李光第，宋 恩，趙學凌，白云城，彭 志，周如丹

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科，昆明 650032)

論著·基礎(chǔ)研究

白細胞介素-18與深靜脈血栓疾病的相關(guān)性研究

李光第，宋 恩，趙學凌，白云城，彭 志，周如丹△

(昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院骨科，昆明 650032)

目的 探討白細胞介素-18(IL-18)的表達變化與深靜脈血栓疾病(DVT)發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性及臨床意義。方法 收集臨床DVT病例(DVT組，n=40)、實驗對照組(n=40)、健康對照組(n=20)的血液，以ELISA法檢測其中IL-18的表達并分析差異；培養(yǎng)原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)行目標蛋白免疫熒光檢測明確其定位；構(gòu)建人IL-18過表達和干擾病毒載體(IL-18-pCDH-GFP、IL-18-LMP-shRNAmir1)感染HUVECs并進行基因表達譜芯片檢測和KEGG Pathway等生物信息技術(shù)，分析IL-18與疾病的相關(guān)性。結(jié)果 人血ELISA檢測發(fā)現(xiàn)在DVT組和兩對照組中IL-18 的表達差異均有統(tǒng)計學意義(F=11.248，P<0.01)；實驗對照組與健康對照組之間IL-18 的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；免疫熒光檢測顯示目標蛋白定位于細胞質(zhì)；人IL-18過表達和干擾載體經(jīng)病毒轉(zhuǎn)染后感染HUVECs；基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)與正常細胞比較，過表達載體IL-18-pCDH-GFP感染細胞有17條信號通路下調(diào)、16條上調(diào)；干擾載體IL-18-LMP-shRNAmir1感染細胞有23條信號通路下調(diào)、9條上調(diào)。結(jié)論 IL-18對HUVECs有確切影響，同時與DVT疾病密切相關(guān)，有希望作為深靜脈血栓疾病臨床預測診斷的候選分子標記物。

靜脈血栓形成；白細胞介素18；分子標記物；人臍靜脈內(nèi)皮細胞

深靜脈血栓(deep venous thrombosis，DVT)的診斷主要依賴影像學和有限的實驗室檢查,在血栓形成之后方能明確，以致無法針對性地進行預防和治療。如能預測診斷，可實現(xiàn)更有針對性的預防、更早有效地治療，減少危害。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，DVT疾病中炎癥細胞因子的參與及其在早期瀑布式反應(yīng)中重要的激活作用得到廣泛關(guān)注，越來越多的證據(jù)表明，炎性反應(yīng)在靜脈血栓疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了關(guān)鍵的作用[1]。白細胞介素-18(interleukin-18，IL-18)是上世紀90年代末發(fā)現(xiàn)的前炎癥細胞因子[2-3]，它參與體內(nèi)炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過程，尤其是在促進炎性細胞因子釋放及細胞因子之間相互作用方面具有重要作用。本文對IL-18與下肢DVT的相關(guān)性進行研究，通過臨床患者血中IL-18基因ELISA檢測初步探討疾病相關(guān)性，隨后進一步行細胞及分子生物學實驗研究，結(jié)合基因芯片等生物信息學手段，為IL-18與DVT發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性的研究提供有效證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般資料 本院2012～2013年骨科、血管外科、呼吸內(nèi)科等相關(guān)科室中DVT病例40例、實驗對照組40例、健康對照組20例，共100例血液標本。參考《靜脈血栓栓塞癥預防的NICE指南》(2012年)和《美國胸科醫(yī)師協(xié)會抗栓與血栓預防臨床實踐指南-深靜脈血栓形成的診斷》(2012年第9版)制訂DVT診斷標準。DVT組：符合臨床診斷標準的下肢DVT患者；實驗對照組：骨科人工關(guān)節(jié)置換、脊柱術(shù)后無血栓診斷患者；健康對照組：健康志愿標準。為控制非試驗因素干擾和影響，各組納入者滿足(1)年齡大于15歲；(2)無家族遺傳性血栓病史；(3)無自身免疫性疾病、急性炎癥、全身免疫反應(yīng)綜合征(SIRS)、腫瘤、懷孕等；(4)未服用抗凝藥物。

1.2 材料 ELISA試劑盒購于Ebioscience公司；過表達慢病毒載體及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體購于Ambion公司；轉(zhuǎn)染試劑購于Qiagen公司；TRIzol、二抗IgG-HRP購于Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Fermentas公司；瓊脂糖凝膠電泳試劑購于Omega公司；熒光定量引物由Invitrogen公司合成；熒光定量試劑盒購于Fermentas公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜購于Millipore公司；一抗購于Santan和康為公司；ECL顯色試劑盒、Real-time PCR用96孔板及膜購于Bio-Rad公司。各規(guī)格離心管、槍尖、PCR管購于Axygen公司;X光片購于柯達公司；人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)原代及傳代培養(yǎng)耗材購于Corning公司。

1.3 收集血清 無抗凝劑生化管/EDTA真空采血管收集空腹靜脈血3～4 mL，3 000 r/min，4 ℃離心10 min。分離血清/血漿，凍存管-80 ℃保存。

1.4 ELISA檢測IL-18 ELISA檢測步驟按Ebioscience試劑盒說明書標準操作。按試劑盒標準品繪制標準曲線。標準曲線方程為Y=0.000 8X+0.009 5其中X為吸光度值、Y為濃度對數(shù)，可據(jù)其計算樣本實際濃度。預實驗隨機選擇1個樣本進行梯度稀釋(100、200、400及800倍)，稀釋后OD值依次為：0.876 9、0.413 2、0.097 6、0.001 3；可見稀釋200倍OD值在標準曲線范圍，是最佳血清稀釋濃度。

1.5 HUVECs細胞培養(yǎng)及免疫熒光檢測 原代HUVECs組在37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。免疫熒光檢測：HUVECs制成2×104/mL細胞懸液，制作細胞爬片；以抗人IL-18孵育，F(xiàn)ITC標記二抗與之結(jié)合，激光共聚焦熒光顯微鏡拍照觀察IL-8蛋白在HUVECs中的定位，設(shè)置3次平行實驗。

1.6 人IL-18慢病毒過表達載體構(gòu)建 通過GenBank數(shù)據(jù)庫搜索人IL-18基因完整CDS序列，Primer5.0軟件設(shè)計特異性引物(正向引物:5′-GCA AGC TTA TGC CTT GTG TTC AGG CG-3′，反向引物:5′-GCC TCG AGT TAG AAA GGT AAG GTG TC-3′，產(chǎn)物長度582 bp，退火溫度60 ℃)，對人IL-18基因進行PCR擴增。然后進行膠回收實驗，再行瓊脂糖凝膠電泳檢測；收集膠回收的目的片段和質(zhì)粒載體進行連接，以pCDH-GFP為測序引物進行測序。

1.7 人IL-18逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾載體構(gòu)建 逆轉(zhuǎn)錄病毒Oligo片段擴增：搜索GenBank中人IL-18基因序列，利用Oligoengine設(shè)計2條22個堿基的候選siRNA靶序列，再根據(jù)MSCV-LMP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點，設(shè)計出相應(yīng)的具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的shRNA模板。將設(shè)計片段送生物工程合成部合成Oligo片段并按比例稀釋，用規(guī)定引物(正向引物:5′-CAG AAG GCT CGA GAA GGT ATA TTG CTG TTG ACA GTG AGC G-3′，反向引物：5′-CTA AAG TAG CCC CTT GAA TTC CGA GGC AGT AGG CA-3′，退火溫度52 ℃)進行PCR反應(yīng)擴增。干擾片段擴增后，進行膠回收實驗，再進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。把膠回收的目的片段和質(zhì)粒載體進行連接，以LMP為測序引物進行測序。

1.8 過表達及抑制效率檢測

1.8.1 過表達/干擾載體病毒包裝、感染 病毒宿主細胞為293T細胞，HUVECs為感染細胞。pCDH-GFP(12.0 g)的包裝質(zhì)粒為pCL-ECO，用量8.0 g；轉(zhuǎn)染人IL-18-pCDH-GFP過表達質(zhì)粒(過表達組)，正常和轉(zhuǎn)染空載體細胞分別作為實驗對照組和正常對照組。MSCV-LMP(12.5 g)包裝質(zhì)粒分別是：pAPAX(7.5 g)、pMD2.G(5 g)；分別轉(zhuǎn)染人IL-18-LMP shRNAmir1、2(干擾1、2組)，正常和轉(zhuǎn)染空載體細胞分別作為實驗對照2組和正常對照組；總感染48～72 h后，通過載體熒光觀察感染效率，并抽提點RNA。

1.8.2 real-time PCR測定mRNA水平 TRIzol(Invitrogen)抽提細胞總RNA；依據(jù)RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)試劑盒標準操作進行cDNA合成。通過GenBank基因數(shù)據(jù)庫搜索基因的完整mRNA序列，用BLAST分析尋找特異性引物，引物設(shè)計軟件為primer 5.0，以人-actin基因為內(nèi)參(IL-18 正向引物:5′-TCA AGA CCA GCC TGA CCA ACA-3，反向引物:5′-CTC ACC ACA ACC TCT ACC TCCG-3′，152 bp；β-actin 正向引物:5′-ACG GCA AGT TCA ACG GCA CAG--3′，反向引物:5′-GAC GCC AGT AGA CTC CAC GACA-3′，180 bp)。熒光定量PCR檢測相對表達量，依據(jù)MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×)(Fermentas)操作。將引物稀釋至10 μM；設(shè)計96孔板上樣順序，每個樣品做3個重復，用水為模板作陰性對照；real time PCR擴增儀進行實驗。結(jié)果分析：觀察熔解曲線和擴增曲線，用軟件DataAssistTMv3.0 Software(ABI)以2-ΔΔCt方法對結(jié)果進行分析。ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

1.8.3 蛋白水平測定 細胞總蛋白提?。菏占鹘MHUVECs后添加含PMSF(Sigma公司)的RIPA裂解液(Beyotime)，冰浴30 min；4 ℃，12 000 r/min離心5 min；取上清液，用BCA法測定計算蛋白濃度。蛋白印跡法(Western blot)分析目標蛋白的表達情況，Bio-Rad膜成像系統(tǒng)下顯色成像并用Quantity One軟件對比分析。

1.9 人IL-18細胞系過表達沉默后轉(zhuǎn)錄譜變化 按前文轉(zhuǎn)染步驟進行實驗，收獲轉(zhuǎn)染了人的IL18-LMP-shRNAmir1、IL18-pCDH-GFP的細胞和未轉(zhuǎn)染細胞作為對照，提取總RNA，進行基因表達譜芯片分析，每樣品1張芯片，共3個基因芯片；樣本送至康成生物進行基因芯片檢測。

2 結(jié)果

2.1 ELISA檢測人血中IL-18的表達情況 檢測100例血清樣品中IL-18基因的水平，編號1～40為DVT組、41～80為實驗對照組、81～100為正常對照組。單因素方差分析顯示：DVT組IL-18檢測值明顯高于兩對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.001)；兩對照組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 人IL-18在各組中的差異

a：P<0.05，與DVT組比較。

2.2 HUVECs培養(yǎng)及免疫熒光檢測 培養(yǎng)原代HUVECs并進行傳代。早期細胞貼壁多呈小三角形、球形，少數(shù)細胞伸展呈短梭型，單個或團簇存在；此后細胞呈單層，互不重疊，呈鋪路石樣排列。HUVECs細胞爬片重復3次免疫熒光均顯示IL-18目標蛋白定位于HUVECs細胞質(zhì)，見圖1。

圖1 免疫熒光激光共聚焦檢測(×800)

2.3 人IL-18基因慢病毒過表達載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾載體構(gòu)建

2.3.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒過表達載體構(gòu)建 PCR擴增人IL-18基因，瓊脂糖電泳清晰可見單一的目的條帶；本研究選取慢病毒載體pCDH-GFP中，EcoRⅠ和BamHⅠ兩個酶切位點來連接載體與目的基因。人IL-18-pCDH-GFP的測序結(jié)果，經(jīng)NCBI中的BLAST在線工具比對，均為正確序列。

2.3.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒干擾載體構(gòu)建 據(jù)逆轉(zhuǎn)錄病毒LMP質(zhì)粒載體特點，選XhoⅠ和EcoRⅠ酶切位點進行連接；擴增人IL-18-LMP-shRNAmir1、2干擾載體，SacⅡ/XhoⅠ雙酶切后酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測；條帶在985 bp/7 019 bp表明已插入目的條帶，屬于陽性克隆。陽性克隆送上海生工測序部測序鑒定。人IL-18-LMP-shRNAmir1、2干擾載體測序結(jié)果，以NCBI中的BLAST在線工具比對測序結(jié)果，均為正確序列。

2.4 過表達及抑制效率檢測

2.4.1 病毒包裝及感染 包裝和轉(zhuǎn)染病毒48 h及72 h分別收集兩次病毒原液，用病毒原液2～5 mL感染宿主細胞，48 h后觀察感染情況；磷酸鈣轉(zhuǎn)染法在293T細胞長包裝病毒的轉(zhuǎn)染效率可以達到90%，甚至更高；病毒收集后，感染宿主細胞的感染效率可達80%以上；載體都攜帶綠色熒光蛋白標簽，可見實驗轉(zhuǎn)染及感染均呈高效。

圖2 real-time PCR檢測基因的表達水平

2.4.2 real-time PCR結(jié)果 2-ΔΔCt法分析待測基因在實驗各組間的相對表達量差異倍數(shù)。組間比較結(jié)果顯示，IL-18在過表達組的表達情況明顯高于正常對照組及干擾1、2組(P<0.05)，而干擾1組明顯低于其余組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.4.3 蛋白印跡檢測結(jié)果 采用Quantity One軟件對膜成像系統(tǒng)拍下的Western blot結(jié)果圖片進行分析，讀取條帶相應(yīng)光密度值后，根據(jù)公式：相對表達水平(ratio)=目標蛋白/β-actin進行計算，結(jié)果顯示IL-18表達水平在過表達組中明顯增高，干擾1組中明顯減低，見圖3、表2。以正常對照組為1，分別計算其他處理組與正常對照組的比值，得到目的基因相對過表達率，見圖4。

1:正常組；2:過表達組；3:干擾1組；4:干擾2組。

圖3 IL-18的蛋白表達水平

表2 Western blot檢測IL-18蛋白的相對表達水平

圖4 目的基因相對過表達率

1:正常人靜脈內(nèi)支細胞；2:IL-18-PCDH-GFP轉(zhuǎn)梁細胞；3:IL-18-LMP shRNA-Amir1轉(zhuǎn)染細胞。

圖5 基因芯片熱譜圖

2.5 人IL-18細胞系過表達或沉默后轉(zhuǎn)錄譜變化 根據(jù)real-time PCR和Western blot實驗結(jié)果，選取過表達組、干擾1組、正常對照組細胞進行基因表達譜芯片分析，每樣品做1張芯片，共3個基因芯片。圖5為基因芯片檢測到的所有表達變化的基因熱譜圖，其中紅色表示相對高表達，綠色代表相對低表達。同時根據(jù)KEGG Pathway分析過表達組及干擾1組與正常對照組比較發(fā)現(xiàn)：過表達組細胞上調(diào)的基因共164個、涉及16條信號通路；下調(diào)的基因共177個、涉及17條信號通路。干擾1組細胞上調(diào)的基因有94個、涉及9條信號通路；下調(diào)的基因有290個、涉及23條信號通路。

3 討論

DVT是一種多因素疾病，包括致病基因、基因突變及基因間相互影響和炎性反應(yīng)中細胞因子的相互作用、凝血功能等諸多方面。靜脈血栓形成的復雜因素中，內(nèi)皮細胞、血小板、炎癥因子參與等諸多方面已成為DVT疾病研究的熱點。國內(nèi)外炎癥與血栓相關(guān)研究主要集中于動脈疾病，研究炎癥與靜脈血栓形成間的相互作用機制仍在探索，相關(guān)文獻報道甚少。炎性反應(yīng)一方面有防御性的保護作用；另一方面炎癥過于強烈時，則可使損傷放大、加重，產(chǎn)生序列性連鎖反應(yīng)引發(fā)血栓性疾病[4-6]。血栓形成的局部微環(huán)境中，受損內(nèi)皮分泌趨化因子，趨化白細胞到達炎癥區(qū)域參與炎性反應(yīng)，并分泌IL-1、IL-6、TNF-α等炎性介質(zhì)促進血栓形成[7]。炎癥因子與血栓的形成有較為密切的關(guān)系[8]。血栓形成過程中，炎癥細胞分泌多種細胞因子和炎癥介質(zhì)作用于內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)[9]，可刺激內(nèi)皮細胞，誘發(fā)組織因子表達，激活凝血途徑，引起炎癥使體內(nèi)C-反應(yīng)蛋白(CRP)含量增加，形成循環(huán)相加效應(yīng)。

IL-18是上世紀90年代末新發(fā)現(xiàn)的前炎癥細胞因子，具有多種生物學活性和功能，它參與炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)過程，尤其是對促炎性細胞因子釋放及細胞因子相互作用具有重要意義。發(fā)現(xiàn)至今，國內(nèi)外IL-18的相關(guān)研究主要集中于心血管系統(tǒng)疾病進展和發(fā)病機制等領(lǐng)域，已取得一定成果；然而關(guān)于IL-18與DVT相關(guān)性研究，國內(nèi)外一直罕見報道。研究共收集DVT患者、實驗對照組及正常對照組100例血液樣本。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)DVT組較兩對照組血清中IL-18的水平明顯增高，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。據(jù)研究結(jié)果可見IL-18在創(chuàng)傷、手術(shù)等情況下，血液檢測較健康人有一定程度增高；臨床確診的下肢DVT患者血液中IL-18表達水平明顯上升，說明其與下肢DVT疾病有明確的相關(guān)性。IL-18可誘導T淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞生成IFN-γ，而IFN-γ可以抑制血管平滑肌的增殖、生長及膠原合成，促使SMC吞噬(OX-LDL)增多；還可以誘導血管內(nèi)皮細胞表達細胞間黏附分子(VCAM)和血管內(nèi)皮黏附因子(ICAM)，促進血管和細胞、細胞和細胞間黏附，加速疾病發(fā)展[10]。Chandrasekar等[11]研究表明心臟微血管內(nèi)皮細胞(HCMEC)存在IL-18表達，并可以激活細胞凋亡信號通路誘導內(nèi)皮細胞凋亡，引起心肌炎癥性病變和損傷。許多早期炎性反應(yīng)在造血與非造血系細胞中IL-18可以被檢測到，已有報道巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、中性粒細胞、樹突細胞、NK細胞、角質(zhì)細胞等中均有IL-18表達[12-15]。

本研究進行了臨床患者血樣的IL-18檢測，為后期細胞、分子層面等機制研究提供有效實驗證據(jù)。臨床血樣研究發(fā)現(xiàn)IL-18和下肢DVT疾病有明確相關(guān)性，有望成為DVT預測、診斷、疾病研究的分子標記物。因此，本研究繼續(xù)對IL-18作為DVT疾病標記物在分子、細胞水平上進行探索。實驗進行了IL-18與HUVECs的相關(guān)研究，免疫熒光檢測證實IL-18定位與HUVECs細胞質(zhì)中。隨后構(gòu)建IL-18-pCDH-GFP慢病毒過表達載體和IL-18-LMP-shRNAmir1、2逆轉(zhuǎn)錄病毒抑制載體轉(zhuǎn)染HUVECs，用real-time PCR和Westen blot對轉(zhuǎn)染/感染率進行檢測，選定較為理想的IL-18-pCDH-GFP和IL-18-LMP-shRNAmir1感染HUVECs進一步行基因表達譜芯片檢測。基因芯片檢測結(jié)果結(jié)合KEGG Pathway分析與正常HUVECs比較：過表達載體感染細胞上調(diào)基因共164個，涉及16條信號通路；干擾載體感染細胞下調(diào)基因有290個，涉及23條信號通路。IL-18是具有多向生物學活性和功能的細胞因子，不僅在心血管疾病、免疫性疾病、腫瘤疾病、胃腸系統(tǒng)疾病以及呼吸系統(tǒng)疾病等多種疾病[16-20]的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。大量研究證實內(nèi)皮細胞受損后與靜脈內(nèi)血栓性疾病聯(lián)系緊密，本研究進行了臨床血樣檢測、細胞分子層面的初步探索，研究結(jié)果證實IL-18的過表達及抑制等變化對HUVECs正常功能有確切影響，說明其與下肢DVT疾病的發(fā)生、發(fā)展存在聯(lián)系，然而其作用機制至今尚未闡明。其表達變化與DVT疾病的相互關(guān)系仍需進一步探討，針對其生物活性、作用及調(diào)節(jié)機制等仍有待深入研究。深靜脈血栓疾病的預測診斷、病程進展機制等是國內(nèi)外研究者的關(guān)注熱點，而IL-18是值得關(guān)注的炎癥細胞因子，可為探尋疾病早期診斷分子標記物提供新的選擇。

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Correlation between interleukin-18 and deep venous thrombosis disease

LiGuangdi,SongEn,ZhaoXueling,BaiYuncheng,PengZhi,ZhouRudan△

(DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650032,China)

Objective To investigate the correlation between IL-18 and deep venous thrombosis disease and its clinical signification.Methods To detect the expression of IL-18 by ELISA，we collected the blood samples of DVT patients as the experimental group(n=40) compared to the control group(n=40) and normal group(n=20).IL-18 over expression/interference vectors were constructed and transfected human vein endothelial cells,analyzed by microarray and KEGG Pathway as biology information technology.Then discuss the association between IL-18 and DVT.Results Results of ELISA showed that compared with control group and normal group,the expression of IL-18 gene in DVT patient were up-regulated(F=11.248，P<0.01).Compared with normal group,the IL-18 expression in control group have not been significantly up-regulated(P>0.05).Immunofluorescence detected IL-18 gene expression in cytoplasm of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs).According to the microarray analysis we found in the IL18-pCDH-GFP transfected cells 17 signaling pathways were down-expressed while 16 signaling pathways were up-expressed.Compared with normal group cells,in the IL18-LMP-shRNAmir1 transfected cells 23 signaling pathways were down-expressed and 9 signaling pathways were up-expressed.Conclusion Based on the above experimental data,it is very clear that IL-18 influenced HUVECs and plays an important role in DVT,it is possible to predict the diagnosis of DVT and act as candidate molecular markers.

deep venous thrombosis;interleukin-18;biomarker;human umbilical vein endothelial cells

李光第(1981-)，住院醫(yī)師，博士，主要從事骨科常見疾病、深靜脈血栓疾病的基礎(chǔ)與臨床研究?！?/p>

,E-mail：kittypku@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.05.008

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1671-8348(2015)05-0600-05

2014-11-08

2014-12-10)