郭丹丹，章以杰，劉志成，常國江，林 俊，田苗苗，宋曉麗

硫化氫對老齡急性腦梗死大鼠海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的影響

郭丹丹，章以杰*，劉志成，常國江，林 俊，田苗苗，宋曉麗

目的 評價硫化氫(H2S)對老齡急性腦梗死大鼠海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的影響。方法 健康雄性SD大鼠60只，18～20月齡，體重500～700 g，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，每組15只：對照組(C組)、模型組(M組)、NaHS 組(N組)、生理鹽水組(S組)。N組于制作模型前25 min給予大鼠腹腔注射H2S外源性供體NaHS(28 μmol/kg)；S組于制作模型前25 min給予大鼠腹腔注射等量生理鹽水；C組不行任何處理。采用線栓法致大鼠大腦中動脈阻塞致急性腦梗死模型。于急性腦梗死后第1～5天每組隨機(jī)取5只大鼠，進(jìn)行Morris水迷宮進(jìn)行測試，記錄逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)；于急性腦梗死后1、3、5 d(T1～T3)每組隨機(jī)取5只大鼠處死，取海馬組織，電鏡下定量測定海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)各項指標(biāo)。結(jié)果 與C組比較，M組、N組和S組大鼠急性腦梗死后逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，海馬CA3區(qū)突觸數(shù)減少，間隙增寬，突觸后膜致密物厚度變薄，突觸活性區(qū)長度縮短，突觸界面曲率減小(P<0.05)；與M組比較，N組急性腦梗死后逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多，海馬CA3區(qū)突觸數(shù)增加，間隙變窄，突觸后膜致密物厚度變厚，突觸活性區(qū)長度延長，突觸界面曲率增大(P<0.05)；與N組比較，S組急性腦梗死后逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少，海馬CA3區(qū)突觸數(shù)減少，間隙增寬，突觸后膜致密物厚度變薄，突觸活性區(qū)長度縮短，突觸界面曲率減小(P<0.05)。結(jié)論 H2S可改善老齡急性腦梗死大鼠認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與海馬組織CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)改變有關(guān)。

硫化氫；認(rèn)知功能；急性腦梗死；海馬；突觸

0 引言

急性腦梗死已成為世界上主要的致死疾病之一，認(rèn)知功能障礙是幸存者最常見的并發(fā)癥，有研究顯示，急性腦梗死后1周時，認(rèn)知功能障礙的發(fā)生率為61%，6個月時仍有37%的患者遺留認(rèn)知功能障礙[1]。因此，在腦梗死早期，注重患者認(rèn)知功能的恢復(fù)，對患者改善生活質(zhì)量有重要意義。硫化氫(H2S)是繼發(fā)現(xiàn)一氧化氮和一氧化碳之后研究者發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信號分子[2]。近年來，該分子在哺乳動物各系統(tǒng)中的生理、病理調(diào)節(jié)作用受到人們重視。大量研究表明，血清H2S水平降低可能與腦梗死臨床病情嚴(yán)重性及腦動脈血管病變程度相關(guān)[3-4]。突觸是神經(jīng)元之間傳遞信息的重要結(jié)構(gòu)，海馬不同區(qū)域的功能不盡相同，其中CA3區(qū)在學(xué)習(xí)記憶中起重要作用[5]。本研究擬評價H2S對老齡急性腦梗死大鼠海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠(青島大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供)75只，月齡18～20個月，體重500～700 g，采用隨機(jī)數(shù)字表分為4組：對照組(C組)、模型組(M組)、NaHS 組(N組)和生理鹽水組(S組)，每組15只。參照文獻(xiàn)[6]采用線栓法致大鼠大腦中動脈阻塞致急性腦梗死模型。N組于制作模型前25 min，給予大鼠腹腔注射H2S外源性供體NaHS(28 μmol/kg)；S組于制作模型前25 min，給予大鼠腹腔注射等量的生理鹽水；C組不行任何處理。

1.2 方法 采用Morris水迷宮進(jìn)行測試：制作模型前1 d，大鼠自由游泳2 min以適應(yīng)環(huán)境，剔除有明顯運動障礙的大鼠。于急性腦梗死后第1天進(jìn)行觀察，連續(xù)5 d，每天上午進(jìn)行實驗。分別從4個象限的池壁中點將大鼠面向池壁放入池中，記錄其在120 s內(nèi)尋找到平臺的時間即為逃避潛伏期，取4個象限的時間平均值及穿越平臺次數(shù)作為當(dāng)日學(xué)習(xí)記憶成績。若大鼠在120 s內(nèi)不能上臺，引導(dǎo)其登上平臺并停留30 s，此時逃避潛伏期記為120 s。最后一次獲得性訓(xùn)練結(jié)束后的第1天，撤除平臺，將動物由原先平臺象限面向池壁放入水中，記錄大鼠在120 s內(nèi)穿越原先平臺所在位置的次數(shù)，以此作為空間記憶的檢測指標(biāo)。

分別于制作模型后1、3、5 d(T1～T3)時，每組隨機(jī)取5只大鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉下，開胸，暴露心臟，經(jīng)升主動脈依次灌注4%多聚甲醛和生理鹽水，取右側(cè)海馬組織，置于2.5%戊二醛中固定，4 ℃過夜。用振動切片機(jī)垂直于海馬長軸平斷面切片，參照鼠腦標(biāo)本邊緣系統(tǒng)解剖圖切取海馬CA3區(qū)組織。1%鋨酸固定1 h，常規(guī)乙醇、丙酮脫水、透明，Epon 812包埋，LKB超薄切片機(jī)制備厚度約70 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色。取40 000倍放大倍數(shù)，每張切片隨機(jī)選5個視野。采用H-7500型透射電鏡(Hitachi公司，日本)觀察，采用多點平均法測量突觸間隙寬度；參照文獻(xiàn)[7]的方法，用游標(biāo)卡尺測量突觸后膜致密物(PSD)厚度和突觸活性區(qū)長度；參照文獻(xiàn)[8]的方法測量突觸界面曲率，即突觸界面弧長與弦長之比。

2 結(jié)果

與C組比較，M組、N組和S組大鼠急性腦梗死后各天逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)；與M組比較，N組急性腦梗死后各天逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多(P<0.05)；與N組比較，S組急性腦梗死后各天逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少(P<0.05)；M組和S組逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與第1天比較，M組、N組和S組第2～5天逃避潛伏期縮短(P<0.05)，見表1。

與C組比較，M組、N組和S組T1～T3海馬CA3區(qū)突觸數(shù)減少，間隙增寬，突觸后膜致密物厚度變薄，突觸活性區(qū)長度縮短，突觸界面曲率減小(P<0.05)；與M組比較，N組T1～T3海馬CA3區(qū)突觸數(shù)增加，間隙變窄，突觸后膜致密物厚度變厚，突觸活性區(qū)長度延長，突觸界面曲率增大(P<0.05)；與N組比較，S組T1～T3海馬CA3區(qū)突觸數(shù)減少，間隙增寬，突觸后膜致密物厚度變薄，突觸活性區(qū)長度縮短，突觸界面曲率減小(P<0.05)；但M組和S組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。超微結(jié)構(gòu)見圖1。

表1 四組大鼠各時點逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)的比較(n=5)

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05；△與N組比較，P<0.05；▲與第1天比較，P<0.05

表2 四組大鼠術(shù)后各時點海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較(n=5)

注：*與C組比較，P<0.05；#與M組比較，P<0.05

3 討論

急性腦梗死是老年人的常見病、多發(fā)病，隨著醫(yī)療水平的提高，其病死率雖不斷下降,但致殘率卻高達(dá)70%～80%。有研究顯示，腦梗死不但能導(dǎo)致患者運動功能障礙，還可導(dǎo)致患者認(rèn)知功能障礙等[9-10]。在歐美等發(fā)達(dá)國家，急性腦梗死已成為繼心血管病、腫瘤和腦血管病之后老年人病死的主要原因，嚴(yán)重影響了患者的身心健康和生活質(zhì)量，因而如何積極治療急性腦梗死后認(rèn)知功能障礙是近年來研究的熱點。

參照文獻(xiàn)[11]選擇腹腔注射NaHS(28 μmol/kg)。Morris水迷宮實驗通過定位航線試驗測量大鼠獲取學(xué)習(xí)能力，以潛伏期表示；通過空間搜索試驗，測量大鼠保存記憶的能力，以跨越原平臺次數(shù)及平臺象限游泳距離表示[12]。本研究結(jié)果表明，與C組比較，M組逃避潛伏期延長，穿越平臺次數(shù)減少；與M組比較，N組逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數(shù)增多，提示H2S可改善老齡急性腦梗死大鼠認(rèn)知功能障礙。

海馬屬邊緣系統(tǒng)，在進(jìn)化上是腦的古老部分。經(jīng)典的海馬結(jié)構(gòu)包括海馬本體、齒狀回、下托和內(nèi)嗅皮質(zhì)4個部分。海馬是哺乳類動物學(xué)習(xí)記憶的重要結(jié)構(gòu)區(qū)，其結(jié)構(gòu)和功能具有明顯的可塑性，因此常作為學(xué)習(xí)記憶的研究對象。研究表明，學(xué)習(xí)記憶障礙可引起海馬CA3區(qū)突觸間隙增大[13]。因此，本研究選擇觀察海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)變化。

圖1 四組大鼠術(shù)后T1～T3海馬CA3區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu)(電鏡，×40 000)

突觸是神經(jīng)元與神經(jīng)元之間以及神經(jīng)元與效應(yīng)細(xì)胞之間相互聯(lián)系和信息傳遞的結(jié)構(gòu)，是神經(jīng)系統(tǒng)可塑性變化最敏感的部位。突觸間隙是一個神經(jīng)元與另一個神經(jīng)元信息傳遞的部位，其寬度與形狀對突觸活動的動力學(xué)有重要影響。突觸間隙內(nèi)含有大量神經(jīng)遞質(zhì)的降解酶，突觸間隙越寬，神經(jīng)遞質(zhì)傳導(dǎo)所需的時間越長，在傳導(dǎo)過程中被降解的量越多，造成釋放至突觸間隙內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)大量流失，突觸傳遞有效性明顯降低。PSD是位于突觸活性區(qū)突觸后膜下方與胞質(zhì)相連的一層致密物質(zhì)，由細(xì)胞骨架蛋白和與突觸傳遞密切相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白組成，其含有多種蛋白質(zhì)和酶，這些蛋白質(zhì)和酶的構(gòu)象或數(shù)量的變化都可引起PSD超微結(jié)構(gòu)的變化，即厚度的改變，其厚度與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)。突觸活性區(qū)長度即PSD的長度，一定程度上代表了突觸后膜致密物質(zhì)的多少。突觸界面曲率為活性區(qū)弧長與其相對應(yīng)弦長之比，是突觸可塑性的潛在性特征，尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，突觸連接面上所發(fā)生的這種形狀改變與其功能活動有關(guān)。平直型突觸的弧長即是弦長，曲率等于1，而彎曲型突觸的曲率大于1，可能處于更活化的狀態(tài)[14]。

本研究結(jié)果表明，老齡大鼠急性腦梗死后1、3、7 d時，海馬CA3區(qū)突觸數(shù)減少，間隙增寬，突觸后膜致密物厚度變薄，突觸活性區(qū)長度縮短，突觸界面曲率減小，提示急性腦梗死后老齡大鼠海馬CA3區(qū)的突觸結(jié)構(gòu)造成損傷；而N組較M組海馬CA3區(qū)突觸數(shù)增多，間隙減小，突觸后膜致密物厚度增厚，突觸活性區(qū)長度延長，突觸界面曲率增大，提示H2S可減輕急性腦梗死后老齡大鼠海馬CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)造成的損傷，其機(jī)制可能是H2S激活NMDA受體，避免誘發(fā)神經(jīng)元凋亡，對神經(jīng)發(fā)生和突觸構(gòu)建產(chǎn)生增強(qiáng)作用，導(dǎo)致突觸素表達(dá)上升，此外，還可激活cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的激活，使得突觸素基因的表達(dá)持續(xù)上調(diào)[15]。

綜上所述，H2S可改善老齡急性腦梗死大鼠認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與海馬組織CA3區(qū)突觸結(jié)構(gòu)改變有關(guān)，本研究結(jié)果不僅為探討H2S改善認(rèn)知功能的機(jī)制補(bǔ)充了新內(nèi)容，也為臨床上急性腦梗死后認(rèn)知功能障礙的治療提供了新思路。

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Effect of hydrogen sulfide on synaptic structure in hippocampal CA3 area in aged rats with acute cerebral infarction

GUO Dan-dan,ZHANG Yi-jie*,LIU Zhi-cheng,CHANG Guo-jiang,LIN Jun,TIAN Miao-miao,SONG Xiao-li

(Department of Neurology,Xiangshan County Red Cross Taiwan Compatriot Hospital,Ningbo 315731,China)

Objective To investigate the effect of hydrogen sulfide on synaptic structure in hippocampal CA3 area in aged rats with acute cerebral infarction.Methods 60 healthy,male SD rats aged 18～20 months,weighing 500～700 g,were randomly divided into 4 groups:control group(group C,n=15),model group(group M,n=15),NaHS group(group N,n=15)and saline group(group S,n=15).NaHS(28 μmol/kg)was given by intraperitoneal injection at 25 min before making the model in group N,and the same amount of saline was given in group S.No process was given in group C.The model of acute cerebral infarction was made by middle cerebral artery occlusion with suture-occluded method in rats.The escape latency and frequency of rats crossing the original platform were recorded by morris water maze.5 rats were chose from each group at 1,3,5 d(T1～T3)after operation and sacrificed,and the hippocampal CA3 area was isolated for examination with electron microscope,the synaptic structure in hippocampal CA3 area was measured.Results Compared with group C,the escape latency was significantly prolonged,the frequency of crossing the original platform and the number of synapses decreased,the width of synaptic cleft increased,the thickness of the postsynaptic density decreased,the length of active zones was significantly shortened,and the curvature of the synaptic interface decreased at T1～T3in group M,group N and group S(P<0.05).Compared with group M,the escape latency was significantly shorten,the frequency of crossing the original platform and the number of synapses increased,the width of synaptic cleft decreased,the thickness of the postsynaptic density increased,the length of active zones was significantly prolonged,and the curvature of the synaptic interface increased at T1～T3in group N.Compared with group N,the escape latency was significantly prolonged,the frequency of crossing the original platform and the number of synapses decreased,the width of synaptic cleft increased,the thickness of the postsynaptic density decreased,the length of active zones was significantly shortened,and the curvature of the synaptic interface decreased at T1～T3in group S(P<0.05).Conclusion Hydrogen sulfide can improve cognitive function in aged rats with acute cerebral infarction,and the mechanism may be associated with the changes of synaptic structure in hippocampal CA3 area.

Hydrogen sulfide;Cognitive function;Acute cerebral infarction;Hippocampus;Synapses

2014-03-02

象山紅十字臺胞醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，寧波 315731

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201504003