★ 付劍江譚松林李詒光呂紅朱衛(wèi)豐劉紅寧*（.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌330004；.江中藥業(yè)股份有限公司技術(shù)中心 南昌 330096）

甲魚復(fù)合肽對(duì)腫瘤放療的輔助作用研究*

★ 付劍江1**譚松林1李詒光2呂紅1朱衛(wèi)豐1劉紅寧1***（1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌330004；2.江中藥業(yè)股份有限公司技術(shù)中心 南昌 330096）

目的：研究甲魚復(fù)合肽對(duì)腫瘤放療的輔助作用。方法：采用人體胃癌細(xì)胞株BGC-823細(xì)胞皮下移植的方法，建立裸鼠移植瘤模型，從鈷源放射治療的抗腫瘤作用、荷瘤動(dòng)物化療后的總體生存狀況、化療藥物所致白細(xì)胞減少以及骨髓抑制等方面，考察甲魚復(fù)合肽對(duì)放療的輔助作用。結(jié)果：甲魚復(fù)合肽對(duì)放射治療的抗腫瘤作用沒有明顯影響，與鈷源單獨(dú)照射組相比，甲魚復(fù)合肽與鈷源照射聯(lián)合治療組動(dòng)物的瘤塊體積和重量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。甲魚復(fù)合肽可顯著減輕鈷源照射的毒副作用。與鈷源單獨(dú)照射組相比，甲魚復(fù)合肽高（20.8g/kg）、中（10.4g/kg）劑量組動(dòng)物體重顯著增加（P＜0.01）；甲魚復(fù)合肽還可改善鈷源照射所致的骨髓抑制，其骨髓有核細(xì)胞DNA含量顯著增加（P＜0.01），但甲魚復(fù)合肽對(duì)放療裸鼠的外周血白細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著影響（P＞0.05）。另外，甲魚復(fù)合肽還可顯著改善荷瘤動(dòng)物經(jīng)大劑量放射治療后的生存率，動(dòng)物的平均存活時(shí)間和存活率均顯著提高（P＜0.05）。結(jié)論：甲魚復(fù)合肽對(duì)放射治療的抗腫瘤作用沒有明顯的促進(jìn)作用，但可以減輕放射治療的毒副作用。

甲魚復(fù)合肽；放療；減毒增效作用；鈷-60

惡性腫瘤的治療是一個(gè)復(fù)雜而棘手的問題，目前臨床常用的手段包括手術(shù)、化療和放療。且放療仍然是腫瘤治療的重要手段，約70%的患者在不同的治療階段需要進(jìn)行放療，其臨床作用日益突出。但是腫瘤放療所產(chǎn)生的骨髓抑制、免疫抑制等方面的毒副作用以及對(duì)患者生活質(zhì)量所造成的影響，也成為影響其療效的重要原因之一。近年來(lái)，隨著人們對(duì)惡性腫瘤認(rèn)識(shí)的逐漸深入，腫瘤放射治療也取得了較大進(jìn)展，因此如何進(jìn)一步提高療效，延長(zhǎng)患者生存期，改善患者的生活質(zhì)量，解決放療中存在的問題，是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本研究從減毒和增效兩方面入手，就甲魚復(fù)合肽特殊膳食的放療輔助作用進(jìn)行系統(tǒng)研究。

1 材料

1.1 藥品與試劑 甲魚復(fù)合肽（snapping turtle Copeptide，STCP）由江中藥業(yè)股份有限公司提供，批號(hào)20100909，用前用滅菌蒸餾水配制成每毫升相當(dāng)于甲魚復(fù)合肽10.4g的母液，實(shí)驗(yàn)前用滅菌蒸餾水配制成每毫升相當(dāng)于甲魚原料10.4g的母液；DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibico公司）。

1.2 細(xì)胞株 人體胃癌細(xì)胞株BGC-823，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，由江西中醫(yī)藥大學(xué)藥理學(xué)科組傳代、保管。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Balb/C Nu裸鼠，雄性，18～22g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，合格證號(hào)0250262。

1.4 主要儀器 NanoVue微量蛋白核酸儀（GE公司）；AL204電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；XT-200I型血細(xì)胞分析儀（日本西斯美康公司）；數(shù)顯游標(biāo)卡尺（滄州冀路試驗(yàn)儀器公司）；200萬(wàn)居里鈷源（江西科苑輻照技術(shù)開發(fā)有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) BGC-823細(xì)胞在含有10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2、飽和濕度環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞。

2.2 人體胃癌裸鼠移植瘤模型的建立 雄性4～6周齡BALB/C/Nu裸鼠，于背部皮內(nèi)接種BGC-823人胃癌細(xì)胞1×107/只，當(dāng)腫瘤體積長(zhǎng)至1 cm3左右時(shí)，無(wú)菌條件下取下部分瘤塊，切成1mm3左右的小塊，用套管針接種到實(shí)驗(yàn)裸鼠背部皮下，形成皮下移植瘤。

2.3 STCP對(duì)放射治療的減毒和增效作用研究 上述腫瘤移植小鼠在接種48 h后隨機(jī)分為5組：A.空白對(duì)照組：只灌胃給予等體積溶劑；B.60Co照射組：分別于分組后第15d、22d和29d經(jīng)60Co全身照射，照射劑量為3.5Gy，劑量率為0.70Gy/min；C.60Co+高劑量STCP組：60Co全身照射的劑量和時(shí)間同B組；STCP灌胃給予，劑量為20.8g/kg/d，自分組之日開始給藥，連續(xù)灌胃35d，每天1次。D.60Co+中劑量STCP組：60Co全身照射的劑量和時(shí)間同B組；STCP灌胃給予，劑量為10.4g/kg/d，自分組之日開始給藥，連續(xù)灌胃35d，每天1次。E.60Co+低劑量STCP組：60Co全身照射的劑量和時(shí)間同B組；STCP灌胃給予，劑量為5.2g/kg/d，自分組之日開始給藥，連續(xù)灌胃35d，每天1次。上述各組動(dòng)物每周兩次測(cè)量腫瘤體積,繪制生長(zhǎng)曲線，末次給藥24h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，剝離腫瘤組織稱重并計(jì)算腫瘤抑制率。

為了解STCP對(duì)60Co放射治療的減毒作用，上述荷瘤在末次給予STCP 24h后眼眶靜脈叢采血，全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)小鼠外周血細(xì)胞，測(cè)定血中白細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2.4 骨髓DNA含量測(cè)定 參照文獻(xiàn)[1]的方法，剝離出完整股骨，用1mL注射器吸取一定量Hank’s液，沖出股骨中全部骨髓細(xì)胞；最后1000Xg，離心5 min，棄上清。加入一定量PBS溶液洗滌后離心，加入180μL PBS溶液，充分混勻，懸浮細(xì)胞。隨后采用Easy－PureTM DNA提取試劑盒（TransGene BioTech，北京）提取骨髓細(xì)胞內(nèi)的DNA，最后用溶解緩沖液將樣品精確定容為300μL用于測(cè)定DNA含量。

2.5 STCP對(duì)荷瘤動(dòng)物存活率的影響 上述腫瘤移植小鼠在接種48 h后隨機(jī)分組，分組方法同2.3，只是60Co的照射劑量和次數(shù)以及STCP的給藥周期有所不同：60Co的照射方案為自接種后第29d起，將小鼠置于自制射線暴露盒內(nèi)，用60Co照射，每天1次，連續(xù)7d。每次吸收劑量2.0Gy，劑量率為0.4Gy/min，總吸收劑量為14Gy；各劑量組STCP的給藥方案為自接種后第8d開始灌胃給藥，給藥周期為60d，各劑量組的劑量與2.3一致。上述各組動(dòng)物每周測(cè)量腫瘤體積1次,繪制生長(zhǎng)曲線，60d后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，觀察并比較各組動(dòng)物在60d內(nèi)的平均存活時(shí)間、存活動(dòng)物數(shù)并記錄動(dòng)物的大體狀況。

3 結(jié)果

3.1 STCP和60Co源照射聯(lián)合治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響圖1所示為STCP和鈷源照射聯(lián)合治療后人胃癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)情況。從圖中可知，STCP與鈷源照射聯(lián)合治療后，腫瘤的生長(zhǎng)受到一定抑制，但與空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與鈷源照射單獨(dú)治療組相比，聯(lián)合治療高、中、低劑量組的瘤體積和瘤重沒有顯著差異（P＞0.05）。

圖1 STC P和鈷源照射聯(lián)合治療對(duì)人胃癌裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響

3.2 STCP和60Co源照射聯(lián)合治療對(duì)荷瘤動(dòng)物體重的影響 圖2中所列為STCP與鈷源照射聯(lián)合治療后裸鼠體重的變化情況。從圖中可知，荷瘤裸鼠在接受鈷源照射之后，動(dòng)物體重下降，且顯著低于空白組。與鈷源照射組相比，在接受鈷源照射的同時(shí)給予STCP后，各劑量組動(dòng)物的體重均有所增加，其中中劑量和高劑量STCP組與鈷源單獨(dú)照射組之間存在顯著差異（P<0.05）。

圖2 STC P與鈷源照射聯(lián)合治療對(duì)動(dòng)物體重的影響

3.3 STCP和60Co聯(lián)合治療對(duì)荷瘤動(dòng)物外周血白細(xì)胞的影響 見表1。荷瘤裸鼠在接受鈷源照射后外周血白細(xì)胞數(shù)目顯著降低，與鈷源單獨(dú)照射組相比，高、低劑量STCP組動(dòng)物外周血白細(xì)胞數(shù)目有一定提高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 STCP對(duì)放射治療荷瘤裸鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響（±s,n=20)

表1 STCP對(duì)放射治療荷瘤裸鼠外周血白細(xì)胞數(shù)的影響（±s,n=20)

組別 劑量 WBC /109·mL-1空白對(duì)照組 --? 16.63±5.07鈷源照射組 3.5Gy/周 7.09±3.28**STCP高劑量組 20.8g/kg 7.79±2.18**STCP中劑量組 10.4g/kg 6.93±2.51**STCP低劑量組 5.2g/kg 7.17±2.79**

3.4 STCP和60Co聯(lián)合治療對(duì)荷瘤動(dòng)物骨髓DNA含量的影響 表2所示為STCP與鈷源照射聯(lián)合治療對(duì)荷瘤裸鼠骨髓DNA含量的影響。從表中可知，荷瘤裸鼠經(jīng)3次鈷源照射后，骨髓DNA含量顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），而STCP可顯著升高放療動(dòng)物骨髓有核細(xì)胞DNA的含量（P＜0.01）。

表2 STCP對(duì)動(dòng)物骨髓DNA含量的影響（±s,n=20）

表2 STCP對(duì)動(dòng)物骨髓DNA含量的影響（±s,n=20）

注：與鈷源照射組比較，ΔΔP＜0.01；與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01。

組 別 劑量 骨髓DNA含量/μg·mL-1空白對(duì)照組 -- 33.58±10.85鈷源照射組 3.5Gy/周 16.23±2.67**STCP高劑量組 20.8g/kg 33.92±8.48**△△STCP中劑量組 10.4g/kg 37.15±6.99**△△STCP低劑量組 5.2g/kg 34.50±7.82**

表3 STCP對(duì)鈷源照射治療荷瘤裸鼠總體生存率的影響（±s,n=20）

表3 STCP對(duì)鈷源照射治療荷瘤裸鼠總體生存率的影響（±s,n=20）

注：與鈷源照射組比較，ΔΔP＜0.01；與空白對(duì)照組比較，**P＜0.01。

組別 劑量空白對(duì)照組 --100.0鈷源照射組 2.0Gy 0.0 STCP高劑量組 20.8g/kg 20.0 STCP中劑量組 10.4g/kg 25.0 STCP低劑量組 5.2g/kg 15.0平均存活時(shí)間/d 存活數(shù)/只60.00±0.00 20 33.50±2.78**0 41.25±12.41**△△4△△41.45±12.41**△△5△△44.70±10.12**△△3△△存活率/%

3.5 STCP和60Co聯(lián)合治療對(duì)荷瘤動(dòng)物總體生存率的影響 為進(jìn)一步了解STCP的放療保護(hù)作用，本研究考察了STCP對(duì)放療動(dòng)物總體存活率的影響，結(jié)果見表3。從表中可知，經(jīng)大劑量鈷源照射之后，模型組動(dòng)物全部死亡，而高、中、低劑量STCP組的動(dòng)物存活數(shù)分別為4、5、3只。另外，STCP均可顯著延長(zhǎng)放療后荷瘤小鼠的平均存活天數(shù)（P＜0.01）。提示：STCP可顯著提高化療動(dòng)物的總體生存率。

4 結(jié)論

甲魚是傳統(tǒng)的中藥材[2-3]，也是中國(guó)民間傳統(tǒng)的藥食配伍組分之一，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、動(dòng)物膠及鈣、鐵、維生素B族等營(yíng)養(yǎng)成分[4]，具有滋陰清熱、平肝熄風(fēng)、軟堅(jiān)散結(jié)等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，甲魚提取物具有抗衰老[5]、抗突變[6]、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力[5,7]，以及抗腫瘤[7-9]等功效。甲魚復(fù)合肽采用甲魚、海洋魚皮膠原低聚肽、大豆低聚肽及酪蛋白磷酸肽為原料，同時(shí)均衡搭配水溶性膳食纖維、枸杞子、葡萄糖酸鋅等營(yíng)養(yǎng)素制成的一種特殊營(yíng)養(yǎng)膳食，一方面保留了甲魚的生物活性，同時(shí)提高了甲魚及其他成分的營(yíng)養(yǎng)吸收效率。

本研究表明，甲魚復(fù)合肽與60Co聯(lián)合治療后，對(duì)移植于裸鼠皮下的人胃癌的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響，但甲魚復(fù)合肽可顯著降低鈷源照射治療對(duì)荷瘤動(dòng)物所產(chǎn)生的骨髓損害，其骨髓DNA含量均顯著升高，外周血白細(xì)胞數(shù)也有一定升高，同時(shí)甲魚復(fù)合肽還可明顯延長(zhǎng)放療后荷瘤動(dòng)物的存活時(shí)間并降低死亡率，提示甲魚復(fù)合肽對(duì)放療動(dòng)物具有明顯的骨髓保護(hù)作用。

［1］國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局.保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)程序和檢驗(yàn)方法規(guī)范[M].北京:國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局許可司,2011：124-132.

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Ad juvant Effects of Snapping Turtle Co-Peptide（STCP）on Radiotherapy for Cancer

FU Jian-jiang1,TAN Song-lin1,LIYi-guang2,LV Hong1,ZHUW ei-feng1,LIU Hong-ning1
1.JiangxiUniversity of TCM,Nanchang 330004,China;
2.Jiangzhong Pharmaceutical Co.Ltd,Nanchang 330096,China.

Objective:To evaluate the adjuvant effects of Snapping Turtle Co-Peptide （STCP）on radiotherapy for cancer.Methods: BGC-823 xenograftmodel of nudemice was established,and tumor growth curve,tumor weight,and overall survival of nude mice weremonitored.In addition,white blood cells and DNA content of bonemarrow were detected.Results:No significant synergistic effects were observed on tumor volume and weight（P＞0.05）.But compared to60Co treated group,body weight and DNA content in bonemarrow were obviously up-regulated （P＜0.01）after co-treated with STCP and60Co In addition,there were an significant increase in STCP and60Co co-treated groups（P＜0.05）.Conclusion:STCP cannot enhance antitumor properties of radiotherapy in gastric cancer,but this food for special dietary usesmay attenuate side effects of radio-therapeutic agents.

Snapping Turtle Co-Peptide;Radiotherapy;Attenuation and synergy;60Co

R285.5

A

2014-03-27）編輯：萬(wàn)崇毅

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30860375，81160530，81260656）；教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（211091）；江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010G QY0147）；贛鄱英才555工程人才項(xiàng)目。

**第一作者：付劍江，博士，副教授。研究方向：中藥抗腫瘤藥理。T el:（0791）87118919，E-m a il:j i a n j i a n g_f u@ye a h.net。

***通信作者：劉紅寧，博士，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向：中藥新藥開發(fā)與新劑型。