曾玉劍，劉 霜,孫 亮,舒 若,施承民,

郭姝婧1,2,費(fèi)昱達(dá)1,2,王昆華1,2,羅華友1,2△

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.胃腸與疝外科;2.云南省消化病研究所；3.干療科，昆明 650032)

論著·臨床研究

急性胰腺炎患者外周血單核細(xì)胞TLR9 mRNA的表達(dá)及意義*

曾玉劍1,2，劉 霜3,孫 亮1,2,舒 若1,2,施承民1,2,

郭姝婧1,2,費(fèi)昱達(dá)1,2,王昆華1,2,羅華友1,2△

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.胃腸與疝外科;2.云南省消化病研究所；3.干療科，昆明 650032)

目的 觀察急性胰腺炎(AP)患者外周血單核細(xì)胞(PBMCs)Toll樣受體9(TLR9)mRNA的表達(dá)情況。方法 收集52例發(fā)病24 h內(nèi)的AP患者，采集第1、3、5天外周乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝靜脈血，提取血漿低溫凍存，用于成批檢測(cè)胰彈性蛋白酶、促炎細(xì)胞因子、抗炎細(xì)胞因子等。同法采集其治愈后2～3個(gè)月的外周EDTAK2抗凝靜脈血行上述檢測(cè)，作為相應(yīng)指標(biāo)的基準(zhǔn)水平值。分離外周血單核細(xì)胞用于隨后成批作逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)TLR9 mRNA的表達(dá)變化規(guī)律。同法采集其治愈后3個(gè)月的外周EDTAK2抗凝靜脈血行上述檢測(cè)，作為相應(yīng)指標(biāo)的基準(zhǔn)水平值。最終將成功采得治愈后3個(gè)月血液標(biāo)本的前36例患者納入最終研究。結(jié)果 AP患者的外周血PBMCs TLR9 mRNA相對(duì)含量高于其痊愈后3個(gè)月的基線水平(P<0.05)。AP患者的外周血PBMCs TLR9 mRNA相對(duì)含量表達(dá)改變與胰彈性蛋白酶、促炎細(xì)胞因子水平呈正相關(guān)，與抗炎細(xì)胞因子無(wú)相關(guān)性。結(jié)論 AP患者的外周血PBMCs TLR9 mRNA表達(dá)顯著升高并與促炎細(xì)胞因子表達(dá)同步上調(diào)，提示AP的發(fā)生、發(fā)展可能通過(guò)TLR9介導(dǎo)。

Toll樣受體9；急性胰腺炎;外周血單核細(xì)胞

急性壞死性胰腺炎(aute necrotizing pancreatitis,ANP)的治療是一個(gè)醫(yī)學(xué)難題。無(wú)論基礎(chǔ)研究還是臨床實(shí)踐都尚未能取得根本性的突破：(1)ANP發(fā)病機(jī)理的研究尚無(wú)重大突破性發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有發(fā)病理論不足以解釋急性胰腺炎(AP)的發(fā)生、發(fā)展；(2)ANP的發(fā)病率及病死率逐年上升，現(xiàn)美國(guó)每年AP患者約185 000例；其中25%發(fā)展成為ANP，后者的病死率高達(dá)50%。中國(guó)雖缺乏詳盡的統(tǒng)計(jì)資料，但局部地區(qū)大宗病案報(bào)道也提示ANP的病死率呈上升趨勢(shì)。AP發(fā)病始動(dòng)環(huán)節(jié)不清、對(duì)ANP發(fā)生、發(fā)展的分子基礎(chǔ)及發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)不足，是AP治療效果難如人意及ANP病死率居高不下的根本原因。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是備受關(guān)注的一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)跨膜蛋白，在天然免疫識(shí)別病原體及介導(dǎo)炎性反應(yīng)信號(hào)通路中有重要作用。TLR9 是TLRs家族成員中的重要一員，通過(guò)識(shí)別外源性的非甲基化CpG基序從而啟動(dòng)機(jī)體炎反應(yīng)鏈。為探尋TLR9是否參與了人的AP，本研究檢測(cè)了AP患者外周血單核細(xì)胞(PBMCs)的TLR9表達(dá)情況，以及其與常見(jiàn)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年3月至2010年8月本院急診科觀察室收治的52例發(fā)病24 h內(nèi)的AP患者；診斷標(biāo)準(zhǔn)：采用人民衛(wèi)生出版社第7版外科學(xué)教材。采集52例患者第1、3、5天外周乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK2)抗凝靜脈血，提取血漿低溫凍存，用于成批檢測(cè)胰彈性蛋白酶、促炎細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1)、抗炎細(xì)胞因子(IL-4)等。同法采集其治愈后3個(gè)月的外周EDTAK2抗凝靜脈血行上述檢測(cè)，作為相應(yīng)指標(biāo)的基準(zhǔn)水平值。分離PBMCs用于隨后成批作逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)TLR9 mRNA的表達(dá)變化規(guī)律。同法采集其治愈后3個(gè)月的外周EDTAK2抗凝靜脈血行上述檢測(cè)，作為相應(yīng)指標(biāo)的基準(zhǔn)水平值。最終將成功采得治愈后3個(gè)月血液標(biāo)本的36例患者納入研究，其余16例排除。全部患者皆診斷明確，同時(shí)確認(rèn)其3個(gè)月內(nèi)未曾接受糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或具有免疫調(diào)節(jié)作用的藥物治療?；颊吣挲g31～54歲，平均(47.1±1.9)歲。

1.2 試劑 人淋巴細(xì)胞分離液、Ficoll Taq DNA聚合酶(北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司),DEPC(Sigma公司),Trizol試劑(Intrivogen公司),Rever Tra Ace逆轉(zhuǎn)錄酶(TOYOBO生物科技公司)。

1.3 方法

1.3.1 TLR9 mRNA的RT-PCR檢測(cè) (1)PBMCs的分離，抽取研究對(duì)象空腹靜脈血15 mL,Ficoll法分離PBMCs。(2)PBMCs總RNA用Trizol按說(shuō)明提取，用Trizol-三氯甲烷-異丙醇-乙醇法提取PBMCs總RNA。(3)逆轉(zhuǎn)錄引物，由TAKARA(中國(guó)大連)設(shè)計(jì)并合成：TLR9F,5′-TCC CTG CAT AGA GGT ACT TC-3′；TLR9R,5′-TCC AGC CAC TGA AGT TGT GA-3′；TaqMan探針：5′-FAM-CTA GAA GTC CCC CAA CTT CGA GTC-FAMRA-3′。取5 μg PBMCs總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再取5 μL cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出的產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖電泳。用GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，其引物為:GAPDHF，5′-TGG GTG TGA ACC ACG AGA-A-3′；GAPDHR，5′-GGC ATG GAC TGT GGT-CAT GA-3′；Taq-Man 探針：5′-FAM-CTG CAC CAC CA ACT GCT TAG CTA MRA-3′。(4)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，取RNA 1 μg加入oligo T 1 μL,5×Buffer 4 μL,10 mmol/L dNTP 2 μL,RNA酶抑制劑1 μL,DEPC水加至20 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 20 min，99 ℃ 5 min,4 ℃ 5 min。(5)PCR檢測(cè)TLR9、TLR7 mRNA表達(dá)相對(duì)含量，TLR9、GAPDH的引物序列設(shè)計(jì)應(yīng)用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer 3.0，由上海博亞生有限公司合成。擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件:取2 μL cDNA,5 μL 10×PCR Buffer,2 μL dNTPs,上游、下游引物各2 μL、1 μL Taq酶,加滅菌雙蒸水至總體積50 μL;94 ℃ 5 min預(yù)變性,94 ℃ 30 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,采用凝膠成像分析系統(tǒng)中進(jìn)行圖像分析。以GAPDH為內(nèi)參照半定量,各樣本表達(dá)強(qiáng)度=樣本灰度值/GAPDH灰度值。

1.3.2 血清淀粉酶和脂肪酶的測(cè)定 抽取研究對(duì)象EDTAK2抗凝靜脈血5 mL。淀粉酶和脂肪酶的測(cè)定在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生化中心的自動(dòng)生化儀(Olympus AU5400,日本)上進(jìn)行。

1.3.3 細(xì)胞因子檢測(cè) 抽取研究對(duì)象EDTAK2抗凝靜脈血5 mL,在常溫下離心后收集上層血清保存于-80 ℃冰箱，用于細(xì)胞因子的檢測(cè)。TNF-α、IL-1和 IL-4用ELISA試劑盒(R&D、Minneapolis、MN)來(lái)進(jìn)行測(cè)定。最后用全自動(dòng)定量繪圖酶標(biāo)儀(Bio-Rad、M550、Hercules、CA)來(lái)判斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 血清淀粉酶和脂肪酶 血清淀粉酶和脂肪酶結(jié)果隨AP的發(fā)展而呈現(xiàn)較為一致的變化；兩酶在第1天組就都已經(jīng)明顯升高。淀粉酶(P<0.05)與脂肪酶都在第1天(P<0.05)達(dá)到峰值。但隨后，淀粉酶呈逐級(jí)回落,而脂肪酶則在第3天快速回落,第5天時(shí)脂肪酶甚至降至近基線水平(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 血清淀粉酶和脂肪酶檢測(cè)結(jié)果

*:P<0.01，與對(duì)照組比較；-：此項(xiàng)無(wú)數(shù)據(jù)。

2.2 血清細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果 每個(gè)組的血清TNF-α、IL-1和 IL-4用ELISA進(jìn)行檢測(cè)(表2)。3種細(xì)胞因子表現(xiàn)為在不同時(shí)段的上調(diào)；TNF-α表現(xiàn)為緩慢的上調(diào)并在第5天組出現(xiàn)峰值；IL-1表現(xiàn)為快速上調(diào)，其后緩慢上升，峰值出現(xiàn)于第5天組；IL-4峰值出現(xiàn)于較早的第1天組，其后逐漸下降。

表2 血清細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.01，與對(duì)照組比較。

2.3 RT-PCR結(jié)果 自RNA逆轉(zhuǎn)錄而來(lái)的cDNA經(jīng)凝膠電泳證實(shí)為目的片段大小(113 bp)。用Taqman探針對(duì)TLR9 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析；其結(jié)果揭示，在AP的前1周內(nèi)，TLR9在PBMCs中呈現(xiàn)出明顯的表達(dá)上調(diào)。TLR9 mRNA在第1天明顯上調(diào)至對(duì)照組的7.89(22.98)倍(P<0.05)。隨后，第3、5天組呈現(xiàn)緩慢上調(diào)表現(xiàn)(P<0.05)，于第5天組達(dá)峰值，分別為對(duì)照組的8.94(23.16)倍，9.51(23.25)倍。

3 討論

AP是一種常見(jiàn)而嚴(yán)重的疾病，但其發(fā)病機(jī)制仍未能完全闡明；其中，重癥胰腺炎病死率仍較高。作為一類新的跨膜蛋白，TLR家族的發(fā)現(xiàn)給AP發(fā)病機(jī)理探索提供了新的途徑。TLR9在其家族中較晚被發(fā)現(xiàn)，通常被認(rèn)為主要表達(dá)于B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞等免疫細(xì)胞[1-4]。但是，最近有報(bào)道一些TLR家族成員也可以表達(dá)于某些上皮細(xì)胞[5]。此外，在一些腫瘤細(xì)胞上也有TLR9高表達(dá)的報(bào)道[6-11]。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明TLR9確實(shí)可以在一些免疫細(xì)胞甚至非免疫細(xì)胞上表達(dá)，并進(jìn)一步提示在這些細(xì)胞上TLR9的作用可能并不是識(shí)別CpG基序。

本研究小組曾經(jīng)對(duì)大鼠胰腺組織是否有TLR9表達(dá)進(jìn)行過(guò)檢測(cè)[1]。免疫組織化學(xué)提示TLR9主要表達(dá)在胰管，特別在胰管上皮。作者前期的實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，TLR4在胰管上皮也有表達(dá)；這是否提示TLR9和TLR4存在著一致或協(xié)同的作用。胰管黏膜屏障(PDMB)[12]是一種被廣泛認(rèn)同的胰管自身的保護(hù)機(jī)制；通常認(rèn)為它的保護(hù)作用既包括機(jī)械性隔離因素，也包括化學(xué)性機(jī)制。作為先天性免疫系統(tǒng)的一種重要受體，TLR9在胰管的表達(dá)揭示了一種可能，TLR9激活和其后細(xì)胞因子釋放也許參與了PDMB的抗炎作用調(diào)節(jié)。據(jù)此，TLR9也可能為一個(gè)潛在的免疫調(diào)節(jié)點(diǎn)。免疫組織化學(xué)也揭示TLR9著色于胰腺的血管內(nèi)皮系統(tǒng)。微循環(huán)損害是AP的早期病理改變之一；作者前期的實(shí)驗(yàn)也提示TLR4可能參與這一損害[13]。TLR9的免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)合其實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果揭示，TLR9可能涉及胰腺炎早期的血管微循環(huán)損害。

上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大鼠胰腺是存在TLR9表達(dá)的。作者隨后的研究亦證實(shí)，TLR9與大鼠實(shí)驗(yàn)性胰腺炎的發(fā)生、發(fā)展存在相關(guān)性。所以，本實(shí)驗(yàn)的目的在于希望將在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)論在人體中得到某種程度的驗(yàn)證。但由于倫理學(xué)的原因和客觀上很難以直接獲取胰腺炎時(shí)的人體胰腺組織，所以只能從較容易獲取的其他組織的檢測(cè)來(lái)間接證實(shí)或推測(cè)TLR9在人類AP時(shí)的作用和參與度。而TLR9在人體PBMCs的表達(dá)已經(jīng)得到證實(shí)，鑒于此，本研究決定提取并檢測(cè)AP患者外周血的單核細(xì)胞。

作者用外周靜脈血行淀粉酶、脂肪酶檢查作為判斷AP的指標(biāo)，這些指標(biāo)提示典型AP改變。

3.1 早期AP患者PBMCs TLR9表達(dá)變化規(guī)律 為了探究TLR9與胰腺炎的關(guān)聯(lián)性，實(shí)時(shí)RT-PCR被用于對(duì)TLR9 mRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)RT-PCR結(jié)果證實(shí)TLR9 mRNA在人外周血單核細(xì)胞為低水平表達(dá)，但在AP早期，TLR9 mRNA表達(dá)即已經(jīng)上調(diào)明顯。TLR9 mRNA上調(diào)迅速，在第1天時(shí)已經(jīng)上升7.89(22.98)倍(P<0.05)，其后逐漸上調(diào)并在第5天時(shí)達(dá)到峰值，約為對(duì)照組的9.51(23.25)倍(P<0.05)。這充分說(shuō)明TLR9對(duì)于人類AP反應(yīng)迅速，TLR9參與了AP的發(fā)展。隨后1周時(shí)間內(nèi)，TLR9表達(dá)并未出現(xiàn)明顯得下調(diào)，而是維持在一個(gè)高水平上的緩慢上調(diào)。Lindau等[14]提出，CpG基序并不能特異性地誘導(dǎo)TLR9表達(dá)上調(diào)。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以間接地推測(cè)，人類AP能夠誘導(dǎo)TLR9快速而強(qiáng)烈的表達(dá)上調(diào)。

3.2 早期AP患者外周血促炎細(xì)胞因子及抑炎細(xì)胞因子與TLR9的關(guān)系 TLR9的上調(diào)和血清中一些細(xì)胞因子的增加是密切相關(guān)的。以往的研究已經(jīng)證實(shí)TLR9的激活可以誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子，如IL-1、 IL-6、IL-10、IL-12 和 TNF-α等的大量釋放[15]。作者對(duì)其中的兩種，IL-1和 TNF-α進(jìn)行了檢測(cè)；它們?cè)赥LR9上調(diào)后的某一特定時(shí)段都表現(xiàn)為上調(diào)。這一結(jié)果間接支持作者關(guān)于TLR9參與了AP的推測(cè)。而且炎癥時(shí)TLR9通路的具體作用靶點(diǎn)或最終的調(diào)節(jié)產(chǎn)物尚無(wú)定論，有理由相信上述促炎細(xì)胞因子是其可能的下游產(chǎn)物。同時(shí)，為進(jìn)一步明確TLR9為促炎癥性因素，作者還對(duì)抑制炎癥的細(xì)胞因子IL-4進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，TLR9 mRNA表達(dá)在AP早期呈逐漸上調(diào)的表現(xiàn)的同時(shí)，作為具有抑制炎癥作用的細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)水平卻在短暫上調(diào)之后維持于接近基線的水平，這說(shuō)明TLR9在人類AP的發(fā)生、發(fā)展中可能確實(shí)是一種單純的促炎性細(xì)胞介質(zhì)。

3.3 AP病情輕重及預(yù)后與TLR9的相關(guān)性 通過(guò)分析本組AP患者的淀粉酶及脂肪酶走向與TLR9 mRNA表達(dá)水平，可以看出：在血清淀粉酶及脂肪酶濃度逐漸減低的時(shí)候TLR9 mRNA的表達(dá)水平是在繼續(xù)上調(diào)的。結(jié)合前述的判斷，TLR9在人類AP的發(fā)生、發(fā)展中是一種促炎性細(xì)胞介質(zhì)，本研究可以推測(cè)，TLR9的表達(dá)水平與人類AP的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后之間可能并沒(méi)有一種必然的聯(lián)系。

[1]Zeng YJ,Song JM,Li Y,et al.Toll-like receptor 9 is expressed in rat pancreas and is involved in cerulein-induced pancreatitis[J].Pancreas，2008，36:212-214.

[2]Wei T,Gong J,Rssle SC,et al.A leucine-rich repeat assembly approach for homology modeling of the human TLR5-10 and mouse TLR11-13 ectodomains[J].J Mol Model,2011,17(1):27-36.

[3]Akira S.Mammalian Toll-like receptors[J].Curr Opin Immunol,2003,15:5-11.

[4]Zhang W,Xu L,Qin J，et al.New Water-soluble cationic poly (p-phenylenevinylene)derivative:the interaction with DNA and selective fluorescence enhancement induced by ssDNA[J].Macromol Rapid Commun,2013,34(5):442-446.

[5]Liua J,Xua C,Liu YL,et al.Activation of rabbit TLR9 by different CpG-ODN optimized for mouse and human TLR9[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2012,35:443-451.

[6]Pan X,Yue J,Ding G,et al.Leucine-rich repeat 11 of TLR9 can tightly bind to CpG ODN and the positively charged residues are critical for the high affinity[J].J Biol Chem,2012,287(36):30596-30609.

[7]Kauppila JH,Korvala J,Siiril K,et al.Toll-like receptor 9 mediates invasion and predicts prognosis in squamous cell carcinoma of the mobile tongue[J].J Oral Pathol Med,2014,23(2):104-107.

[8]Kauppila JH,Karttunen TJ,Saarnio J，et al.Expression of Toll-like receptor-9 is associated with poor progression-free survival in prostate cancer[J].Oncol Lett，2013，5(5):1659-1663.

[9]van Geenen EJ，van der Peet DL，Bhagirath P，et al.Etiology and diagnosis of acute biliary pancreatitis[J].Nat Rev Gastroenterol Hepatol，2010，7(9):495-502.

[10]Nijmeijer RM,Schaap FG,Smits AJ，et al.Impact of global fxr deficiency on experimental acute pancreatitis and genetic variation in the FXR locus in human acute pancreatitis[J].PLoS One，2014，9(12):e114393.

[11]Deng YY,Wang R,Wu H,et al.Etiology,clinical features and management of acute recurrent pancreatitis[J].J Dig Dis，2014，15(10):570-577.

[12]Merrell A，Ilvesaro JM,Lehtonen N,et al.Toll-like receptor 9 agonists promote cellular invasion by increasing matrix metalloproteinase activity[J].Mol Cancer Res，2006，4(7):437-447.

[13]Xue J,Habtezion A.Carbon monoxide-based therapy ameliorates acute pancreatitis via TLR4 inhibition[J].J Clin Invest，2014，124(1):437-447.

[14]LindauD.The immunosuppressive tumour network:myeloid-derived suppressor cells,regulatory T cells and natural killer T cells[J].Immunology，2013，138(2):105-115.

[15]Ohto U,Yamakawa N,Akashi-Takamura S,et al.Structural analyses of human Toll-like receptor 4 polymorphisms D299G and T399I[J].J Biol Chem，2012，287(48):40611-40617.

Expression of TLR9 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of patients with acute pancreatitis*

ZengYujian1,2,LiuShuang3,SunLiang1,2,ShuRuo1,2,ShiChengmin1,2,GuoShujing1,2,FeiYida1,2,WangKunhua1,2,LuoHuayou1,2 △

(1.DepartmentofGastrointestinalSurgery;2.YunnanResearchInstituteofDigestiveDiseases；3.DepartmentofCadreHealth,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To investigate the expression of TLR9 mRNA of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) in patients with acute pancreatitis.Methods Fifty two AP patients with the disease duration in 24 h were collected,peripheral EDTAK2coagulation vein blood were collected on the first,third and fifth day,then plasma were cryop reserved to detect pancreatic elastase,proinflammatory cytokines and anti-inflammatory cytokines.Then the peripheral EDTAK2coagulation vein blood two to three months after treatment were collected in the same method to undertake these tests,and act as the reference level value.Peripheral blood was collected from 36 acute pancreatitis patients.Three months later,peripheral blood was collected again from these 36 people as controls.PBMCs were isolated by Ficoll-Hypaque gradient centrifugation.RT-PCR was adopted to determine the relative content of the expression of TLR9 mRNA of the PBMCs.Results The relative content of expression of TLR9 mRNA were significantly up-regulated in the patients with acute pancreatitis,compared with that of controls (P<0.05).The up-regulated expression of TLR9 mRNA was related to expression of TNF-a and IL-1.Conclusion The up-regulated expression of TLR9 mRNA in acute pancreatitis patients indicates that infective factors might be mediated by TLR9.

Toll-like receptor 9;acute pancreatitis;peripheral blood mononuclear cells

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.05.015

云南省教育廳基金(2010Y170)。 作者簡(jiǎn)介：曾玉劍(1975-)，講師，博士，主要從事胃腸腫瘤、疝和腹壁外科疾病、急性胰腺炎的臨床及研究工作。△

,E-mail：huayoul@aliyun.com。

R657.5

A

1671-8348(2015)05-0623-03

2014-10-08

2014-12-10)