史傳道，劉海英，張榮強(qiáng)，陳志輝，樊曉晨

1陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2第四軍醫(yī)大學(xué)；3西安紅十字會(huì)醫(yī)院

抗疏健骨顆粒的長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)研究*

史傳道1，劉海英2，張榮強(qiáng)1，陳志輝1，樊曉晨3

1陜西中醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2第四軍醫(yī)大學(xué)；3西安紅十字會(huì)醫(yī)院

目的：觀察抗疏健骨顆粒長(zhǎng)期應(yīng)用的安全性，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：將SD大鼠160只隨機(jī)分為高劑量組(40 g/kg)、中劑量組(20 g/kg)、低劑量組(10 g/kg)及空白對(duì)照組，連續(xù)灌胃給藥6個(gè)月。分別于實(shí)驗(yàn)中期(給藥3個(gè)月)、實(shí)驗(yàn)結(jié)束(給藥6個(gè)月)及停藥后4周恢復(fù)期測(cè)量大鼠體質(zhì)量，計(jì)算臟器系數(shù)，測(cè)定血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)，作組織病理學(xué)檢查。結(jié)果：抗疏健骨顆粒高、中、低劑量組大鼠的外觀體征，行為活動(dòng)，體質(zhì)量，臟器系數(shù)，血液學(xué)和血液生化學(xué)指標(biāo)與空白對(duì)照組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；病理檢查未見(jiàn)與藥物毒性相關(guān)的明顯病變，停藥后也未見(jiàn)藥物延遲性毒性反應(yīng)。結(jié)論：抗疏健骨顆粒在規(guī)定劑量下口服是安全的，無(wú)明顯毒性反應(yīng)。

抗疏健骨顆粒；SD大鼠；長(zhǎng)期毒性實(shí)驗(yàn)

抗疏健骨顆粒以“補(bǔ)腎、健脾、活血”立法，由淫羊藿、丹參、杜仲、懷牛膝、白術(shù)、骨碎補(bǔ)等中藥組成，用于防治骨質(zhì)疏松癥。為確保臨床用藥的安全性，本研究對(duì)其進(jìn)行了大鼠長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 抗疏健骨顆粒(1 g干浸膏粉相當(dāng)于13.5 g生藥)由陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，使用時(shí)加蒸餾水配制成不同藥物濃度供實(shí)驗(yàn)應(yīng)用；化學(xué)試劑均為市售分析純；血液生化檢測(cè)專用試劑及血液細(xì)胞學(xué)檢測(cè)專用試劑均為專供產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 S D大鼠160只，體質(zhì)量80～110g，雌雄各半，雌性大鼠無(wú)孕，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：S C X K(陜) 2012-003。動(dòng)物按性別分籠飼養(yǎng)于有空調(diào)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，室溫(22±40)℃，相對(duì)濕度60%±80%。自由飲水，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 全自動(dòng)生化分析儀(O l y m pu s A U 600型，日本)；全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(S ys m a x X T-1800，日本)；全自動(dòng)血凝分析儀(A M A X-200型，德國(guó))。

1.4 分組及給藥 將6～8周齡S D大鼠160只隨機(jī)分為抗疏健骨顆粒高劑量組(40 g/k g)、中劑量組(20 g/k g)、低劑量組(10 g/k g)及空白對(duì)照組(生理鹽水)各40只，高、中、低3個(gè)劑量分別為人每天用量的80、40、20倍。給藥體積為0.01m L/g (體質(zhì)量)，空白對(duì)照組給予等體積生理鹽水溶液，2次/d，每周6天，連續(xù)給藥6個(gè)月。給藥前及給藥期間每周稱體質(zhì)量1次，并按體質(zhì)量調(diào)整給藥計(jì)量。全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程分3個(gè)階段，即試驗(yàn)中期(給藥3個(gè)月)、試驗(yàn)結(jié)束(給藥6個(gè)月)及4周的停藥恢復(fù)期。實(shí)驗(yàn)期間每天觀察大鼠一般狀態(tài)、體征、攝食量、飲水及糞便狀況。如有中毒反應(yīng)的動(dòng)物取出單籠飼養(yǎng)，重點(diǎn)觀察。有死亡或?yàn)l死動(dòng)物及時(shí)尸檢［1］。

1.5 標(biāo)本采集與處理 連續(xù)給藥3個(gè)月，在末次給藥24小時(shí)后，每組隨機(jī)抓取10只大鼠(雌雄各半)，腹腔注射戊巴比妥鈉(35m g/k g)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，用血細(xì)胞分析儀檢測(cè)［2］采集血樣的紅細(xì)胞(R B C)、血紅蛋白(H G B)、白細(xì)胞(W B C)、血小板(P L T)、淋巴細(xì)胞系(L Y M)及中性細(xì)胞系(M O N)等血液學(xué)指標(biāo)。另外取血分離血清，用生化自動(dòng)分析儀測(cè)定血清中的總膽紅素(T B I l)、總蛋白(T P)、白蛋白(A L B)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(A L T)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(A S T)、堿性磷酸酶(A L P)、尿素氮(B U N)、肌酐(C rea)、葡萄糖(GL U)等生化指標(biāo)。并進(jìn)行全面尸檢，取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺等臟器稱重，計(jì)算臟器系數(shù)。然后對(duì)上述主要臟器及胃、小腸、子宮、卵巢、睪丸、腦等臟器用10%甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查［3］。其余動(dòng)物連續(xù)給藥6個(gè)月，在停藥后24小時(shí)每組隨機(jī)抓取20只動(dòng)物(雌雄各半)，依次進(jìn)行如上檢測(cè)［4］。留作恢復(fù)期觀察的動(dòng)物于停藥4周時(shí)依次進(jìn)行如上檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用S P SS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用方差分析，采用L S D-t法進(jìn)行兩兩比較；系統(tǒng)尸解及組織病理學(xué)采用定性指標(biāo)描述，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)動(dòng)物一般情況的影響 給藥期間，抗疏健骨顆粒各劑量組及空白對(duì)照組大鼠外觀體征、行為活動(dòng)、進(jìn)食量及糞便等狀況正常，動(dòng)物無(wú)一死亡；高劑量組個(gè)別時(shí)間點(diǎn)大鼠食量有所減少，但與空白對(duì)照組比較無(wú)明顯差異；停藥觀察4周亦無(wú)明顯變化，見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量的影響 給藥期間抗疏健骨顆粒各劑量組及空白對(duì)照組大鼠體質(zhì)量正常增長(zhǎng)。與空白對(duì)照組比較，各劑量組體質(zhì)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；停藥觀察4周后，亦無(wú)明顯變化，見(jiàn)表2。

表1 對(duì)大鼠食量的影響 g/(kg·d)

表2 對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響 g/(kg·d)

2.3 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響 抗疏健骨顆粒連續(xù)給藥3個(gè)月后，與空白對(duì)照組比較，各項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；連續(xù)給藥6個(gè)月后，高劑量組大鼠W B C、L Y M略有升高，但在正常范圍內(nèi)，與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；其他各劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；停藥恢復(fù)1月后，中劑量組、低劑量組大鼠P T略有升高，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；其他指標(biāo)與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表3。

表3 對(duì)大鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

2.4 對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響 抗疏健骨顆粒連續(xù)給藥3個(gè)月后，中劑量組大鼠血清A S T值有所降低，與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；高劑量組血清C rea值有所升高，與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，其他各劑量組的各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；連續(xù)給藥6個(gè)月后，高劑量組大鼠血清C rea值升高，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其他各劑量組各項(xiàng)指標(biāo)與空白對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；停藥恢復(fù)1個(gè)月后，與空白對(duì)照組比較，各項(xiàng)指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表4。

表4 對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)的影響

2.5 對(duì)動(dòng)物臟器系數(shù)的影響 給鼠連續(xù)用藥3月、6月和停藥4周后，抗疏健骨顆粒高、中、低劑量組和空白對(duì)照組大鼠心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺等主要臟器系數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明長(zhǎng)期灌服抗疏健骨顆粒對(duì)大鼠主要臟器無(wú)明顯影響，見(jiàn)表5。

表5 對(duì)大鼠臟器系數(shù)的影響 mg/g

2.6 組織學(xué)檢查 連續(xù)用藥3月、6月和停藥4周后，分別處死動(dòng)物，剖取臟器。肉眼觀察見(jiàn)臟器外形、體積、色澤正常，無(wú)充血、腫脹、壞死等異常現(xiàn)象。然后，用10%甲醛溶液固定臟器48小時(shí)，按常規(guī)方法做病理切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果空白對(duì)照組有2例、高劑量組有1例標(biāo)本存在肝細(xì)胞輕度脂肪變性，屬動(dòng)物常態(tài)分布；高劑量組有1例標(biāo)本有部分睪丸組織萎縮，綜合血液學(xué)和生化學(xué)指標(biāo)分析，判定由睪丸發(fā)育不良所致，與藥物毒性引起的病變無(wú)關(guān)。其他各劑量組臟器組織形態(tài)學(xué)正常，與空白對(duì)照組比較，未見(jiàn)明顯由藥物毒性引起的病理改變。表明大鼠長(zhǎng)期灌胃抗疏健骨顆粒不會(huì)影響動(dòng)物器官組織形態(tài)學(xué)改變。

3 結(jié)論

本研究表明抗疏健骨顆粒以40、20、10 g/k g (體質(zhì)量)，相當(dāng)于人每天用量的80、40、20倍，連續(xù)灌胃給藥3個(gè)月、6個(gè)月及停藥4周后，與空白對(duì)照組比較，動(dòng)物的一般狀況、體質(zhì)量、主要臟器系數(shù)無(wú)明顯差異；血液學(xué)指標(biāo)、血液生化學(xué)指標(biāo)各劑量組與空白對(duì)照組比較，雖有個(gè)別檢測(cè)指標(biāo)存在一定差異，但其測(cè)定值仍在正常值范圍內(nèi)或停藥后恢復(fù)到正常值范圍內(nèi)，故無(wú)實(shí)際意義［5］。主要臟器的病理檢查表明，組織形態(tài)學(xué)正常，未見(jiàn)與藥物毒性相關(guān)的明顯病變；停藥4周后也未見(jiàn)藥物延遲性毒性反應(yīng)。表明抗疏健骨顆粒在規(guī)定劑量下口服是安全的，無(wú)明顯毒性反應(yīng)。

［1］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局.中藥新藥研究指南(藥學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué))［M］.北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局，1994：194-235.

［2］ 中華人民共和國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局.中藥、天然藥物長(zhǎng)期毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則［M］.北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，2005：3-13.

［3］ 徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：231.

［4］ 黃芳華.中藥新藥申報(bào)資料中長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)的常見(jiàn)問(wèn)題［J］.中國(guó)新藥雜志，2004，13(7)：661-663.

［5］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥政管理局.新藥(西藥)臨床前研究指導(dǎo)原則匯編［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1993：199-200.

The Long-term Toxicity Testof KangShu JianGu Granuleson SD Rats

SHIChuandao1,LIU Haiying2,ZHANG Rongqiang1,CHEN Zhihui1,FAN Xiaochen3
1 ShaanxiUniversity of Chinese Medicine,Xianyang 712046,China; 2 The Fourth Military Medical University;3 Xi′an Red Cross Hospital

Objective:To observe the long-term safety of KangShu JianGu granules(anti-osteoporosis and bone-strengthening granules)and provide the experimental basis for clinicalmedication.Methods:Totally 160 SD ratswere randomized into high dosegroup(40 g/kg),middle dosegroup(20 g/kg),low dose group(10 g/kg)and blank group,w ith intragastrically adm inistered for6months.The rats'constitution tested,organ coefficient counted, hematologic and biochem ical indexes determ ined aswell as histopathological examinationswere conducted in the m iddle period(administered for 3months),in the end period(administered for 6months)and after 4 weeks of stoppingmedicine respectively.Results:In the comparison of rats'outward appearance,behavior,constitution,organ coefficient as well as hematologic and biochem ical indexes between the high,m iddle and low dose groups and the blank group,therewas no significantdifference;by pathologicalexam ination,therewas no obvious illness relevant to medical toxicity and no indication of delayed toxicity reaction after stopping medicine.Conclusion:KangShu JianGu granulesof the specified dose taken orally are safew ithoutobvious toxic reaction.

KangShu JianGu granules;SD rat;long-term toxicity test

R285.15

A

1004-6852(2015)03-0014-06

2014-02-22

2012年陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)2012KTCL03-22)；陜西省中管局中醫(yī)藥科研項(xiàng)目(編號(hào)13-LC069)；陜西省教育廳科研項(xiàng)目(編號(hào)11JK0674)。

史傳道(1965—)，男，碩士研究生導(dǎo)師，教授。研究方向：退行性骨病的中西醫(yī)結(jié)合診治。