陶 濤，秦新月，馮金洲，羅 華，李小剛

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科 400016；2.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科，四川瀘州 646000)

論著·基礎研究

米諾環(huán)素對PC12細胞缺氧缺糖損傷后神經突生長的影響*

陶 濤1，秦新月2△，馮金洲1，羅 華2，李小剛2

(1.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科 400016；2.瀘州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科，四川瀘州 646000)

目的 探討米諾環(huán)素對大鼠嗜鉻細胞瘤細胞(PC12)缺氧缺糖(OGD)損傷后細胞存活率及神經突生長的影響。方法 分別缺氧缺糖2、4、6 h及8 h建立PC12細胞OGD損傷模型，將細胞分為正常對照組，OGD組和不同濃度的(0.1、1.0 μM和10.0 μM)米諾環(huán)素治療組，在缺氧缺糖/復氧24 h后，用CCK-8法檢測細胞存活率，免疫熒光法標記MAP-2并在熒光顯微鏡下觀察神經突的生長，Western blot法檢測各組GAP-43蛋白的表達水平。結果 與OGD組比較，米諾環(huán)素能顯著提OGD后PC12細胞的存活率[(46.1±2.9)%vs.(77.0±2.5)%，P<0.01]，促進PC12細胞OGD損傷后神經突的生長，同時上調軸突再生蛋白GAP-43的表達[(0.34±0.04)vs.(2.11±0.10)，P<0.01]。結論 米諾環(huán)素能減輕OGD損傷所致PC12細胞的死亡，并促進細胞神經突的生長。

米諾環(huán)素；神經突生長；氧糖剝奪；PC12細胞

缺血性卒中是嚴重危害人類健康的疾病之一，其已成為成人致殘最主要的原因。成人中樞神經系統(tǒng)損傷后神經功能不能完全恢復是因為受損的神經元不能形成正確的軸突和樹突連接[1]。因此，不斷開發(fā)新的神經保護劑促進中樞神經系統(tǒng)損傷后神經元軸突的再生，是目前醫(yī)學界研究的熱點問題。米諾環(huán)素是一種高脂溶性的第二代四環(huán)素類抗菌藥物，除了抗菌作用以外，還具有抗炎癥、抗凋亡及抗氧化應激等神經保護作用[2]。近期一項研究表明米諾環(huán)素能強化神經生長因子誘導PC12細胞神經突的生長[3]。但是米諾環(huán)素是否能促進PC12細胞缺氧缺糖損傷后神經突的生長，目前尚無相關報道。本研究通過體外培養(yǎng)PC12細胞，建立細胞缺氧缺糖(oxygen glucose deprivation,OGD)模型，觀察米諾環(huán)素對PC12細胞OGD損傷的保護作用及神經突生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 PC12高分化細胞株購于中國科學院上海細胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、DMEM無糖培養(yǎng)基購自美國Gibico公司；鹽酸米諾環(huán)素購自Sigma公司；GAP-43抗體和MAP-2抗體購自Santa Cruz公司；β-actin抗體購自北京四正柏公司；全蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物公司；Dylight594標記的羊抗兔抗體、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL-Plus顯影試劑盒及CCK-8試劑盒均購于碧云天生物技術研究所。另有儀器Thermo Forma3131 CO2培養(yǎng)箱，Nikon SMZ-10A和FDX-35熒光倒置顯微鏡和熒光顯微照相系統(tǒng)。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組 PC12細胞用DMEM完全培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/L鏈霉素)，置于37 ℃，5% CO2及飽和濕度的孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。隔天換液，待細胞鋪滿瓶底80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，收獲第5～8代PC12細胞用于以下實驗。取處于對數生長期的PC12細胞以2×105/mL,每孔100 μL接種在96孔板(CCK-8實驗)，每孔1 mL接種在24孔板(神經突測定)，以1×106/mL密度接種于75 cm2培養(yǎng)瓶(Western blot檢測)。細胞分為3組：正常對照組、OGD組、米諾環(huán)素治療組。

1.3 細胞OGD模型的建立及藥物干預 參照并改進本課題組前期報道的培養(yǎng)方案。當細胞培養(yǎng)12 h后，用PBS清洗3遍，加入無血清無糖DMEM培養(yǎng)基，并將細胞置于含5% CO2，94% N2，1% O2，37 ℃的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，然后加入無血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，置于恒溫孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h模擬缺糖缺氧再灌注。正常對照組全過程加入無血清高糖DMEM培養(yǎng)基，置于正常培養(yǎng)箱培養(yǎng)。不同濃度的米諾環(huán)素(0.1、1.0、10.0 μM)在OGD及再復氧的全過程加入。

1.4 CCK-8法檢測PC12細胞存活率 復氧24 h后，在96孔培養(yǎng)板每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，在ELX-800全自動酶標儀(Bio-TEK)上測定各孔在450 nm波長處的吸光度(OD)值。每組6孔，重復3次實驗。以正常對照組CCK-8吸光值為基數100%，OGD組及藥物干預組細胞存活率按公式計算：細胞存活率(%)=處理組平均OD值/正常對照組平均OD值×100%。

1.5 免疫細胞熒光測定神經突長度 將蓋玻片置于24孔板中，每組設置3個復孔。室溫下使用2% 多聚甲醛固定10 min，0.1% Triton X-100破膜30 min，山羊血清封閉30 min，兔抗大鼠MAP-2多克隆抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜，PBS清洗3遍后加入Dylight 594山羊抗兔(1∶150)，37 ℃避光孵育1 h，DAPI(1∶50)避光反應5 min，50% 甘油封片后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。使用Image-Pro Plus 6.0軟件對PC12細胞神經突長度進行測定，每次實驗在200倍熒光顯微鏡下隨機選取10個視野，每組至少選取50個細胞進行測量，實驗重復3次，計算各組神經突長度的平均值。

1.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測GAP-43蛋白表達 復氧24 h 后，收集各組細胞，按照凱基全蛋白提取試劑盒說明書提取細胞蛋白，同時用BCA試劑盒測定蛋白濃度。取等量蛋白經二十烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，采用濕轉法將蛋白轉移至0.45 μM聚偏氟乙烯(PDVF)膜上(250 mA恒流，1 h)，5 %脫脂牛奶封閉1.5 h后加入兔抗GAP-43(1∶200)，小鼠抗β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔或羊抗小鼠(1∶3 000)，37 ℃孵育1.5 h。采用ChemiDocTM凝膠掃描成像系統(tǒng)顯微拍照，Quantity One圖像分析軟件測定各條帶的灰度值，蛋白的相對含量以目的蛋白與內參灰度值的比值表示。

2 結果

2.1 不同缺氧缺糖時間對PC12細胞存活率的影響 CCK-8法測得OGD(2、4、6、8 h)后，PC12細胞的存活率呈時間依賴性下降。OGD 2 h及8 h時，PC12細胞的存活率分別為(80.2±2.7)%，(7.3±1.9)%，OGD 6 h時，PC12細胞的存活率為(46.1±2.9)%，接近50%。因此，本實驗選取OGD 6 h作為體外PC12細胞OGD時間，用于探討米諾環(huán)素對PC12細胞OGD損傷的保護作用。見圖1。

2.2 米諾環(huán)素對PC12細胞OGD損傷后細胞存活率的影響 CCK-8結果顯示，不同濃度米諾環(huán)素(0.1、1.0、10.0 μM)可提高OGD損傷后PC12細胞的存活率(70.7±2.9)%、(77.0±2.5)%、(55.8±2.5)%，與OGD組[(46.1±2.9)%]比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中1.0 μM作用最明顯，用于后續(xù)的研究。米諾環(huán)素對正常培養(yǎng)細胞的存活率無促進作用。見圖2。

a：P<0.01，與正常對照組比較。

a：P<0.01，與正常對照組比較；b：P<0.01，與OGD組比較。

2.3 米諾環(huán)素促進PC12細胞神經突的生長 熒光顯微鏡下觀察可見，正常對照組PC12細胞呈梭形，細胞兩極有明顯的突起，OGD組PC12細胞呈梭形，神經突回縮，而各濃度米諾環(huán)素治療組相對于OGD組，PC12細胞神經突長度增加(P<0.01)，其中1.0 μM米諾環(huán)素對PC12細胞神經突生長的促進作用最強。見圖3。

A：正常對照組；B:OGD組；C:米諾環(huán)素組(1.0 μM)。

圖3 米諾環(huán)素對PC12細胞OGD損傷后神經突生長的影響(200×)

2.4 米諾環(huán)素促進PC12細胞GAP-43蛋白的表達 為進一步驗證米諾環(huán)素對PC12細胞OGD損傷后神經突生長的影響，Western blot法測定軸突再生相關蛋白GAP-43的結果顯示，正常對照組PC12細胞GAP-43蛋白呈基礎表達(0.40±0.04)，0.1、1.0、10.0 μM米諾環(huán)素治療組GAP-43的表達水平(1.17±0.08、2.11±0.10、1.94±0.11)均明顯高于OGD組(0.34±0.04)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。

a：P<0.01，與OGD組比較。

圖4 各組PC12細胞GAP-43蛋白的表達水平

3 討論

本研究發(fā)現，采取OGD 6 h再復氧復糖法能有效模擬腦缺血再灌注損傷的體外模型。低劑量米諾環(huán)素(0.1、1.0、10.0 μM)能有效提高PC12細胞OGD損傷后的存活率，同時能顯著促進PC12細胞的軸突生長。

成年哺乳動物中樞神經系統(tǒng)損傷后軸突再生困難，導致嚴重而持久的神經功能缺損。缺血損傷后促進神經元的軸突再生，形成新的突觸聯(lián)系和神經環(huán)路，促進神經網絡的重建從而改善神經功能。本研究首先建立PC12 細胞OGD模型，CCK-8法測得OGD 6 h后PC12細胞的病死率約為54%。米諾環(huán)素是一種第二代四環(huán)素類衍生物，它具有抗菌和抗炎活性并被臨床實踐證實為一種治療粉刺和關節(jié)炎的安全藥物。米諾環(huán)素具有高脂溶性，能有效地通過血腦屏障從而在顱腦損傷，卒中，脊髓損傷，神經退行性疾病如肌萎縮性側索硬化、帕金森病、亨廷頓病及多發(fā)性硬化等疾病的動物模型中發(fā)揮神經保護作用。大量研究表明米諾環(huán)素具有抗炎、抗凋亡、抗氧化應激及血管保護作用[4-5]。米諾環(huán)素在神經疾病的病理生理過程中具有以下生物活性：抑制小膠質細胞的增殖及活化，從而使細胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6的分泌降低，同時還可以抑制脂質的分泌和基質金屬蛋白酶的活性[6]；通過caspases非依賴途徑上調抗凋亡因子Bcl-2的表達[7-8]及調控環(huán)氧化酶2(COX-2)，誘導一氧化氮合酶(iNOS)和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)的活性[9]。本研究發(fā)現米諾環(huán)素能緩解OGD對PC12細胞的損傷，使細胞存活率提高達56%～77%。與Chen等[10]研究結果類似，而米諾環(huán)素(0.1～10.0 μM)對正常PC12細胞存活率無影響(數據未發(fā)布)。

近期研究表明米諾環(huán)素能強化神經生長因子誘導PC12細胞神經突的分化[3]，并且促進大鼠局灶性腦缺血后皮質神經元軸突的再生，改善大鼠神經功能[11]。2007年，Lampl等[12]開展的一項臨床研究表明急性缺血性卒中患者，早期給予口服米諾環(huán)素治療可以改善患者的神經功能缺失評分和生活能力狀態(tài)分級評分。本研究發(fā)現，OGD損傷使PC12細胞神經突回縮，而米諾環(huán)素能促進OGD損傷后的細胞神經突長度增加。GAP-43廣泛表達在神經組織，被認為是神經元發(fā)育和再生的一種標志蛋白，對軸突生長和突觸形成具有重要作用。本實驗進一步發(fā)現，米諾環(huán)素能上調PC12細胞OGD損傷后GAP-43蛋白的表達。

綜上所述，米諾環(huán)素對PC12細胞OGD損傷具有神經保護作用，可促進細胞神經突長度的增加，并能上調軸突再生相關蛋白GAP-43的表達，為缺血性腦血管病的神經康復治療提供新的途徑，但具體機制尚需進一步研究。

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Effects of minocycline on neurite outgrowth of PC12 cells following oxygen glucose deprivation*

TaoTao1,QinXinyue2△,FengJinzhou1,LuoHua2,LiXiaogang2

(1.DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China;2.DepartmentofNeurology,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege,Luzhou,Sichuan646000,China)

Objective To investigate the effects of minocycline on cell viability and neurite outgrowth of pheochromocytoma cells(PC12) after oxygen-glucose deprivation(OGD) injury.Methods PC12 cells were exposed to OGD insult for 2,4,6,8 h to establish a cerebral ischemia model in vitro.High-differentiated PC12 cells were cultivated and randomly divided into three groups:control group,OGD group and various doses of minocycline(0.1,1.0,10.0 μM) treated group.24 h after OGD-reperfusion,PC12 cells viability was assessed by CCK-8 assay,the neurite was labeled with MAP-2 by immunofluorescence and neurite length was measured by the Image-Pro Plus 7.0 software,GAP-43 protein expression was determined by Western blotting.Results Compared to the OGD groups,minocycline induced a concentration-dependent increase in cells viability[(46.1±2.9)%vs.(77.0±2.5)%，P<0.01],improved neurite outgrowth and increased the expression of GAP-43 protein in PC12 cells after OGD injury([(0.34±0.04)vs.(2.11±0.10)，P<0.01].Conclusion Minocycline could protect against oxygen glucose deprivation injury and promote neurite outgrowth.This finding suggests minocycline may be a novel therapy for cerebral ischemia.

neurite outgrowth;minocycline;oxygen glucose deprivation;PC12 cell

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.05.009

四川省衛(wèi)生計生委資助項目(140032)；瀘州市科技計劃項目(2014S4506)；瀘醫(yī)附院青年基金(博士)資助項目(14046)。作者簡介：陶濤(1984-)，講師，博士，主要從事腦血管疾病的基礎與臨床研究?！?/p>

,E-mail：qinxinyue2011@sina.com。

R743.31

A

1671-8348(2015)05-0605-03

2014-10-12

2014-12-15)