尤麗菊，郭 輝，李宜川

雷公藤內(nèi)酯醇對糖尿病腎病大鼠腎內(nèi)Glut-1、Glut-4表達(dá)的影響

尤麗菊，郭 輝，李宜川

目的 探討雷公藤內(nèi)酯醇對糖尿病腎病大鼠腎內(nèi)Glut-1、Glut-4表達(dá)的影響。方法 將45只大鼠按體重隨機(jī)分為正常對照組(C組，13只)和糖尿病模型組(32只)。模型組腹腔注射鏈脲菌素(STZ) 52 mg/kg，1次/d，連續(xù)5 d；正常對照組僅腹腔注射等體積上述緩沖液。完成STZ 注射72 h后，尾靜脈采血測空腹血糖，并同時測尿糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上者列入糖尿病觀察對象。將造模成功的28只雄性大鼠，按體重、空腹血糖隨機(jī)分為DM模型組對照(DM組，14只)、雷公藤內(nèi)酯醇組(TP組，14只)。結(jié)果 DM組、TP組第4、第8周的24 h尿mALB定量較C組明顯增加(P<0.01)，且DM組第8周高于第4周(P<0.01)，TP組第8周較第4周明顯降低(P<0.01)。DM組系膜細(xì)胞及上皮細(xì)胞Glut-1的表達(dá)較正常對照組均明顯增加(P<0.05)，Glut-4的表達(dá)均有所減少(P<0.05)。與DM組比較，TP組系膜細(xì)胞及上皮細(xì)胞Glut-1的表達(dá)降低(P<0.01)；Glut-4在系膜細(xì)胞的表達(dá)升高(P<0.05)，在上皮細(xì)胞的表達(dá)變化不明顯(P>0.05)。結(jié)論 雷公藤內(nèi)酯醇能明顯降低糖尿病腎病大鼠腎小球系膜細(xì)胞及上皮細(xì)胞內(nèi)的Glut-1含量，增高Glut-4在腎小球系膜細(xì)胞的表達(dá)。

雷公藤內(nèi)酯醇；糖尿病腎??；大鼠；Glut-1；Glut-4

0 引言

雷公藤內(nèi)酯醇(Triptolide，TP)又名雷公藤甲素，是從衛(wèi)矛科植物雷公藤(TripterygiumWilfordiiHook.f)中分離提取得到的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，難溶于水，溶于甲醇、乙酸乙酯、氯仿等，具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[1]，早已用于糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)的治療[2]。測定24 h尿微量白蛋白(mALB)是公認(rèn)的診斷糖尿病(Diabetes mellitus，DM)早期腎病的標(biāo)準(zhǔn)方法[3]。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白(Glucose transporter，Glut)是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)糖攝入及糖代謝的第一道關(guān)卡，在介導(dǎo)糖尿病組織損傷中起重要作用[4]。其中葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(Glut-1)是哺乳動物細(xì)胞糖跨膜轉(zhuǎn)運的主要載體，能促進(jìn)葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散及代謝[5]。Glut-1在腎小球系膜細(xì)胞和腎小球上皮細(xì)胞的表達(dá)已經(jīng)得到了確認(rèn)[6-7]。Glut-4主要分布于脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞[8]，即胰島素敏感性細(xì)胞，這些細(xì)胞在胰島素刺激下葡萄糖攝入迅速升高，Glut-4在腎血管、腎小球與腎小管也有表達(dá)[9-10]。本實驗主要觀察TP對糖尿病腎病大鼠腎內(nèi)Glut-1、Glut-4表達(dá)的影響，為TP對糖尿病腎病的預(yù)防、治療提供實驗依據(jù)。

1 主要儀器和試劑

激光共聚焦顯微鏡(Bio-Rad Radinace 2100)、圖像分析儀(Media Cybernetics公司)、快速恒溫冰凍切片機(jī)(YD1508浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠)、血糖儀(羅氏公司)、全自動生化分析儀(日立7600型)、尿mALB試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司)、鏈脲佐菌素(Streptozocin，STZ，Sigma公司)、TP(上海融合有限公司)，Glut-1、Glut-4多克隆抗體，即用型SABC試劑盒，F(xiàn)ITC標(biāo)記二抗等(武漢博士德生物工程公司)。

2 實驗方法

2.1 實驗動物與分組 SD大鼠45只，體重160～180 g，雄性，購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，許可證號：SCXK(鄂)2011-0007。將45只雄性大鼠按體重隨機(jī)分為正常對照組(C組，13只)和糖尿病模型組(32只)。造模前正常飼養(yǎng)1周，然后禁食12 h。糖尿病模型組腹腔注射STZ 52 mg/kg (臨用前用 0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解，pH 4.2)，1次/d，連續(xù)5 d。正常對照組僅腹腔注射等體積上述緩沖液。完成STZ注射72 h后，尾靜脈采血測空腹血糖并同時測尿糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖+++以上者列入DM觀察對象[11]。將造模成功的28只(造模過程中死亡4只，死亡原因可能是STZ的毒性作用)雄性大鼠，按體重、空腹血糖隨機(jī)分為模型對照組(DM組，14只)、雷公藤內(nèi)酯醇組(TP組，14只)。

2.2 給藥方法 雷公藤內(nèi)酯醇組給予TP混懸液(用少量吐溫-80溶解，再加入滅菌生理鹽水稀釋至所需濃度)1.8 g/kg灌胃，C組和DM組灌服等體積飲用水，連續(xù)給藥8周，每日上午1次。實驗期間大鼠自由飲水、飲食(DM組、TP組明顯比C組多飲多食多尿。DM組實驗中期死亡1只，原因可能是肺部感染；TP組實驗后期有1只死于腹瀉；其余動物精神活動均正常)，不使用胰島素及其他降糖藥物。

2.3 生化標(biāo)本收集 分別于灌胃后第4周、第8周末采用不銹鋼代謝籠收集大鼠24 h尿標(biāo)本，收集時預(yù)先將大鼠放入洗凈的代謝籠中，收集尿液期間大鼠禁食，自由飲水，盡量減少聲、光等對動物的刺激。記錄尿液總量后取10 mL，5 000 r/min離心5 min，去除沉渣，用免疫透射比濁法測24 h尿mALB。

2.4 標(biāo)本制備 實驗第8周末，各組大鼠用電子天平稱重后，100 mL/L水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉，約5 min后，剪開大鼠腹腔，10 mL注射器心臟取血，盡量取盡全血，迅速取出雙腎，腎臟經(jīng)4 ℃預(yù)冷的生理鹽水灌洗，至整個腎臟顏色變蒼白后游離、去除包膜，稱重，取右腎按冠狀位縱行剖開，取腎皮質(zhì)若干塊置于4%多聚甲醛固定6 h，移至30% 蔗糖溶液內(nèi)，放4 ℃冰箱內(nèi)，待腎組織下沉后，取出OCT包埋，放-80 ℃冰箱內(nèi)待用。

2.5 Glut的免疫熒光染色 取冠狀位腎皮質(zhì)連續(xù)冰凍切片，Glut-1、Glut-4各5張，厚8 μm，用H2O2與純甲醇浸泡腎片，水洗后滴加BSA封閉液，室溫20 min，甩去液體不洗。0.1% TritonX100-PBS浸泡2～3 min，碘化丙啶(PI)浸泡20 min，PBS洗后滴加1∶200的一抗(兔IgG)，37 ℃孵育1 h。漂洗后滴加二抗(FITC標(biāo)記羊抗兔抗體)，37 ℃孵育20 min。PBS反復(fù)漂洗后，甘油-PBS封片，放4 ℃冰箱保存待檢。陰性對照用PBS代替一抗。

2.6 Glut檢測 激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)的氬離子激光系統(tǒng)，同時掃描FITC和PI標(biāo)記的陽性反應(yīng)物。掃描參數(shù)(機(jī)器設(shè)定)：激發(fā)光波長488 nm，觀測光波長518、576 nm，物鏡為40倍，Zoom：1.0[12]。經(jīng)圖像分析儀攝像、分析大鼠腎皮質(zhì)腎小球系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞Glut-1和Glut-4的表達(dá)情況。每張切片系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞各觀察10個視野。計算各視野綠色熒光陽性面積的百分率，以平均陽性率分析各組不同腎區(qū)內(nèi)Glut的表達(dá)。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠24 h尿mALB定量的變化 灌胃后第4周、第8周，C組24 h尿mALB定量變化不大，DM組、TP組較C組明顯增加(P<0.01)，且DM組第8周較第4周亦增加(P<0.01)，TP組第8周較第4周明顯降低(P<0.01)。見表 1。

3.2 各組大鼠腎小球系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞的Glut-1、Glut-4的表達(dá) C組腎小球系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞的Glut-1表達(dá)高于Glut-4。DM組系膜細(xì)胞及上皮細(xì)胞的Glut-1表達(dá)較C組明顯增加(P<0.05)，Glut-4的表達(dá)明顯減少(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與DM組比較，TP組Glut-1表達(dá)較低(P<0.01)，Glut-4在系膜細(xì)胞的表達(dá)有所增高(P<0.05)，其在上皮細(xì)胞的表達(dá)與DM組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表 2。

表1 大鼠24 h尿mALB定量的變化(mg/24 h)

注：與C組比較，**P<0.01；與第4周比較，##P<0.01

表2 大鼠腎皮質(zhì)內(nèi)Glut-1和Glut-4的平均陽性率

注：與C組比較，*P<0.05；與DM組比較，△P<0.05，△△P<0.01

4 討論

本研究結(jié)果顯示，DM組隨病情進(jìn)展，24 h尿mALB明顯增加，提示腎小球的高濾過功能加強(qiáng)，用TP干預(yù)糖尿病大鼠模型4周后，24 h尿mALB減少，治療8周后，24 h尿mALB進(jìn)一步減少，表明腎小球的高濾過功能有效改善，也證明TP對減少蛋白尿的產(chǎn)生和延緩糖尿病腎病有較好的治療作用[13]。

DM組腎小球系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞的Glut-1的表達(dá)均明顯增加，Glut-1表達(dá)量增加引起過多的葡萄糖進(jìn)入腎小球系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞，出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)糖代謝的紊亂，若腎臟內(nèi)多余糖分無法排除體外，可致系膜細(xì)胞肥大，細(xì)胞外基質(zhì)增多，腎小球基底膜增厚，出現(xiàn)蛋白尿。因此，Glut-1的數(shù)量和功能狀態(tài)是決定細(xì)胞內(nèi)糖代謝的一個重要閥門[4]，是DN發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素。還有研究發(fā)現(xiàn)，DN患者腎小球內(nèi)Glut-1的表達(dá)明顯增加，其表達(dá)強(qiáng)度與腎臟病變程度相關(guān)，并呈局灶節(jié)段性增強(qiáng)[14]。本實驗中，DM組腎小球系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞的Glut-4表達(dá)均明顯減少，可進(jìn)一步加重高糖引起的損害。有報道，DN時系膜細(xì)胞Glut-4表達(dá)受抑可以導(dǎo)致細(xì)胞對葡萄糖轉(zhuǎn)運障礙，引起的一系列變化可使DN病程進(jìn)入不可逆階段[15]。因此，糖尿病時，腎小球系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞Glut-1的表達(dá)增高及Glut-4的表達(dá)減少均是腎臟受累的重要因素。

本研究中，TP組腎小球系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞的Glut-1表達(dá)均顯著降低，表明TP能減少腎小球系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞的Glut-1的表達(dá)，即減少了高糖的直接與間接損傷作用，明顯減輕蛋白尿，減輕腎小球肥大和足細(xì)胞損傷、腎臟的炎癥和氧化應(yīng)激，同時改善高脂血癥和肥胖癥[16]，延緩腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)展并保護(hù)腎功能。TP組Glut-4在系膜細(xì)胞的表達(dá)增高，可促進(jìn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運和利用，從而降低血糖水平[17]。也有研究推測，任何能增加系膜細(xì)胞中Glut-4表達(dá)、促進(jìn)Glut-4易位的因素均對糖尿病的腎臟有保護(hù)作用[14]。

綜上所述，早期應(yīng)用TP可改善DM大鼠腎臟的組織病理學(xué)變化，最終延緩DN的發(fā)生和發(fā)展，其機(jī)制可能與其下調(diào)系膜細(xì)胞和上皮細(xì)胞Glut-1的表達(dá)量及功能活性，以及使Glut-4在系膜細(xì)胞的表達(dá)增高有關(guān)。

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Influence of triptolide on the expression of Glut-1,Glut-4 in kidney of diabetic nephropathy rats

YOU Li-ju,GUO Hui,LI Yi-chuan

(Shangqiu Medical College,Shangqiu 476000,China)

Objective To discuss the influence of triptolide on the expression of Glut-1,Glut-4 in kidney of diabetic nephropathy rats.Methods 45 rats were randomly divided into two groups according to weight: normal control group (group C,n=13) and diabetic model group (n=32).Rats in model group were intraperitoneally injected streptozotocin (STZ) 52 mg/kg for 5 d continuously; rats in group C were given intraperitoneal injection of equal volume of the buffer solution.At 72 h after the injection,the levels of fasting blood glucose and urine glucose were detected,and the rats with blood glucose≥16.7 mmol/L,urine glucose more than+++were included as the diabetes objects.The 28 male rats (successful model) were randomly divided into DM model group (DM group,n=14) and triptolide group (TP group,n=14).Results At the 4th and 8th weeks,the 24 h urinary mALB level in DM group and TP group significantly increased than that of group C (P<0.01),the mALB in DM group at the 8th week was higher than that at the 4th week (P<0.01),but the mALB in TP group at the 8th week reduced (P<0.01).The expression of Glut-1 in mesangial and epithelial cells in DM group increased more significantly than that of group C (P<0.05),and the expression of Glut-4 reduced (P<0.05).Compared with DM group,the expression of Glut-1 in mesangial and epithelial cells of group PT was significantly lower (P<0.01),the expression of Glut-4 in mesangial cells increased (P<0.05),no significant difference was found in the expression of epithelial cell (P>0.05).Conclusion Triptolide can significantly reduce the content of Glut-1 in glomerular mesangial and epithelial cells of diabetic nephropathy rats,increase the Glut-4 expression in glomerular mesangial cells.

Triptolide; Diabetic nephropathy; Rats; Glut-1; Glut-4

2014-09-24

商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河南 商丘 476000

2011年河南省教育廳自然科學(xué)研究計劃項目(2011C310003)

10.14053/j.cnki.ppcr.201504004