù)胡敏酸的疏水性、大小及其依賴于電荷運動性的差異進(jìn)行分組。據(jù)報道，作物殘茬的腐殖化作用，可提高羧基碳、烴基碳和芳香族碳(主要是酚類官能團(tuán))含量，減少O-烷基碳含量。一般說來，腐殖化程度較高的有機(jī)物，更容易與土壤膠體上的電荷位點結(jié)合，形成良好的團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，從而改善土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)，提高土壤肥力。然而，人們在分析胡敏酸組分特征之前，并沒有根據(jù)其腐殖化程度的差異對其進(jìn)行分組。本研究假設(shè)由于初始底物及分解過程存在差異，胡敏酸的腐殖化程度有差異，以此為依據(jù)，建立一種胡敏酸分組的新方法，并以施用有機(jī)改良劑的水稻土作參比，測定各組分的相對濃度。

1 材料與方法

1.1 胡敏酸提取

本研究利用以前試驗所采的水稻土樣品，對提取方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化檢驗。該土壤為火山灰土，有機(jī)碳含量10.64±0.95 mg/g，胡敏酸含量0.26±0.09 mg/g。用以下方法提取胡敏酸：在氮氣條件下，一定量土壤樣品在NaOH(0.1 mol/L)-NaCl(30 g/L)溶液中振蕩過夜，離心后收集上清液，沉降物用NaOH-NaCl溶液清洗兩次，將洗滌液與上清液合并。用6 N鹽酸溶液調(diào)節(jié)混合液pH至1.5～2.0，析出沉淀為胡敏酸，上清液為富里酸。胡敏酸在HCl-HF溶液中震蕩(體積比1∶1)，去除無機(jī)物，再溶解于NaOH-NaCl溶液中用于胡敏酸分組。

1.2 胡敏酸分組

根據(jù)極性的差異對胡敏酸進(jìn)行分組，基本原理是：通過改變?nèi)芤旱臉O性改變介電點，使不同的組分分離出來。將150 mg的胡敏酸沉淀物溶于12 mL溶劑中，加入3 mL無水乙醇，充分混合，使乙醇濃度為200 mL/L，4 ℃下靜置過夜，離心，所得沉降物即為200P組分。沖洗沉降物，將沖洗液和離心的上清液混合，加入適量無水乙醇，使乙醇濃度為300 mL/L，4 ℃下靜置過夜，離心，沉降物即為300P組分。重復(fù)上述步驟，調(diào)節(jié)乙醇濃度為400 mL/L和800 mL/L，分別獲得400P和800P組分(圖1)。而溶于800 mL/L乙醇溶液的胡敏酸為800S組分。所有組分測定質(zhì)量后，溶于NaOH-NaCl溶液中，將濃度調(diào)節(jié)為2.33 mg/mL待用。

圖1 本研究所收集的胡敏酸各組分(濃度為2.33 mg/mL)Fig.1 Humic acid fractions (concentration: 2.33 mg/mL)collected during this study

1.3 胡敏酸組分的化學(xué)特征

用重鉻酸鉀氧化法測定各組分有機(jī)碳含量。用Varian紫外分光光度計(Cary 50 Conc)測定在400 nm和600 nm下的吸光度。將1 mg胡敏酸粉末與50 mg光譜級溴化鉀混成小球，用分辨率為4 cm-1的Perkin-Elmer 1725x FTIR光譜儀測定。

1.4 水稻土胡敏酸分析

1.4.1 水稻田間試驗

試驗在韓國慶尚大學(xué)的一個農(nóng)場進(jìn)行，供試土壤為Andiaquands，粘壤質(zhì)，排水較差，測得有機(jī)碳和p H分別是11.79±1.51 m g/g和6.32±0.43(水土比為1∶5)。試驗設(shè)置3個處理：分別為對照、風(fēng)干牛糞(簡稱牛糞)和發(fā)酵牛糞(簡稱堆肥)，牛糞和堆肥的用量均為2 t/hm2，小區(qū)面積100 m2(10 m×10 m)，共計3次重復(fù)，小區(qū)隨機(jī)排列。牛糞和堆肥的總有機(jī)碳含量分別是43.8±4.2 mg/g和29.4±3.8 mg/g，胡敏酸含量分別是0.85±0.09 mg/g和1.73±0.07 mg/g。所有處理采用推薦化肥施入量，即尿素90 kg/hm2，過磷酸鈣45 kg/hm2，氯化鉀58 kg/hm2。供試水稻為“Dongjinbyeo”(日本)，30天的秧苗移栽至淹水稻田，試驗期間稻田水面維持在5～7 cm。

1.4.2 胡敏酸分組及其化學(xué)特征

在水稻收獲期采集土壤樣品，采用上述方法提取和分離胡敏酸各組分。用GC-8000 TOP-Voyager氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)與CDS-1500熱裂解爐結(jié)合，分析胡敏酸各組分的化學(xué)特征。稱取約2.0 mg的胡敏酸樣品與過量的N，O-雙(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)混合進(jìn)行硅烷化作用，并加入三甲基氯硅烷(TMCS)作為催化劑(BSTFA∶TMCS=5∶1,v/v)。將反應(yīng)產(chǎn)物注入到CDS-2000熱解探頭中，以10 ℃/min的速度從70 ℃升至610 ℃，在610 ℃保持10 s。以氦氣作載氣，將熱解產(chǎn)物帶入熔融硅襯里的DB-5 ms柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm，J&W)中，柱溫起初控制在50 ℃保持3 min，然后以7.5 ℃/min升至200 ℃，再以10 ℃/min升至300 ℃，最后在300 ℃保持2 min。離子源在70 eV和40～500 m/Z質(zhì)量檢測范圍內(nèi)運行(圖2)。

圖2 胡敏酸各組分的有機(jī)碳含量和吸光度Fig.2 Organic C contents and spectrophotometric analysis data of HA fractions

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 胡敏酸組分及其化學(xué)特征

采用標(biāo)準(zhǔn)方法，根據(jù)在不同極性溶液中的沉淀反應(yīng)，從供試土壤分離得到200P～800P 7個組分，可溶性組分(800S)為第8個組分，各組分溶解在溶劑中，濃度均為2.33 mg/mL，根據(jù)顏色可以辨別出這些組分的差異(圖1)。從200P到800S，總有機(jī)碳含量逐漸降低，在47%～63%之間，300P最高為63%(圖2)。A600/C比值的變化趨勢與總有機(jī)碳含量相同，雖然400P的比值最高，但與200P，300P并沒有顯著性差異，相比而言，700P，800P和800S的A600/C比值顯著降低(P≤0.05)。

紅外光譜數(shù)據(jù)顯示，不同胡敏酸組分含有的官能團(tuán)存在差異。加入乙醇越少(即極性越小)，酚類、雜環(huán)、羧酸、酮和不飽和化合物沉淀析出越多，濃度相對較高，尤其是300P組分，這些化合物的濃度最高(表1)，而飽和碳化合物、醚和脂肪族羥基官能團(tuán)在800P和800S組分中更加豐富。

2.2 水稻土中總胡敏酸及各組分的含量

不同處理水稻土胡敏酸濃度存在顯著差異(P≤0.05)見圖3a。與對照相比，牛糞和堆肥顯著提高了胡敏酸濃度，從對照的0.13±0.02 mg/g分別提高至0.27±0.03 mg/g和0.33±0.03 mg/g。胡敏酸各組分的濃度受有機(jī)物添加模式的影響。不考慮有機(jī)改良劑的性質(zhì)，300P組分的濃度最高，占總胡敏酸34%～47%(圖3b)，有機(jī)改良劑主要是增加了300P組分的相對濃度。不同處理中，堆肥處理300P濃度最高(相對比例為47%)，顯著高于牛糞處理(相對比例為35%)。400P(9%～26%)和600P(7%～11%)的相對濃度高于余下組分(<8%)，顯然余下組分含量很低，且之間的差異很小。

表1 胡敏酸不同官能團(tuán)紅外光譜峰積分面積Tab.1 Integrated peak areas of the FTIR spectra of HAs corresponding to different functional groups

圖3 不同處理水稻土的胡敏酸各組分含量的差異Fig.3 Changes in HA fractions in rice paddy soils as affected by different treatments

2.3300 P組分的化學(xué)特征

裂解氣質(zhì)聯(lián)機(jī)分析結(jié)果顯示，300P組分主要裂解產(chǎn)物包括吡啶、甲基酮、乙胺、2-硫代-3-甲基戊酮、3-羥基-2-烯、氮雜苯嗪、連氮或芐氧基胺，其濃度差異很大(表2)。其中，甲基酮(41.43%)和3-羥基-2-烯(48.20%)約占90%。

表2 裂解氣質(zhì)聯(lián)機(jī)檢測的300P組分中的化合物Tab.2 Compounds identi fi ed from 300P fractions by Py-GC-MS

3 討論

腐殖質(zhì)是地球表面分布最廣泛且最穩(wěn)定的有機(jī)物質(zhì)，胡敏酸是由多種含碳的大分子化合物構(gòu)成的復(fù)雜混合物，是有機(jī)殘體在異養(yǎng)微生物作用下，經(jīng)過一系列生物化學(xué)反應(yīng)形成的產(chǎn)物。將胡敏酸分組對于理解其與各種有機(jī)化合物和無機(jī)化合物之間的相互作用，以及了解胡敏酸在自然環(huán)境和農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的作用等，都具有十分重要的意義。

胡敏酸在環(huán)境中普遍存在，因它的聚合電解質(zhì)特性，在平衡土壤養(yǎng)分的有效性和一些生物化學(xué)過程時，是一種重要的膠體和吸附劑。分子量大小是影響胡敏酸組分活性的重要因素之一，但穩(wěn)定的形態(tài)和復(fù)雜的結(jié)構(gòu)限制了對胡敏酸組分的分離，也限制了對胡敏酸組分特性的分析。最近，人們陸續(xù)將一些成熟的高新技術(shù)應(yīng)用在胡敏酸特性的研究上，如超濾作用技術(shù)、高效能排阻色譜柱技術(shù)(HPSEC)、針鐵礦順序吸附技術(shù)、酸沉淀核磁共振波譜分析技術(shù)等。

本研究根據(jù)極性的變化，也就是基于腐殖化程度的差異，將胡敏酸分為8個組分，全部羅列出即：200 P、300 P、400P、500 P、600P、700 P、800P和800S。顯然，有機(jī)質(zhì)的腐殖化導(dǎo)致含碳有機(jī)物質(zhì)縮合，腐殖物質(zhì)含碳量提高，因此將總有機(jī)C含量和A600/C比值用作腐殖化程度的指標(biāo)。本研究用A600/C比值來評估胡敏酸各組分的腐殖化程度，此處A600為0.1 M溶液在600 nm下的吸光度；C為0.1 M的溶液碳含量。結(jié)果表明，根據(jù)極性的變化和腐殖化程度的差異，土壤腐殖物質(zhì)可分為多個組分，其中200P組分、300P組分和400P組分有機(jī)碳含量和A600/C比值較高，表明這些組分有機(jī)碳化合物縮合程度及腐殖化程度較高。顯然，腐殖化程度較高的化合物，由于在極性溶液中變化較少，更容易沉淀下來。在Watanabe等的研究也觀察到加入少量丙酮，會導(dǎo)致更多的腐殖物質(zhì)發(fā)生沉淀。

腐殖化過程中，有機(jī)質(zhì)常發(fā)生生物化學(xué)氧化作用。堆肥是一項成熟的技術(shù)，通過腐殖化作用將有機(jī)廢棄物轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)豐富的土壤改良劑。堆肥中胡敏酸組分的含量和質(zhì)量，可用作堆肥熟化度和化學(xué)穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，也是堆肥安全利用與應(yīng)用效果的保證。據(jù)Romero等的研究報道，堆肥過程能夠改變類胡敏酸物質(zhì)的化學(xué)特性和結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致脂肪、多肽和碳水化合物減少，而含氧官能團(tuán)和酸性官能團(tuán)物質(zhì)增加，最終與典型土壤胡敏酸相似。腐殖化過程能促使脂肪族或芳香族羧酸官能團(tuán)和酚類化合物的形成，如-COOH、酮基>C=O、芳香C=C(波動范圍1771～1500 cm-1)和芳香族CH(波動范圍3002～3820 cm-1)。在200P組分，300P組分和400P組分中這些官能團(tuán)含量較高，表明施用堆肥的土壤，其胡敏酸組分中含有較多的腐殖物質(zhì)。

本研究結(jié)果顯示，胡敏酸中腐殖化程度較高的組分，由于在極性溶液中變化較少，更容易發(fā)生沉淀。這就意味著隨著腐殖化程度的提高，由于-COOH基團(tuán)和酚類化合物的存在，會導(dǎo)致負(fù)電荷增加，極性增強(qiáng)。施用有機(jī)改良劑的水稻土，胡敏酸8個組分中200P組分、300P組分、400P組分和500P組分含量增加，表明有機(jī)改良劑可增加水稻土腐殖化程度較高的胡敏酸組分的含量。而淹水水稻土中可交換性養(yǎng)分離子的有效性以及N礦化動力學(xué)特征，則取決于有機(jī)碳底物的腐殖化程度。施用有機(jī)改良劑對水稻土中胡敏酸的300P組分含量影響更為顯著 (P≤0.05)，施用堆肥使胡敏酸的300P組分在總胡敏酸中占的比例從對照土壤的34%提高到47%。裂解氣質(zhì)聯(lián)機(jī)色譜儀分析結(jié)果表明，300P組分的甲基酮和桂醛等化合物，分別來自碳水化合物和木質(zhì)素，貢獻(xiàn)率都在40%以上，可見，含碳的生物多聚物、簡單的碳水化合物、復(fù)雜的木質(zhì)素等，這些物質(zhì)對于腐殖物質(zhì)合成具有同等重要的作用，施入水稻土后，均能夠提高土壤穩(wěn)定碳庫。

致謝和參考文獻(xiàn)(略)