王娟娟，包永波，王素芳1，，林志華*

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211；2.浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江寧波 315211；3.浙江萬(wàn)里學(xué)院浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315100）

泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解多肽抗菌活性及其機(jī)理研究

王娟娟1，2，包永波3，王素芳1，3，林志華3*

（1.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211；2.浙江海洋高效健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江寧波 315211；3.浙江萬(wàn)里學(xué)院浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江寧波 315100）

采用凝膠層析技術(shù)從泥蚶血細(xì)胞裂解物中純化得到兩種血紅蛋白Tg-HbⅡ（異源四聚體）和Tg-HbⅠ（同源二聚體），回收率分別為48.15%和24.91%。胰蛋白酶酶解Tg-HbⅡ，酶解液經(jīng)反相C-18色譜柱分離純化得7種血紅蛋白源多肽F1～F7。通過瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)酶解多肽抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7種多肽對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、惡臭假單胞菌、枯草芽孢桿菌和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌均無(wú)抑菌作用，但多肽F2～F7對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌具有明顯抗菌活性，且多肽F2～F7對(duì)副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌的MIC值在0.012～0.200 mg／m L范圍內(nèi)。熒光顯微鏡觀察酶解多肽殺菌效果發(fā)現(xiàn)多肽殺菌迅速，5 min內(nèi)弧菌細(xì)胞幾乎全部死亡。利用透射電子顯微鏡觀察正常的和經(jīng)抗菌肽處理后的溶藻弧菌和哈維氏弧菌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，對(duì)照組正常細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整，而經(jīng)抗菌肽處理過的細(xì)胞其細(xì)胞壁完整，但因缺乏細(xì)胞內(nèi)容物支持導(dǎo)致局部區(qū)域內(nèi)陷，細(xì)胞質(zhì)膜明顯收縮，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)外流形成許多空泡從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究結(jié)果表明血紅蛋白源抗菌肽對(duì)泥蚶致病菌弧菌有明顯的抗菌活性，其通過破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)而起到殺菌作用，這些發(fā)現(xiàn)為血紅蛋白抗菌機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。

泥蚶；酶解多肽；反相高效液相色譜；抗菌活性；超微結(jié)構(gòu)；抗菌機(jī)理

1 引言

抗菌肽（antibacterial peptides，AMP）是一類具有抗菌活性的小分子蛋白質(zhì)物質(zhì)［1］，廣泛地分布在各類生物體內(nèi)，是無(wú)脊椎動(dòng)物、脊椎動(dòng)物和植物等生物非特異性免疫的關(guān)鍵因子［2］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，不僅從生物體內(nèi)提取的某些多肽具有生物活性，蛋白質(zhì)經(jīng)酶解處理后也會(huì)產(chǎn)生具有特殊功能的活性肽［3］，Estelle等研究發(fā)現(xiàn)，牛血紅蛋白經(jīng)酶解作用產(chǎn)生的某些肽段具有抗菌作用，而且肽段不同抗菌特性和活力也不同［4］。趙玲等通過瓊脂擴(kuò)散抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)南極磷蝦酶解產(chǎn)生的多肽對(duì)金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抑菌活性［5］?？咕囊蚓哂锌咕V廣泛、快速查殺靶細(xì)胞、熱穩(wěn)定性好，特別是對(duì)靶菌株不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢(shì)，被認(rèn)為是未來(lái)取代抗生素的上佳選擇［6］。

泥蚶（Tegillarcagranosa），隸屬于軟體動(dòng)物門（Mollusca），瓣鰓綱（Lamellibranchia），是我國(guó)傳統(tǒng)養(yǎng)殖貝類之一。因其體內(nèi)富含特有的血紅蛋白，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們的喜愛。近年來(lái)，海洋污染日益加劇，致使泥蚶在養(yǎng)殖過程中經(jīng)常受到病原菌感染而造成大面積死亡［7］。由于泥蚶不具有特異性免疫系統(tǒng)，只能依靠體液因子和血細(xì)胞的非特異性免疫系統(tǒng)來(lái)抵御生活環(huán)境中病原微生物的侵襲。王素芳等［8］研究發(fā)現(xiàn)泥蚶血紅蛋白通過其過氧化物酶活性產(chǎn)生ROS，從而起到對(duì)部分革蘭氏陰性菌大腸桿菌和惡臭假單胞菌的抑菌作用，但對(duì)貝類致病菌弧菌卻沒有抗菌活性；Xu等［9］研究表明毛蚶血紅蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯的抗菌活性。本研究試圖從血紅蛋白源抗菌肽這一可能的機(jī)制入手，來(lái)分析泥蚶血紅蛋白酶解多肽是否具有抗菌活性，為血紅蛋白抗菌機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。另外，泥蚶血紅蛋白酶解多肽抗菌作用的研究幾乎沒有報(bào)道，因此進(jìn)行泥蚶血紅蛋白酶解多肽抗菌活性及其殺菌機(jī)理的研究對(duì)深入認(rèn)識(shí)泥蚶自身免疫反應(yīng)具有重要意義。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用泥蚶材料取自于寧波市鄞州區(qū)丹艷養(yǎng)殖基地。溶藻弧菌（Vibrioalginolyticus）、哈維氏弧菌（V.harveyi）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、惡臭假單胞桿菌（Pseudomonasputida）、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌（Bacillus firmus）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）和大腸桿菌（Eschetichiacoli）為浙江萬(wàn)里學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。胰蛋白酶為Promega公司產(chǎn)品，乙腈（ACN）和三氟乙酸（TFA）為質(zhì)譜純，純凈水為杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司生產(chǎn)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2 主要儀器

均質(zhì)機(jī)（SH-2A，IKA公司），紫外分光光度計(jì)（3300 pro，美國(guó)Amershaw），凝膠排阻色譜柱SephacryS-100HR（HiPrep26／60，GE公司），AKTA蛋白層析系統(tǒng)（pure 150，GE公司），反相C-18色譜柱（YMC-Pack-ODS-A250×10 mm，日本YMC），恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9162，上?；厶﹥x器制造有限公司），搖床（HZ-9211KB，江蘇同君儀器科技有限公司），Nano Vue plus超微量紫外分光光度計(jì)（GE公司），Triple TOF 5600高分辨液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)（AB SCIEX公司），熒光顯微鏡（Nikon ECLIPSE 80i，尼康公司），透射電子顯微鏡（H-7650，HITACHI日立公司）。

2.3 泥蚶血紅蛋白的分離純化

將采集于養(yǎng)殖池塘的活體泥蚶洗凈后，置于海水晶配制的海水中吐泥沙5 h。撬開貝殼后，用針筒采集血液，裝在含有抗凝劑的10 m L離心管中，1 500 r／min轉(zhuǎn)速4℃冷凍離心10 min，血細(xì)胞沉淀，除去上層清液。用0.9%的NaCl溶液多次漂洗血細(xì)胞直至上層溶液無(wú)色澄清，血細(xì)胞加適量磷酸鹽緩沖液后進(jìn)行勻漿破碎，最后以12 000 r／min高速低溫離心30 min除去細(xì)胞碎片，上清為血紅蛋白粗產(chǎn)品。將獲得的血紅蛋白粗產(chǎn)品過Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱，用p H為7.2磷酸鹽緩沖液以0.2 m L／min的流速洗脫，1 m L／管收集洗脫液，280 nm和415 nm波長(zhǎng)檢測(cè)洗脫液。

2.4 泥蚶血紅蛋白濃度測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行泥蚶血紅蛋白濃度的測(cè)定［10］。用50 mmol／L PBS對(duì)標(biāo)準(zhǔn)濃度為1.4 mg／mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液進(jìn)行梯度稀釋，配制成濃度分別為0.2、0.4、0.6和0.8 mg／mL的BSA標(biāo)準(zhǔn)液。取上述BSA標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)的泥蚶血紅蛋白樣品各10 u L，分別與1 m L考馬斯亮藍(lán)G250染液充分混勻，在室溫下靜置反應(yīng)5 min后，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)各混合物在595 nm波長(zhǎng)處的吸光度（蛋白質(zhì)－色素結(jié)合物在595 nm有最大光吸收）。以BSA各濃度梯度為橫坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的A595值為縱坐標(biāo)，繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品在595 nm波長(zhǎng)處的吸光值以及標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式計(jì)算泥蚶血紅蛋白濃度（mg／mL）。

2.5 泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解

經(jīng)Sephacryl S-100 HR凝膠層析柱過濾后收集的Tg-HbⅡ，按胰蛋白酶：HBII為1∶20于50 mmol／L NH4HCO3（p H7.6）中恒溫在37℃水浴中反應(yīng)4 h。吸取酶解液于超濾離心管（3 kDa），超速離心30 min以除去多余的胰蛋白酶，終止酶切反應(yīng)。將濾出液收集到空離心管中，在35℃下真空干燥濃縮60 min以除去NH4HCO3，繼續(xù)干燥濃縮至樣品量到含少量液體，此樣品為HbⅡ酶解液。

2.6 HbⅡ酶解液分離純化

采用反相高效液相色譜法進(jìn)行分離。酶解液過反相C-18色譜柱，用A液（0.1%三氟乙酸）和B液（0.1%三氟乙酸和60%乙腈），以3 mL／min流速0%～100%B液梯度洗脫20 min，1 m L／管收集洗脫液，用220 nm波長(zhǎng)檢測(cè)洗脫液。

2.7 瓊脂擴(kuò)散法測(cè)抑菌活性

培養(yǎng)細(xì)菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用無(wú)菌生理鹽水配制成105cfu／m L的菌懸液，取200μL菌懸液均勻涂布于配制好的固體培養(yǎng)基上，放置好牛津杯后，依次加入200μL多肽F1（0.048 mg／mL）、F2（0.083 mg／mL）、F3（0.077 mg／m L）、F4（1.404 mg／m L）、F5（0.123 mg／mL）、F6（1.096 mg／mL）、F7（0.238 mg／mL）多肽洗脫液。大腸桿菌、不動(dòng)桿菌、惡臭假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌則置28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，取出后拔去牛津杯觀察并拍照保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性，每種待測(cè)菌種各做3次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)。

2.8 最低抑菌濃度（MIC）測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法。超凈工作臺(tái)內(nèi)無(wú)菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的多肽分別加到滅菌過的96孔板中，第1至第11孔加多肽，每孔100μL，第12孔不加多肽作為生長(zhǎng)對(duì)照。采用生長(zhǎng)法制備濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，用MH肉湯按1∶1 000比例稀釋后，向每孔中加100μL菌懸液，密封后將弧菌置于28℃，其他菌則置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育12 h后觀察判斷最低抑菌濃度。為確保實(shí)驗(yàn)科學(xué)性，酶解多肽F2～F7洗脫液對(duì)每種試驗(yàn)菌各做3次獨(dú)立平行實(shí)驗(yàn)，將3次試驗(yàn)結(jié)果平均值作為多肽對(duì)待測(cè)菌的最低抑菌濃度。

2.9 熒光顯微法觀察殺菌效果

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的弧菌用無(wú)菌生理鹽水配制成105cfu／m L菌懸液，取10μL菌液與10μL多肽F4洗脫液混勻作用5 min，對(duì)照組為加10μL 50 mmol／L PBS與10μL菌液混勻作用5 min，5 000 r／min轉(zhuǎn)速離心5 min使菌體沉淀，用PBS漂洗3次以除去多肽，最后加10μL生理鹽水懸浮菌體，用LIVE／DEAD核酸熒光染料試劑盒染色后，取1μL菌液于載玻片上，蓋上蓋玻片后用熒光顯微鏡觀察活菌數(shù)量。

2.10 透射電鏡觀察抗菌肽對(duì)溶藻弧菌超微結(jié)構(gòu)的影響

培養(yǎng)弧菌至其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，5 000 r／min轉(zhuǎn)速離心5 min使菌體沉淀，用0.1 mol／m L p H 7.2磷酸鹽緩沖液稀釋為1×105cfu／m L。取2份1 m L弧菌菌液，其中一份加入200μL多肽F4洗脫液，另一份加200μL 50 mmol／L PBS做為對(duì)照組，28℃培養(yǎng)2 h后，將菌液5 000 r／min轉(zhuǎn)速離心5 min，沉淀的菌體。2.5%戊二醛4℃固定24 h，經(jīng)1%四氧化鋨固定1 h，經(jīng)50 mmol／L磷酸緩沖液漂洗，酒精梯度脫水，包埋、切片、染色后用透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2.11 多肽質(zhì)譜鑒定

通過抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多肽F2～F7對(duì)溶藻弧菌、哈維氏弧菌和副溶血弧菌均具有明顯抗菌活性，進(jìn)一步分析其氨基酸序列組成。將上述具有抑菌活性的多肽F2～F7采用MALDI-TOF-MS做質(zhì)譜檢測(cè)分析，將得到的數(shù)據(jù)用Proteinpilot軟件檢索比對(duì)，得到抗菌肽氨基酸序列。

3 結(jié)果與分析

3.1 泥蚶血紅蛋白異源四聚體及其酶解多肽的分離純化

泥蚶血紅蛋白粗產(chǎn)品經(jīng)凝膠過濾柱洗脫后，洗脫圖譜如下圖1所示。已有文獻(xiàn)報(bào)道［8，10］，根據(jù)280 nm和415 nm（蛋白質(zhì)在280 nm波長(zhǎng)附近特征性吸收峰，而Tg-Hb在415 nm波長(zhǎng)處有獨(dú)特的吸收峰），兩種波長(zhǎng)下的檢測(cè)圖譜，判斷峰1為雜蛋白，峰2為異源四聚體（HbⅡ），峰3為同源二聚體（HbⅠ），其中，Tg-HbⅡ的回收率為48.15%，Tg-HbⅠ的回收率為24.91%（見表1）。

圖1 泥蚶血紅蛋白的凝膠層析圖Fig.1 Gel chromatography of Tg-Hb

利用反相C-18色譜柱對(duì)Tg-HbⅡ酶解多肽梯度洗脫，用乙腈－水（60∶40，體積比）作為流動(dòng)相，以3 m L／min流速0%～100%B液梯度洗脫20 min，用220 nm波長(zhǎng)檢測(cè)洗脫液［4］。洗脫圖譜見圖2。圖譜中有7個(gè)主要峰，其保留時(shí)間適中，各峰能夠達(dá)到較好的基線分離且峰形較好，代表了7種純凈多肽，分別以1 m L／管收集洗脫液備用。

表1 泥蚶血紅蛋白的回收率Tab.1 Recovery of Tg-HbⅡfrom the blood of Tegillarca granosa

圖2 泥蚶Tg-HbⅡ酶解多肽的反相C-18色譜圖Fig.2 Reverse phase C-18 of peptides from enzymolysis Tg-HbⅡ

3.2 Tg-HbⅡ酶解多肽的抗菌活性

采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)了7種多肽對(duì)5種革蘭氏陰性菌即大腸桿菌、惡臭假單胞菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌以及3種革蘭氏陽(yáng)性菌即金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌的抗菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，多肽F2～F7對(duì)3種海洋性弧菌哈維氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌均有明顯抗菌效果而未檢測(cè)到對(duì)其他幾種菌有抑菌圈，而F1對(duì)所有試驗(yàn)菌均無(wú)抑菌活性（圖3），F(xiàn)2對(duì)溶藻弧菌、副溶血弧菌和哈維氏弧菌的MIC分別為0.012 mg／mL，0.012 mg／m L和0.024 mg／m L，F(xiàn)3對(duì)3種菌均為0.020 mg／mL，F(xiàn)4分別為0.200 mg／m L，0.100 mg／mL和0.200 mg／mL，F(xiàn)5對(duì)3種菌均為0.019 mg／m L，F(xiàn)6分別為0.075 mg／m L，0.075 mg／m L和0.150 mg／mL，F(xiàn)7分別為0.096 mg／m L，0.190 mg／m L和0.096 mg／mL（表3），從中可以發(fā)現(xiàn)幾種多肽抗菌作用具有選擇性且活性差別較大。

3.3 熒光顯微鏡觀察Tg-HbⅡ酶解多肽殺菌作用

圖3 多肽對(duì)溶藻弧菌的抑菌環(huán)Fig.3 Antibacterial circles of peptides toV.alginolyticus

表2 泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解多肽對(duì)8種菌的抗菌活性Tab.2 Antimicrobial activities of peptides against 8 kinds of bacterias

表3 泥蚶Tg-HbⅡ酶解多肽序列及最低抑菌濃度Tab.3 Sequences and the minimal inhibitory concentrations of all peptide fractions obtained from Tg-HbⅡhydrolysate

熒光顯微鏡觀察顯示，利用LIVE／DEAD熒光核酸染料染溶藻弧菌細(xì)胞核酸，該染料中含Calcein-AM和EthD-1兩種染料。Calcein-AM分子能透過細(xì)胞質(zhì)膜，可在各種酯酶的作用下，轉(zhuǎn)化為很強(qiáng)的綠色熒光物質(zhì)，并且保留在胞內(nèi)無(wú)法擴(kuò)散出完整的膜結(jié)構(gòu)，使活細(xì)胞經(jīng)染色后顯示綠色熒光；EthD-1則是一種膜不通透的染料，能進(jìn)入破損的細(xì)胞質(zhì)膜和核膜，死細(xì)胞因通透性增加經(jīng)染色后顯示紅色熒光。如圖4所示，A為50 mmol／L PBS處理溶藻弧菌作為對(duì)照組，熒光明亮且細(xì)胞分布均勻，死細(xì)胞較少或幾乎不含死細(xì)胞；B為經(jīng)多肽F1處理，多肽F1無(wú)抑菌活性，其結(jié)果與正常對(duì)照組一樣顯示明亮綠色熒光，且活細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相當(dāng)；但弧菌經(jīng)多肽F2～F7作用5 min后（C-H），綠色熒光明顯淬滅，且死細(xì)胞也未發(fā)出紅色熒光，表明細(xì)胞經(jīng)抗菌肽作用后，弧菌細(xì)胞通透性屏障受損，其核心遭到破壞。

圖4 溶藻弧菌的熒光顯微觀察圖Fig.4 Fluorescence microscopic observation ofV.alginolyticus

圖5 正常哈維氏弧菌和抗菌肽處理的哈維氏弧菌透射電鏡圖Fig.5 Transmission electron microscopes ofV.harveyi

3.4 透射電鏡觀察觀察抗菌肽對(duì)弧菌的作用

圖6 正常溶藻弧菌和抗菌肽F4處理的溶藻弧菌透射電鏡圖Fig.6 Transmission electron microscopes ofV.alginolyticusand treated with antimicrobial peptide F4

通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)抗菌肽破壞了細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，利用電鏡進(jìn)一步觀察經(jīng)抗菌肽處理后的弧菌細(xì)胞內(nèi)部受損情況。如圖5和圖6所示，兩圖中A和B是未經(jīng)抗菌肽處理的弧菌細(xì)胞，其結(jié)構(gòu)完整，表面光滑，細(xì)胞壁層次分明、清晰可見。C～F是經(jīng)抗菌肽作用30 min的弧菌細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)膜收縮（圖6C），溶藻弧菌細(xì)胞因內(nèi)容物外泄形成許多大小不一的空泡（圖6D），弧菌死亡細(xì)胞的細(xì)胞壁依然完整，只是局部區(qū)域凹陷（圖6C，D）。通過電鏡觀察溶藻弧菌和哈維氏弧菌兩種弧菌，證實(shí)了抗菌肽作用使弧菌細(xì)胞內(nèi)容物泄漏，是導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要原因。

4 討論

4.1 泥蚶血紅蛋白的分離純化

開展Tg-HbⅡ酶解多肽免疫學(xué)研究的前提是得到高純度的Tg-HbⅡ，王素芳等在泥蚶血紅蛋白的制備及其抗菌活性研究中，通過質(zhì)譜檢測(cè)確定泥蚶血紅蛋白含有同源二聚體和異源四聚體兩種形式，并采用凝膠過濾方法分離純化得到高純度Tg-HbⅡ和Tg-HbⅠ［8］。Bao等已經(jīng)成功克隆Tg-Hb 3個(gè)亞基的基因Tg-HbⅡA、Tg-HbⅡB和Tg-HbⅠ，并用相關(guān)軟件預(yù)測(cè)其分子量分別為16.23 kDa，17.23 k Da和16.04 kDa，等電點(diǎn)分別為5.745，8.836和9.144，因此推測(cè)Tg-HbⅡ和Tg-HbⅠ的分子量分別約為67 k Da和32 k Da［11］。Tg-HbⅡ、Tg-HbⅠ和雜蛋白分子量存在較大差異，利用凝膠層析技術(shù)能較好地將雜蛋白和血紅蛋白分開，同時(shí)兩種血紅蛋白在凝膠層析所用磷酸鹽緩沖液中的穩(wěn)定性也比較好。本研究采用280 nm和415 nm兩種波長(zhǎng)檢測(cè)Tg-Hb洗脫峰，能夠較好地快速判定Tg-Hb出峰情況。

4.2 泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解多肽的分離純化

反相高效液相色譜（reverse-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）是目前分離純化多肽物質(zhì)的主要手段之一，其在多肽分離純化中運(yùn)用十分廣泛［12］。在RP-HPLC流動(dòng)相中，水有較高的比重，因此能較好地與多肽水溶性的生物學(xué)性質(zhì)相適應(yīng)，盡管其流動(dòng)相中的乙腈等有機(jī)溶劑、三氟乙酸以及固定相均有可能使多肽的天然構(gòu)象發(fā)生改變，但一旦去除這些因素后，一般多肽構(gòu)象能夠恢復(fù)原狀而保持其特有的生物學(xué)活性，采用RP-HPLC技術(shù)純化多肽回收率可達(dá)80%以上［12］。楊化新等利用RPHPLC技術(shù)，通過C-18色譜柱成功檢測(cè)了重組人生長(zhǎng)激素的肽片段［13］。本研究中Tg-HbⅡ經(jīng)胰蛋白酶酶解后，獲得較小分子量多肽片段。應(yīng)用RP-HPLC技術(shù)成功分離純化得到7種主要肽段，分子量在1～4 k Da范圍內(nèi)，去除洗脫液中的有機(jī)溶劑以后，多肽保持較好的活性。

4.3 泥蚶血紅蛋白酶解多肽的抗菌活性

抗菌肽研究的興起是從20世紀(jì)80年代初開始的，1980年由Boman等［14］從天蠶蛹中發(fā)現(xiàn)第一種抗菌肽天蠶素，并于次年測(cè)得了其氨基酸序列。此后，科學(xué)家們從各生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并提取了上千種抗菌肽，加上酶解及合成的抗菌肽，已構(gòu)成龐大的抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)。雖然抗菌肽眾多，但其結(jié)構(gòu)具有一些共同之處，大多數(shù)抗菌肽具有強(qiáng)堿性，C端富含丙氨酸、亮氨酸等非極性氨基酸，N端精氨酸和賴氨酸等極性氨基酸較豐富［15］。Daoud等［16］研究發(fā)現(xiàn)牛血紅蛋白經(jīng)酶解后的某些肽段對(duì)無(wú)害利斯特菌、藤黃微球菌、大腸桿菌、及腸炎沙門氏菌有較強(qiáng)抗菌活性，這些肽段與抗菌肽具有類似的特點(diǎn)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，生物體在特殊條件下會(huì)自身水解某類蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有活性的肽段。Lee［17］等研究發(fā)現(xiàn)淡水小龍蝦在酸性條件下會(huì)水解其血藍(lán)蛋白的羧基末端產(chǎn)生活性肽astacidin1。本研究采用胰蛋白酶酶解泥蚶血紅蛋白異源四聚體，使其酶解產(chǎn)生的肽段末端為L(zhǎng)ys或Arg，符合抗菌肽特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)酶解產(chǎn)生的大部分多肽對(duì)哈維氏弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌海洋性弧菌具有明顯的抑菌活性。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽主要有三類殺菌機(jī)制：第一類主要作用于細(xì)胞質(zhì)膜，增加細(xì)胞質(zhì)膜通透性，致使胞內(nèi)物質(zhì)外流而死亡；第二類主要是抗菌肽作用于宿主細(xì)胞后，激活了機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)；第三類是抗菌肽通過抑制細(xì)胞呼吸或抑制細(xì)胞某些細(xì)胞器功能從而起到抑菌效果［18］。Viljanen等［19］發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)抗菌肽可以使細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜通透性增加，致使Trion X-100等物質(zhì)更易進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部。Uyterhoeven等［20］發(fā)現(xiàn)抗菌肽buforinⅡ進(jìn)入細(xì)胞后與核酸（RNA／DNA）緊密結(jié)合，抑制了基因復(fù)制和表達(dá)，從而起到殺菌作用。正常細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜上的微孔僅容許1 nm以下的小分子物質(zhì)通過［21］。利用透射電子顯微鏡觀察經(jīng)抗菌肽作用后的哈維氏弧菌和溶藻弧菌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)抗菌肽處理后的弧菌細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)膜通透性增加，胞內(nèi)物質(zhì)外流導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p壞只剩細(xì)胞壁空架，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，屬于抗菌肽第一類殺菌機(jī)制。

本研究用胰蛋白酶酶解Tg-HbⅡ使之產(chǎn)生以賴氨酸或精氨酸為末端的肽段，發(fā)現(xiàn)大部分酶解肽段對(duì)副溶血弧菌、哈維氏弧菌和溶藻弧菌等海洋性弧菌具有抗菌作用，而對(duì)大腸桿菌、惡臭假單胞菌、金黃色葡萄球菌、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等一般性陸生菌則無(wú)抑菌活性，說(shuō)明酶解產(chǎn)生肽段的抗菌作用具有選擇性。猜測(cè)很可能與泥蚶生活習(xí)性相關(guān)，因泥蚶是一種埋棲于沿海灘涂的雙殼貝類，難免受到常見海洋性弧菌如副溶血弧菌等的威脅，從而進(jìn)化出一套獨(dú)特的免疫系統(tǒng)，其可能只對(duì)海洋性致病菌具有殺菌作用，而對(duì)一般陸生菌則無(wú)抗菌活性。但為什么酶解多肽的抗菌作用有選擇性，這需要進(jìn)一步深入研究。同時(shí)，通過熒光顯微鏡和電鏡觀察其抗菌機(jī)理，證實(shí)了抗菌肽通過增加細(xì)胞質(zhì)膜通透性使胞內(nèi)物質(zhì)外流而起到殺菌作用。這些發(fā)現(xiàn)，為泥蚶血紅蛋白抗菌機(jī)制研究提供了一個(gè)新方向。

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Antibacterial activity and mechanisms of heterotetramer hemoglobin derived polypeptide from Tegillarca granosa

Wang Juanjuan1，2，Bao Yongbo3，Wang Sufang1，3，Lin Zhihua3

（1.School of Marine Sciences，Ningbo University，Ningbo 315211，China；2.Zhejiang Collaborative Innovation Center of Ocean Efficient Healthy Culture，Ningbo 315211；3.Zhejiang Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resources，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

Tg-HbⅡ（heterogeneous tetramer）and Tg-HbⅠ（homodimer）were purified by gel chromatography with a recovery 48.15%and 24.91%.Seven major peptides（F1－F7）were purified by reverse phase C-18 column from trysin enzymatic hydrolysates of Tg-HbⅡ.The agar diffusion method was used to detect their antibacterial activity.Results showed that all peptide collections exhibited no antibacterial activity toStaphylococcusaureus，Pseudomonasputida，Eschetichiacoli，BacillusfirmusandB.subtilis；but peptides F2－F7 showed antibacterial activity againstVibrioalginolyticus，V.harveyiandV.parahaemolyticus.MICs of peptide F2－F7 towardV.alginolyticus，V.parahaemolyticusandV.harveyiwere 0.012－0.200 mg／m L Using fluorescence microscopy to observe the cell that treated with peptide，found that vibrio cells die rapidly in 5 min.Using Transmission electronmicroscopy to observeV.alginolyticusandV.harveryiafter antibacterial peptides treatment，the results showed that the peptides changed permeability of cytoplasmic membrane，leading to leaking out of cytoplasmic contents.Finally，the affected Vibrio died due to leakage of the cell contents.Research results showed that theTegillarca granosahemoglobin source of antimicrobial peptides have obvious antibacterial activity against vibrio and antimicrobial peptides kill bacteria by damaging its internal structure，these findings laid a solid foundation to the research of antibacterial mechanism of hemoglobin.

Tegillarcagranosa；enzymolysis peptides；RP-HPLC；antibacterial activity；ultrastructure；antibacterial mechanism

S917.4

A

0253-4193（2015）12-0106-10

王娟娟，包永波，王素芳，等.泥蚶血紅蛋白異源四聚體酶解多肽抗菌活性及其機(jī)理研究［J］.海洋學(xué)報(bào)，2015，37（12）：106—115，

10.3969／j.issn.0253-4193.2015.12.011

Wang Juanjuan，Bao Yongbo，Wang Sufang，et al.Antibacterial activity and mechanisms of heterotetramer hemoglobin derived polypeptide fromTegillarcagranosa［J］.Haiyang Xuebao，2015，37（12）：106—115，doi：10.3969／j.issn.0253-4193.2015.12.011

2015-07-20；

2015-09-28。

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2012AA10A410）；浙江省自然科學(xué)重點(diǎn)基金項(xiàng)目（LZ12C190001）；浙江省重中之重學(xué)科開放基金項(xiàng)目（KF2014002）；寧波市自然科學(xué)基金（2015A610258）。

王娟娟（1990—），女，浙江省蘭溪市人，主要從事海洋生物學(xué)研究。E-mail：425107946＠qq.com

*通信作者：林志華，研究員，主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物繁育及遺傳育種。E-mail：zhihua9988＠126.com