★ 鄧億娟王躍生崔佳章軍陳莎劉安?（.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京00700；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌330004）

骨關(guān)節(jié)痛熏洗方提取工藝研究

★ 鄧億娟1,2王躍生1,2崔佳1章軍1陳莎1劉安1?（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所 北京100700；2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌330004）

目的：優(yōu)選骨關(guān)節(jié)痛熏洗方的提取工藝。方法：采用加熱回流法提取，通過考察提取率及復(fù)溶解度，選擇最佳的提取溶劑；采用L9（34）正交試驗(yàn)，以干膏得率、芍藥苷和丹酚酸B的量為綜合評(píng)分指標(biāo)考察溶媒用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)。結(jié)果：優(yōu)選制備工藝為6倍量水加熱回流提取3次，每次2 h，結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行，可用于骨關(guān)節(jié)痛熏洗方的制備。

熏洗方；制備；提取工藝

熏洗[1]，是利用藥物煎湯趁熱在皮膚或患處進(jìn)行熏蒸、淋洗的治療方法。骨關(guān)節(jié)痛熏洗方為臨床經(jīng)驗(yàn)方，該藥作為傷骨科的外用協(xié)定處方用于臨床已有三十多年。本方由當(dāng)歸、川芎、丹參、赤芍、透骨草、伸筋草等藥材組成，具有活血止痛，溫經(jīng)散寒、祛風(fēng)通絡(luò)、消腫化濕、強(qiáng)筋骨、利關(guān)節(jié)之功效。實(shí)驗(yàn)研究表明中藥外用可改善血液循環(huán)，提高超氧化物歧化酶活性，降低骨內(nèi)壓，保護(hù)關(guān)節(jié)，治療骨性關(guān)節(jié)炎，臨床用于一切損傷、骨折后或者勞累、運(yùn)動(dòng)過量后引起的關(guān)節(jié)筋骨酸痛、腫脹，也可治療各種關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)增生或風(fēng)寒引發(fā)關(guān)節(jié)肌肉酸痛等[2]。

目前對(duì)熏洗方的研究主要集中在它的藥物組成，配伍，藥物功效等，也有一些臨床研究，但很少有關(guān)于熏洗方制備工藝的研究。且熏洗劑存在一些共性的問題，比如藥物體積大，攜帶不便，不易保存，制作過程繁瑣，患者不易自行處置，未能工業(yè)化、成品化和商品化。這些弊端限制了熏洗方在臨床上更廣泛的運(yùn)用。如果將骨關(guān)節(jié)痛熏洗方制備成提取物，將能夠有效的解決上述問題，提高臨床依從性。本文進(jìn)行了骨關(guān)節(jié)痛熏洗方制備工藝的研究，希望可以得到制備規(guī)范的熏洗劑，方便患者使用。

1 儀器與藥材

島津LC-20AT高效液相色譜儀；SPD-M 20A紫外-可見光二極管陣列檢測(cè)器；SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器；島津LC-Solution工作站；乙腈（色譜級(jí)，美國(guó)Fisher公司）；雙蒸水（娃哈哈）；其余試劑為分析純；

當(dāng)歸、紅花、白芷、丹參、赤芍、海桐皮、紫荊皮、草烏、桂枝、天南星、獨(dú)活等43味中藥材（北京人衛(wèi)飲片廠）；芍藥苷標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110738-201337）；丹參酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品（中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，批號(hào)1041-040402）

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 提取溶劑的選擇 稱取等量熏洗方藥材375g共2份，分別用水與95%乙醇作提取溶劑，加8倍量提取溶劑，加熱回流2次，每次1.5 h，合并2次提取液，離心（3500 r/min）10m in，取上清液，50℃濃縮至適量，真空干燥（50℃，8.5 h）得提取物，以藥材的提取率及其復(fù)溶解度為提取溶劑的考察指標(biāo)。

2.2 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn) 在確定提取溶劑的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)對(duì)熏洗方的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。參照L9（34）進(jìn)行三水平三因素正交設(shè)計(jì)，選擇提取溶劑量（A）、提取時(shí)間（B）和提取次數(shù)（C）作為考察因素，因素水平見表1。

表1 因素水平表

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：DiamonsilTM（鉆石）C18（250mm×4.6mm，5μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm、286 nm；進(jìn)樣體積：10μL；流速：1m L/m in；柱溫：35℃；流動(dòng)相：梯度洗脫，A為1%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫條件見表2。

表2 HPLC梯度洗脫條件

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取芍藥苷、丹酚酸B對(duì)照品適量，分別置100m L容量瓶中，加甲醇超聲溶解，冷卻后稀釋至刻度，搖勻，取續(xù)濾液即得對(duì)照品溶液。

2.3.2.2 樣品溶液的制備 分別稱取等量熏洗方藥材125 g，共9份，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表（表3）提取，合并各次提取液，混勻，取適量提取液離心10m in（3500 r/m in），取上清液，用0.45μm微孔膜過濾，取續(xù)濾液即得樣品溶液。

2.3.3 干膏得率的測(cè)定 精密吸取上述每組正交試驗(yàn)的提取液，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，置105℃烘箱干燥3h至恒重，取出置干燥器中冷卻至室溫迅速稱重，計(jì)算干膏得率。

2.3.4 供試液的測(cè)定 分別將上述對(duì)照品溶液和樣品溶液測(cè)定芍藥苷及丹酚酸B的含量。

2.4 結(jié)果

2.4.1 提取溶劑的優(yōu)選 經(jīng)計(jì)算，水和醇的提取率分別為27%和12%。復(fù)溶解考察顯示，5 g水提物能完全溶解于10m L水中，1 g醇提物不能完全溶解于20m L水中。上述結(jié)果表明水的提取率遠(yuǎn)高于醇，而且水提取物易溶于水，便于患者使用。加之骨關(guān)節(jié)痛薰洗方臨床使用水做提取溶劑，綜合考慮，選擇水為提取溶劑。

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 正交試驗(yàn)結(jié)果及浸出率、芍藥苷和丹酚酸B量的直觀分析和方差分析見表3和表4。

由表3可以看出，浸出率極差的排列為C>B>A，影響因素的大小為提取次數(shù)>提取時(shí)間>溶劑量，即影響因素最大的是提取次數(shù)，最小的是溶劑用量，從直觀分析可以看出提取2 h和3 h差異不大，因而各因素最優(yōu)水平為6倍水量，提取3次，每次2h。

從正交試驗(yàn)芍藥苷量極差分析結(jié)果來(lái)看，對(duì)熏洗方芍藥苷量影響最大的因素為提取次數(shù)，其方差分析表也再一次佐證這一結(jié)論。

從正交試驗(yàn)丹酚酸B量極差分析結(jié)果來(lái)看，對(duì)熏洗方丹酚酸B量影響最大的因素為提取加水量，但與提取時(shí)間和提取次數(shù)相比較，其數(shù)值差距并不大。從熏洗方丹酚酸B量方差分析表來(lái)看，影響丹酚酸B量的因素并無(wú)顯著性，由于丹酚酸B不穩(wěn)定[4-6]，用其作為提取影響因素考察指標(biāo)可能不妥。

綜合直觀分析與方差分析結(jié)果可知，浸出率的影響因素主要是提取次數(shù)和提取時(shí)間，芍藥苷的影響因素是提取次數(shù)，而丹酚酸B的影響因素并不明顯，可能是因其受熱不穩(wěn)定照成的，溶劑量對(duì)每個(gè)指標(biāo)的影響都不明顯。綜合考慮，優(yōu)化條件為6倍水量，提取3次，每次2h。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析表

表4 浸出率、芍藥苷、丹酚酸方差分析表（a=0.10）

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按照優(yōu)化工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，稱取熏洗方藥材750 g，6倍量水加熱回流提取3次，每次2 h。平行3次試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

從驗(yàn)證結(jié)果可看出3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的浸出率與正交試驗(yàn)中浸出率的最大值接近，芍藥苷量均大于正交試驗(yàn)芍藥苷量最大值，而丹酚酸B量則與正交試驗(yàn)丹酚酸B量最大值存在明顯差異，就連3組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得丹酚酸B量都存在很大差異。根據(jù)上述結(jié)果，我們認(rèn)為丹酚酸B不穩(wěn)定[4-6]，且造成其不穩(wěn)定的因素很多，其不能作為熏洗方的指標(biāo)成分。通過驗(yàn)證試驗(yàn)可以確定優(yōu)化工藝提取率高，穩(wěn)定性好，可以作為生產(chǎn)工藝。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

3.1 指標(biāo)成分的選定 在正交試驗(yàn)時(shí)，筆者選擇了浸出率，芍藥苷，丹酚酸B作為評(píng)價(jià)工藝的指標(biāo)成分，在對(duì)其含量測(cè)定時(shí)，首先選擇含量最高的成分——丹參中的丹酚酸B為指標(biāo)成分。但預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示丹酚酸B的穩(wěn)定性不好，所以同時(shí)選擇了含量次之的赤芍中的芍藥苷作為指標(biāo)成分，在正交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)丹酚酸B不穩(wěn)定，張軍等的研究有所體現(xiàn)，且造成其不穩(wěn)定的因素很多，認(rèn)為其含量不可控，故不宜作為熏洗方的指標(biāo)成分，而相比之下芍藥苷的穩(wěn)定性好[7]，故最終將出膏率與芍藥苷作為熏洗方提取工藝的考察指標(biāo)。

3.2 提取工藝優(yōu)選 雖然傳統(tǒng)用法上，熏洗方在使用時(shí)是用水作為溶劑，先熏后淋，但為了更好的證明其優(yōu)勢(shì)，選擇了在回流提取中常用的95%乙醇進(jìn)行對(duì)比研究。由于本研究的目的包括熏洗劑提取率高，提取物易干燥且水溶性好，提取物復(fù)溶后不溶物要少，所以在考察時(shí)筆者選擇了浸出率及復(fù)溶解度這兩個(gè)指標(biāo)來(lái)進(jìn)行溶劑的考察。結(jié)果證明在以水為溶劑時(shí)熏洗方提取物得率高，復(fù)溶性好，表明水為適宜的提取溶劑。

［1］謝林，韓建偉，付聰，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選傷科熏洗湯劑的水提取工藝研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（13）：17-20.

［2］王應(yīng)堂，周海旺.中藥熏洗治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎臨床觀察[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，27（6）：43-45.

［3］郭躍華.中醫(yī)骨傷科熏洗方的配伍規(guī)律與臨床應(yīng)用研究[J].醫(yī)學(xué)美學(xué)美容（中旬刊），2014，4：182-182.

［4］王韶旭，譚志誠(chéng)，車如心，等.丹酚酸B的熱穩(wěn)定性及其熱分解動(dòng)力學(xué)研究[J].化學(xué)學(xué)報(bào)，2012，70（2）：212-216.

［5］郭永學(xué).丹酚酸B的降解機(jī)理及純化工藝研究[D].大連：大連理工大學(xué)，2007.

［6］張軍，王鳳云，詹麗玲，等.丹參藥材提取液中丹酚酸B穩(wěn)定性影響因素的考察[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（10）：789-790.

［7］解江純，劉志東，田慧，等.芍藥苷穩(wěn)定性研究[J].天津中醫(yī)藥，2010，27（4）：344-345.

Extraction Technology Research of Guguanjietong Fum igation

DENG Yi-juan1,2,WANG Yue-sheng1,2,CUIJia1,ZHANG Jun1,CHEN Sha1,LIU An1
1.Institute of Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing 100700,China;
2.JiangxiUniversity of Traditional Chinese Medicine,Nanchang,330004,China.

Objective:To optimize the extraction condition of Guguanjietong fumigation.Method:Using the heating reflux extraction method to extract and investigating the extraction rate and solubility of extraction to choose extraction solvent.The amount of solvent, extraction time and extraction timeswere selected as the factors and were numbered in three levels respectively.L9（34）orthogonal test was adopted.Extraction rate of lithospermic acid B and paeoniflorin were used as index components.Results:The optimal extraction condition was determined as follows:6-folds of water,extracting for 3 times,2 hours each time.Conclusion:The optimized extraction process is stable and can be used to preparate Guguanjietong fumigation.

Guguanjietong Fumigation；Extraction；Process

R283.6

A

2014-08-31）編輯：曾文雪

*通信作者：劉安（1976-），男，博士，研究員。研究方向：中藥化學(xué)。T el：（010）64014411，E-m a il：l a62@163.co m。