鄒自英，劉 媛，朱 冰，吳麗娟，胡宗海，曾 平

(成都軍區(qū)總醫(yī)院微生物免疫科，成都 610083)

論著·臨床研究

導(dǎo)管分離表皮葡萄球菌生物被膜形成能力相關(guān)研究*

鄒自英，劉 媛#，朱 冰，吳麗娟△，胡宗海，曾 平

(成都軍區(qū)總醫(yī)院微生物免疫科，成都 610083)

目的 探討導(dǎo)管分離表皮葡萄球菌的生物被膜形成能力和耐受應(yīng)激環(huán)境能力。方法 采用結(jié)晶紫半定量法和細(xì)菌計(jì)數(shù)法檢測表皮葡萄球菌的生物被膜形成能力和應(yīng)激環(huán)境耐受能力。結(jié)果 表皮葡萄球菌1457菌株和5株導(dǎo)管分離菌株均具有生物被膜形成能力，菌株之間生物被膜形成能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；導(dǎo)管分離菌株與1457菌株的游離細(xì)菌和被膜細(xì)菌的生長能力、對高分子材料的黏附能力、對過氧化氫的氧化應(yīng)激耐受能力和對乙醇耐受能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 表皮葡萄球菌導(dǎo)管分離菌株與產(chǎn)生生物被膜的表皮葡萄球菌1457菌株具有相近的生物被膜形成能力和耐受應(yīng)激環(huán)境能力。

葡萄球菌，表皮；氧化性應(yīng)激；生物被膜

表皮葡萄球菌是典型的生物被膜菌，它可以通過黏附在一些植入醫(yī)療器械表面形成生物被膜而造成持續(xù)性感染，具有遷延不愈的特征[1-2]。表皮葡萄球菌的生物被膜不僅對抗菌藥物具有非常強(qiáng)的抵抗能力，而且對機(jī)體免疫機(jī)制也具有非常強(qiáng)的適應(yīng)能力，因而非常難以清除。本研究探討導(dǎo)管來源表皮葡萄球菌形成生物被膜能力和耐受應(yīng)激環(huán)境能力，為臨床治療由表皮葡萄球菌引起的導(dǎo)管相關(guān)性感染提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 臨床送檢導(dǎo)管和血液培養(yǎng)同時(shí)檢測出表皮葡萄球菌生長，導(dǎo)管分離株和血液培養(yǎng)分離株耐藥表型一致的病例，選擇導(dǎo)管分離菌株共計(jì)5株(SE1-5)。表皮葡萄球菌1457(SE1457)購自中國工業(yè)菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 采用梅里埃公司的VITEK2 COMPACT 全自動(dòng)微生物分析儀和GP鑒定卡對細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.2.2 表皮葡萄球菌生物被膜半定量檢測 參照文獻(xiàn)[1]，調(diào)節(jié)菌液濃度使光密度(OD)600=0.01，接種96孔板：200 μL/孔，每組4孔，對照組為新鮮培養(yǎng)基，37 ℃ 24 h，200 μL/孔PBS清洗4次。50 μL/孔 Bouin固定液固定1 h，PBS清洗4次，50 μL/孔結(jié)晶紫染色1 min。自來水清洗殘余染料，室溫晾干。用酶標(biāo)儀讀取波長570 nm的OD值。將測定組每孔測得值減去對照組平均值后即為測定組每孔最終值。

1.2.3 生物被膜細(xì)菌計(jì)數(shù) 調(diào)節(jié)菌液濃度使OD600=0.01，接種24孔平板，37 ℃ 24 h。收集上清液到一個(gè)無菌試管。0.5 mL PBS輕輕洗脫未黏附的細(xì)菌與上清液混合。再次加入0.5 mL PBS，用平頭牙簽刮下被膜菌，收集到另一個(gè)無菌試管。上清液和生物被膜中的細(xì)菌分別進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 表皮葡萄球菌的黏附能力 調(diào)節(jié)菌液濃度使OD600=0.02，37 ℃培養(yǎng)直到OD600=1.00，200 μL/孔接種96孔平板，37 ℃ 1 h。200 μL/孔 PBS洗滌4次。50 μL/孔Bouin固定液固定1 h，再次以PBS清洗4次。50 μL/孔結(jié)晶紫染色1 min，自來水洗去殘余染料，室溫晾干。用酶標(biāo)儀讀取波長570 nm的OD值。將測定組每孔測得值減去對照組平均值后即為測定組每孔最終值。

1.2.5 氧化應(yīng)激耐受實(shí)驗(yàn) 調(diào)節(jié)菌液濃度使OD600=0.02，37 ℃培養(yǎng)直到OD600=0.30。在一個(gè)無菌試管中加入1.8 mL菌液，然后加入2 mol/L的過氧化氫0.2 mL振蕩混勻，室溫靜置15 min，涂板計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)過氧化氫處理前后的細(xì)菌數(shù)，計(jì)算存活率。

1.2.6 乙醇耐受實(shí)驗(yàn) 調(diào)節(jié)菌液濃度使OD600=0.02，37 ℃培養(yǎng)直到OD600=0.30。在一個(gè)無菌試管中加入2 mL菌液，然后加入無水乙醇353 μL振蕩混勻，室溫靜置15 min,涂板計(jì)數(shù)，分別計(jì)數(shù)乙醇處理前后的細(xì)菌總數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表皮葡萄球菌的生物被膜形成能力 表皮葡萄球菌1457和5株導(dǎo)管分離菌株均具有生物被膜形成能力，菌株之間生物被膜形成能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

SE1457：表皮葡萄球菌1457菌株；SE1～SE5：臨床菌株1～5號。

圖1 不同菌株的生物被膜形成能力

2.2 生物被膜細(xì)菌計(jì)數(shù) 為了比較不同菌株生物被膜形成能力差異是否是由于菌株的生長能力不同引起的，分別對檢測菌株的游離細(xì)菌和被膜細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，與1457菌株比較，游離細(xì)菌和被膜細(xì)菌的生長能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

SE1457：表皮葡萄球菌1457菌株；SE1～SE5：臨床菌株1～5號；Planktonic：浮游生長的細(xì)菌；Biofilm：生物被膜細(xì)菌；Total：Planktonic與Biofilm之和。

圖2 生物被膜細(xì)菌計(jì)數(shù)

2.3 菌株對高分子材料的黏附能力 與1457菌株比較，臨床菌株與1457菌株對高分子材料的黏附能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

SE1457：表皮葡萄球菌1457菌株；SE1～SE5：臨床菌株1～5號。

圖3 菌株對高分子材料的黏附能力

2.4 菌株氧化應(yīng)激耐受能力和乙醇耐受能力 臨床菌株與1457菌株對過氧化氫的氧化應(yīng)激耐受能力和乙醇耐受能力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

SE1457：表皮葡萄球菌1457菌株；SE1～SE5：臨床菌株1～5號。

圖4 細(xì)菌氧化應(yīng)激耐受能力和乙醇耐受能力

3 討論

1457菌株是能形成生物被膜的野生菌株，通過與1457菌株進(jìn)行對比分析，可以了解臨床菌株生物被膜形成能力的高低。同屬葡萄球菌屬，金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生多種毒素致病，而表皮葡萄球菌則主要通過在一些人工植入的醫(yī)療器械如深靜脈置管、導(dǎo)尿管、人工瓣膜等表面形成生物被膜，成為新的感染灶，持續(xù)釋放病原菌[3-4]。本研究選取的5例均為導(dǎo)管和血液均檢測出一致耐藥表型的表皮葡萄球菌病例，所選擇的導(dǎo)管分離菌株均具有野生菌株1457的生物被膜形成能力。

表皮葡萄球菌分兩個(gè)步驟形成生物被膜：(1)黏附；(2)通過增殖和合成黏性的細(xì)胞外基質(zhì)，形成多層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，覆蓋在植入物表面[5]。因而生物膜形成能力的差異可能由黏附能力不同或增殖能力差異造成。本結(jié)果顯示，導(dǎo)管分離表皮葡萄球菌與1457菌株均具有對高分子材料相近的黏附能力和生長能力，其生物被膜形成機(jī)制有待進(jìn)一步研究。有研究報(bào)道，多種基因分別在表皮葡萄球菌生物被膜形成的各個(gè)階段發(fā)生作用，如atlE、sdrG、embp基因在初始黏附過程中發(fā)揮重要作用[6]；而ica操縱子、aap基因則參與被膜細(xì)菌的增殖[7-9]。Agr和luxS細(xì)菌數(shù)量感應(yīng)系統(tǒng)也參與表皮葡萄球菌生物被膜的形成調(diào)控。

滲透壓、乙醇、葡萄糖等環(huán)境條件均可以影響表皮葡萄球菌的生物被膜形成，乙醇通過抑制icaR的轉(zhuǎn)錄從而刺激表皮葡萄球菌生物被膜形成，而ClpP蛋白酶通常參與細(xì)菌對各種應(yīng)激環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制[10-12]。導(dǎo)管分離的5株表皮葡萄球菌與1457菌株均具有對強(qiáng)氧化劑過氧化氫和常用消毒劑乙醇的耐受能力，其中是否有ClpP蛋白酶的參有待進(jìn)一步的研究。

生物被膜陽性的表皮葡萄球菌能在靜脈插管上形成生物被膜，通過形成感染灶持續(xù)性的脫落細(xì)菌入血，侵犯機(jī)體，有必要深入研究生物被膜陽性和生物被膜陰性細(xì)菌的致病能力差異和致病機(jī)制，從而找到抑制表皮葡萄球菌生物被膜形成的可能藥物靶標(biāo)。

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Biofilm forming ability of staphylococcus epidermidis strains isolated from catheters*

ZouZiying,LiuYuan#,ZhuBing,WuLijuan△,HuZonghai,ZengPing

(DepartmentofMicrobialImmune,ChengduMilitaryCommandGeneralHospital,Chengdu，Sichuan610083，China)

Objective To explore the biofilm forming ability and the ability to survive in stress environment of staphylococcus epidermidis strains isolated from catheters.Methods Semiquantitative biofilm assay and bacteria cell counting were performed to explore the biofilm forming ability and the ability to survive in stress environment of staphylococcus epidermidis strains.Results Staphylococcus epidermidis strain of 1457 and 5 clinical strains isolated from catheters had the similar ability of biofilm formation(P>0.05),similar growth ability of planktonic and biofilm cells,similar attachment ability to polystyrene,similar ability to survive in an oxidative and ethanol stress environment (P>0.05).Conclusion The biofilm forming ability and the ability to survive in stress environment of staphylococcus epidermidis strains isolated from catheters were similar to staphylococcus epidermidis 1457 strain.

staphylococcus epidermidis;oxidative stress;biofilm

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.05.016

四川省衛(wèi)生廳科研課題(130318)。 作者簡介：鄒自英(1977-)，主治醫(yī)師，主要從事細(xì)菌耐藥機(jī)制研究。#共同第一作者?！?/p>

,E-mail：wulijuan1638@126.com。

R378

A

1671-8348(2015)05-0626-02

2014-09-20

2014-11-10)