蘇效雙，占今舜，詹康，劉明美,2，趙國(guó)琦

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院淮安生物工程分院，江蘇 淮安 223200)

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苜蓿黃酮對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖與抗氧化的影響

蘇效雙1**，占今舜1**，詹康1，劉明美1,2，趙國(guó)琦*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院淮安生物工程分院，江蘇 淮安 223200)

本試驗(yàn)旨在研究不同濃度苜蓿黃酮對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖與抗氧化的影響。試驗(yàn)利用含不同濃度0 μg/mL(對(duì)照組)、25 μg/mL(試驗(yàn)Ⅰ)、50 μg/mL(試驗(yàn)Ⅱ)、75 μg/mL(試驗(yàn)Ⅲ)、100 μg/mL(試驗(yàn)Ⅳ)苜蓿黃酮的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。結(jié)果表明，1)細(xì)胞培養(yǎng)第3天，各組細(xì)胞增殖無顯著差異，但第5天試驗(yàn)Ⅱ～Ⅳ組細(xì)胞增殖能力極顯著高于對(duì)照組和試驗(yàn)I組(P<0.01)。2)試驗(yàn)Ⅱ～Ⅳ組一氧化氮(NO)水平明顯高于對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅰ組，且差異極顯著(P<0.01)。試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅳ組的乳酸脫氫酶(LDH)活性顯著低于對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅲ組，且差異極顯著(P<0.01)，但對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅲ組差異不顯著。3)試驗(yàn)Ⅳ組細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶(CAT)含量極顯著高于其他各組(P<0.01)，而試驗(yàn)Ⅲ組丙二醛(MDA)含量極顯著低于其他各組(P<0.01)；試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組的谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性極顯著高于其他各組(P<0.01)，而各處理組細(xì)胞的超氧化物歧化酶(SOD)含量差異不顯著。4)試驗(yàn)Ⅱ和Ⅲ組細(xì)胞p53、Caspase-3、SOCS3和STAT1基因的相對(duì)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。因此，苜蓿黃酮能夠促進(jìn)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞抗氧化的能力，抑制細(xì)胞凋亡，其中添加濃度為75 μg/mL組效果最好。

苜蓿黃酮；乳腺上皮細(xì)胞；抗氧化；細(xì)胞增殖

紫花苜蓿具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，產(chǎn)量高，適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，紫花苜蓿的莖、葉中含有50多種豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及多種生物活性成分，其營(yíng)養(yǎng)成分比大多數(shù)植物都要豐富,有“牧草之王”的美譽(yù)[1-2]。黃酮(flavonoids)為苜蓿中生物活性成分之一，其在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)畜禽有明顯的提高繁殖力、促進(jìn)生長(zhǎng)、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和雌激素樣的作用[3]；對(duì)人體具有抗病毒、增強(qiáng)心血管功能、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抑菌、延緩衰老的作用[4]。細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是指從活體內(nèi)取出與試驗(yàn)相關(guān)細(xì)胞或組織，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，且建立無菌、適溫和一定營(yíng)養(yǎng)的條件，使細(xì)胞生長(zhǎng)和生存并維持其結(jié)構(gòu)與功能完整性的一種方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于易于提供性狀相似的試驗(yàn)對(duì)象和耗資少，尤其對(duì)于大型經(jīng)濟(jì)動(dòng)物來講比較經(jīng)濟(jì)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[5]。劉春龍等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)的大豆黃酮和染料木素能夠促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞抗氧化水平。陳靜[7]研究發(fā)現(xiàn)，12.5～50.0 μmol/L槲皮素能夠上調(diào)奶牛乳腺上皮細(xì)胞存活率，提高抗氧化和抗凋亡的能力。然而利用細(xì)胞培養(yǎng)的方法來研究苜蓿黃酮對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的影響尚未見報(bào)道，因此，本試驗(yàn)通過添加苜蓿黃酮來探究其對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖與抗氧化的影響，為推廣苜蓿黃酮在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

奶牛乳腺上皮細(xì)胞由本試驗(yàn)室通過組織塊培養(yǎng)法獲得；苜蓿黃酮由陜西綠清生物工程有限公司提供；DMEM/12培養(yǎng)基和胎牛血清購于Gibco公司；MTT和雙抗購于Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO)購于Solarbio公司；RNA提取試劑盒購于天根生化科技有限公司；抗氧化指標(biāo)試劑盒購于南京建成生物有限公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)從2014年10月開始，細(xì)胞培養(yǎng)方法參照Nayeli等[8]的奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)方法。

1.2.2MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖 以密度為0.8×104個(gè)/孔細(xì)胞接種到96孔板，分為5組，每組5個(gè)重復(fù)即對(duì)照組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0 μg/mL)、試驗(yàn)Ⅰ～Ⅳ組(基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加25，50，75和100 μg/mL)，其中苜蓿黃酮用DMSO溶解，對(duì)照組和各試驗(yàn)組中的DMSO含量為2‰，細(xì)胞培養(yǎng)到第3天和第5天分別在每孔中加入20 μL 0.5%MTT，再在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后去除培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗2遍，每孔加入DMSO 150 μL 于搖床混勻10 min，最后在490 nm(酶標(biāo)儀)下測(cè)定OD值。

1.2.3NO與LDH含量的測(cè)定 取密度為5×105個(gè)/孔細(xì)胞接種到12孔板，處理方法同MTT法，培養(yǎng)5 d后，根據(jù)所購買試劑盒中說明書進(jìn)行測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，每組5個(gè)重復(fù)。

1.2.4抗氧化指標(biāo)的測(cè)定 取密度為5×105個(gè)/孔細(xì)胞接種到12孔板，處理方法同MTT法，培養(yǎng)5 d后，根據(jù)所購買試劑盒中說明書測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)，每組5個(gè)重復(fù)。

1.2.5細(xì)胞總RNA的提取和cDNA的合成 取密度為1×106個(gè)/孔細(xì)胞接種到6孔板，處理方法同MTT法，培養(yǎng)5 d后，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行組織總RNA的提取，采用One Drop儀器進(jìn)行總RNA的濃度和純度的測(cè)定。然后采用Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。試驗(yàn)在冰上進(jìn)行，10 μL體系，反應(yīng)條件為37℃，15 min;85℃，5 s;4℃。所得cDNA保存于-20℃待測(cè)。

1.2.6引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Gene Bank中p53、Caspase-3、SOCS3、STAT1基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，引物由Invitrogen公司合成(表1)。

表1 引物設(shè)計(jì)Table 1 Primer design

1.2.7Real Time-PCR 根據(jù)TaKaRa試劑盒說明書進(jìn)行冰上配制反應(yīng)液(表2)，后在羅氏Light Cycler?96 PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件為,第1步預(yù)變性：95℃ 30 s。第2步PCR反應(yīng)：進(jìn)行以下循環(huán)40次：95℃ 5 s，60℃ 20 s。第3步融解曲線分析：65℃ 15 s。

1.3數(shù)據(jù)處理

用Excel對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0單因素方差分析(ANOVA)，LSD法多重比較，P<0.01表示差異極顯著，P<0.05表示差異顯著?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1苜蓿黃酮對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

表2 RT-PCR反應(yīng)液Table 2 The reaction liquid of real-time PCR

從表3可以看出，培養(yǎng)3 d的乳腺細(xì)胞的各組增殖水平差異不顯著，培養(yǎng)5 d的乳腺上皮細(xì)胞試驗(yàn)Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅳ組的增殖水平與對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組差異極顯著(P<0.01)，但對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅰ組差異不顯著。說明高濃度的苜蓿黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖效果明顯，且試驗(yàn)Ⅲ組效果最顯著。

表3 苜蓿黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響Table 3 Effect of alfalfa flavonoids on the growth of dairy cow mammary epithelial cell

注：同行不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note：The different capital letters mean highly significant differences (P<0.01) and the different lowercase letters mean significant differences (P<0.05)，the same below.

表4 苜蓿黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞NO和LDH的影響Table 4 Effect of alfalfa flavonoids on NO and lactate dehydrogenase (LDH) of dairy cow mammary epithelial cell

從表4可以看出，體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞上清中NO水平，試驗(yàn)Ⅱ組、Ⅲ組與Ⅳ組明顯高于對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅰ組，且差異極顯著(P<0.01)。試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅳ組的體外培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞的LDH活性顯著低于對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅲ組，且差異極顯著(P<0.01)，但對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅲ組差異不顯著。乳腺上皮細(xì)胞上清中LDH活性降低說明添加苜蓿黃酮對(duì)保護(hù)細(xì)胞的完整性，防止細(xì)胞破裂死亡發(fā)揮了作用。

2.2苜蓿黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化作用的影響

從表5可以看出，乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)試驗(yàn)Ⅳ組的CAT水平明顯高于對(duì)照組、Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅲ組(P<0.01)。SOD水平5組差異不顯著。試驗(yàn)Ⅱ組與Ⅲ組的GSH-PX活性顯著高于對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組和Ⅳ組(P<0.01)，試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅲ組差異不顯著(P>0.05)。MDA含量Ⅲ組明顯低于對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組與Ⅳ組，且對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅱ組差異不顯著。綜上所述，苜蓿黃酮通過提高CAT、GSH-PX的活性，來提高乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力，且在用量為試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅲ組時(shí)效果比較明顯。

表5 苜蓿黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化作用的影響Table 5 Effect of alfalfa flavonoids on antioxidant status of dairy mammary epithelial cell

2.3基因p53、Caspase-3、SOCS3、STAT1的RT-PCR結(jié)果

從表6可以看出，SOCS3基因的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的0.69，0.48，0.50，0.90倍，試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，且試驗(yàn)Ⅱ組、Ⅲ組顯著低于試驗(yàn)Ⅰ組、Ⅳ組，但試驗(yàn)Ⅱ組與試驗(yàn)Ⅳ組差異不顯著(P>0.01)，說明苜蓿黃酮降低了SOCS3基因的表達(dá)量。STAT1基因的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照組的0.79，0.34，0.83，0.89倍，顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，其中試驗(yàn)Ⅱ組含量顯著低于Ⅰ組、Ⅲ組、Ⅳ組(P<0.01)，說明苜蓿黃酮降低了STAT1基因的表達(dá)量。p53、Caspase-3基因的相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組顯著低于對(duì)照組與試驗(yàn)Ⅰ組，說明苜蓿黃酮降低了p53、Caspase-3基因的表達(dá)量。

表6 奶牛乳腺上皮細(xì)胞p53、Caspase-3、SOCS3、STAT1的表達(dá)Table 6 RT-PCR on p53, Caspase-3, SOCS3, STAT1 in dairy cow mammary epithelial cell

3 討論與結(jié)論

3.1苜蓿黃酮對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞功能與增殖的影響

研究表明苜蓿黃酮具有一定的雌激素作用[9]，苜蓿黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖作用機(jī)制可能是苜蓿黃酮中的活性成分作用于雌激素的受體，起到一定雌激素的作用，而雌激素具有促進(jìn)乳腺管增生的作用，引起奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖。本試驗(yàn)表明培養(yǎng)3 d的乳腺細(xì)胞各組的增殖水平差異不顯著，培養(yǎng)5 d的乳腺上皮細(xì)胞試驗(yàn)Ⅱ組、Ⅲ 組、Ⅳ 組的增殖水平與對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組差異極顯著(P<0.01)。說明高濃度的苜蓿黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖效果明顯，且濃度在75 μg/mL時(shí)效果最顯著。穆瑩和江連洲[10]的研究表明大豆異黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞的增殖具有明顯的作用。NO作為血管舒張因子增加血流量有顯著作用，乳腺上皮細(xì)胞分泌的NO進(jìn)入乳腺血管中增加血流量，促進(jìn)泌乳。隨著泌乳期的改變，乳腺中NO的含量會(huì)發(fā)生變化，其含量在泌乳前期與妊娠后期達(dá)到最大，證明NO對(duì)促進(jìn)泌乳具有重要作用[11]。只有當(dāng)細(xì)胞受損時(shí)LDH才能在細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢出，所以細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH的濃度代表細(xì)胞的受損程度，本試驗(yàn)中添加苜蓿黃酮培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)上清中試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ組的LDH含量與對(duì)照組比較均有降低，說明苜蓿黃酮對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞具有保護(hù)作用，對(duì)細(xì)胞增殖情況的檢測(cè)也進(jìn)一步得到證實(shí)。本試驗(yàn)中隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高，其NO的含量隨之上升，說明苜蓿黃酮對(duì)奶牛的泌乳性能有積極的影響。但NO作為自由基其含量過高會(huì)對(duì)機(jī)體造成損害，因此需要控制細(xì)胞內(nèi)NO的含量在正常范圍值以內(nèi)。

3.2苜蓿黃酮對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞抗氧化能力的影響

機(jī)體在氧化反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生自由基，自由基在機(jī)體內(nèi)具有能量的傳遞等作用，但是自由基的活動(dòng)失控及產(chǎn)量過多時(shí)就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生損害。這些自由基具有強(qiáng)氧化作用，會(huì)使機(jī)體在組織水平，細(xì)胞水平或分子水平產(chǎn)生損傷與破壞，最終導(dǎo)致疾病與衰老的發(fā)生[12]。CAT與GSH-PX都是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶類，CAT能夠分解細(xì)胞中羥自由基對(duì)細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境產(chǎn)生保護(hù)作用[13]。GSH-PX含量的提高是動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力增強(qiáng)的標(biāo)志之一；MDA是機(jī)體新陳代謝產(chǎn)生的自由基大量聚集引發(fā)細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸過氧化的產(chǎn)物，細(xì)胞內(nèi)MDA的水平可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，測(cè)定其濃度可以判斷細(xì)胞損傷的程度[14]。因此，通過測(cè)定機(jī)體CAT、GSH-PX的活力與MDA的含量，在一定程度上可以反映機(jī)體的抗氧化能力[15]。苜蓿黃酮中含有豐富的酚類物質(zhì)，可與過氧化自由基結(jié)合，阻斷過氧化鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行，提高機(jī)體的抗氧化能力。本研究結(jié)果表明苜蓿黃酮通過提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)CAT、GSH-PX的活性，來提高奶牛乳腺上皮細(xì)胞的抗氧化能力。試驗(yàn)Ⅳ組可能因?yàn)檐俎｜S酮添加量過高而引起其他的影響，需要進(jìn)一步的探究。李寶蘭等[16]通過研究小鼠灌胃苜蓿黃酮后發(fā)現(xiàn)在小鼠的肝臟和腎臟組織中,SOD活性明顯升高而MDA 的含量顯著降低。說明苜蓿黃酮可通過提高抗氧化酶的活性來增強(qiáng)機(jī)體抗氧化的能力。盧志勇等[17]研究發(fā)現(xiàn)，通過添加大豆異黃酮進(jìn)行奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)，可以顯著提升奶牛乳腺上皮細(xì)胞中CAT、SOD、GSH-PX的活性，顯著降低MDA的含量，起到增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力的作用。近年研究表明，所有抗氧化劑都對(duì)體系有一定要求，大多數(shù)酚類抗氧化劑在高劑量下不但起不到抗氧化效果，反而有助于氧化。因此，對(duì)于苜蓿黃酮的適宜添加量還需進(jìn)一步的研究。

3.3苜蓿黃酮對(duì)體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞中p53、Caspase-3、SOCS3、STAT1基因表達(dá)的影響

Boué等[18]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)染料木素在質(zhì)量濃度小于0.5 μg/L時(shí)，可以抑制乳腺癌細(xì)胞 MCF-7的增殖和生長(zhǎng)。吳健全等[19]發(fā)現(xiàn)用5 μmol/L的染料木黃酮處理乳腺癌細(xì)胞后，癌細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的 mRNA和蛋白表達(dá)水平逐漸降低。Cai等[20]研究發(fā)現(xiàn)在突變型 4～18 周齡的Apcmin鼠的飼糧中添加0.2%苜蓿素，與對(duì)照組相比，患腸癌的概率降低了33%；進(jìn)一步的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苜蓿素對(duì)于抑制惡性胸腺癌細(xì)胞 MDA-MB-468 的生長(zhǎng)具有重要作用。p53與STAT1基因在生物體內(nèi)對(duì)于細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡有重要作用，且都能抑制細(xì)胞的癌變。STAT1 還有抗感染，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等作用。缺失STAT1的小鼠化學(xué)誘導(dǎo)的或者自發(fā)的腫瘤發(fā)生頻率要比野生型小鼠更高，并且抗腫瘤活性因子 IFNα 失活，由此STAT1被認(rèn)定為腫瘤抑制蛋白[21]。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡效應(yīng)因子，Caspase-3誘導(dǎo)凋亡執(zhí)行的機(jī)理為，它對(duì)全部或部分關(guān)鍵性蛋白酶進(jìn)行裂解，從而使DNA片斷化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。正常細(xì)胞中Caspase-3以無活性酶原的形式存在，由凋亡刺激因素作用以激活，激活的Caspase-3可以活化DNA修復(fù)酶、細(xì)胞骨架蛋白及核因子等，導(dǎo)致DNA裂解、細(xì)胞皺縮、凋亡小體形成和染色體濃縮等細(xì)胞形態(tài)的變化，最終引起細(xì)胞凋亡，對(duì)凋亡具有促進(jìn)作用[22]。張曼和王桂敏[23]研究發(fā)現(xiàn)，菟絲子黃酮可以通過降低Caspase-3 蛋白的表達(dá)來抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷起到保護(hù)的作用。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白-3(SOCS-3)可以對(duì)多種細(xì)胞因子和激素(包括LIF，IL-11，生長(zhǎng)激素，胰島素和瘦素)產(chǎn)生的信號(hào)傳導(dǎo)過程進(jìn)行負(fù)調(diào)節(jié)，這些信號(hào)傳導(dǎo)過程的作用涉及啟動(dòng)免疫反應(yīng)，控制炎癥過程，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育以及淋巴細(xì)胞的分化等方面[24]。STAT1 可誘導(dǎo)凋亡蛋白的合成，Caspase-3前體可在體內(nèi)或體外刺激的作用下形成凋亡蛋白，進(jìn)而水解其他蛋白質(zhì)。STAT1 還可以與p53蛋白作用，該蛋白參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。平時(shí)機(jī)體由于缺氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏、DNA受損或者癌基因被激活使得原來處在低水平表達(dá)的p53蛋白，表達(dá)水平明顯提升[25]。本試驗(yàn)RT-PCR結(jié)果表明，苜蓿黃酮通過下調(diào)Caspase-3、SOCS3、p53、STAT1的表達(dá)來起到阻止細(xì)胞癌變，抑制細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)等作用。

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Proliferation stimulus and antioxidant effect of alfalfa flavonoids on dairy cow mammary epithelial cells culturedinvitro

SU Xiao-Shuang1**, ZHAN Jin-Shun1**, ZHAN Kang1, LIU Ming-Mei1,2, ZHAO Guo-Qi*

1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China； 2.JiangsuJointInstituteofTechnologyofProfessionofHuai’anBio-engineeringBranch,Huai’an223200，China

This experiment studied the proliferation stimulus and antioxidant effects of different concentrations of alfalfa flavonoids on cow mammary epithelial cells culturedinvitro.Media with five different concentrations of alfalfa flavonoids were prepared to culture dairy cow mammary epithelial cellsinvitro.Concentrations tested were:0 μg/mL (control group), 25 μg/mL (trial group Ⅰ), 50 μg/mL (trial group Ⅱ), 75 μg/mL (trial group Ⅲ), 100 μg/mL (trial group Ⅳ).The results showed:1) There was no significant difference in cell proliferation between the five concentrations during the first three days of cell culture, but the cell proliferation of trial groups Ⅱ-Ⅳ was significantly higher than for the control group and trial group Ⅰ (P<0.01) at day 5.2) The NO levels of trial groups Ⅱ-Ⅳ were significantly higher than the control group and trial group Ⅰ (P<0.01).Also, LDH activity of groups Ⅰ, Ⅱ, and Ⅳ was significantly lower than the control group and than test group Ⅲ (P<0.01), and the difference between the control group and test group Ⅲ was not significant.3) Intracellular CAT content of trial group Ⅳ was significantly higher than the other groups (P<0.01).The MAD content of group Ⅲ was significantly lower than the other groups (P<0.01).GSH-PX activity of groups Ⅱ and Ⅲ was significantly higher than the other groups (P<0.01).In addition, there was no significant difference between the five groups in the cell SOD content.4) The relative expression levels ofp53,Caspase-3,SOCS3 andSTAT1 genes in groups Ⅱ and Ⅲ were significantly lower than control group (P<0.01).In summary, alfalfa flavonoids can promote the proliferation of bovine mammary epithelial cells culturedinvitro, improve cell antioxidant capacity and inhibit cellular apoptosis.The best effect occurred at a dosage of 75 μg/mL of alfalfa flavonoids.

alfalfa flavonoids; mammary epithelial cells; antioxidant; cell proliferation

10.11686/cyxb2015030

http://cyxb.lzu.edu.cn

2015-01-16；改回日期：2015-04-20

江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)，江蘇省高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(KYZZ_0367)和長(zhǎng)三角地區(qū)生鮮乳質(zhì)量安全追溯體系關(guān)鍵技術(shù)研究應(yīng)用項(xiàng)目(14395810100)資助。

蘇效雙(1991-)，男，山東濰坊人，在讀碩士。E-mail:18765905923@163.com。占今舜(1985-)，男，江西玉山人，在讀博士。E-mail:zhanjs1023@sina.com。

蘇效雙, 占今舜, 詹康, 劉明美, 趙國(guó)琦.苜蓿黃酮對(duì)體外培養(yǎng)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞增殖與抗氧化的影響.草業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 24(12):139-145.

SU Xiao-Shuang, ZHAN Jin-Shun, ZHAN Kang, LIU Ming-Mei, ZHAO Guo-Qi.Proliferation stimulus and antioxidant effect of alfalfa flavonoids on dairy cow mammary epithelial cells culturedinvitro.Acta Prataculturae Sinica, 2015, 24(12):139-145.

** 共同第一作者 These authors contributed equally to this work.

*通信作者Corresponding author.E-mail:gqzhao@yzu.edu.cn