郭亞平，朱 紅，付茂勇，王朝莉，李倩倩，胡為民,△

(1.川北醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸心外科，

四川南充 637000；3.川北醫(yī)學院免疫學與分子生物學研究所，四川南充 637000)

論著·基礎(chǔ)研究

Nek8在食管鱗癌中的表達及意義*

郭亞平1，朱 紅1，付茂勇2，王朝莉3，李倩倩1，胡為民1,3△

(1.川北醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室，四川南充 637000；2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸心外科，

四川南充 637000；3.川北醫(yī)學院免疫學與分子生物學研究所，四川南充 637000)

目的 探討食管鱗癌組織和細胞系中Nek8的表達及其與食管鱗癌臨床病理特征和術(shù)后生存的關(guān)系。方法 采用RT-PCR法檢測食管鱗癌細胞系Eca109細胞、2例配對的食管鱗癌組織和癌旁黏膜上皮中Nek8 mRNA表達情況；應(yīng)用免疫組織化學法檢測Nek8蛋白在食管鱗癌組織芯片中的表達情況，并結(jié)合臨床病理資料和生存率進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果 Nek8 mRNA在Eca109細胞、2例食管鱗癌患者的癌組織均有表達，而癌旁食管黏膜上皮中均未見明顯的表達。組織芯片結(jié)果示Nek8蛋白主要表達于細胞質(zhì)，在78例配對的標本中，Nek8在食管鱗癌組織中的表達顯著高于其在癌旁黏膜組織的表達(P=2.16E-13)。其表達與腫瘤大小有關(guān)(P=0.008)，而與性別、年齡、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。生存分析顯示高表達和低表達Nek8的患者生存率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論 Nek8在食管鱗癌組織和細胞中表達上調(diào)，可能參與了食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展，可作為診斷的標志物和治療的靶點。

免疫組織化學；Nek8；食管鱗癌；Eca109細胞

食管癌是世界第八大常見人類腫瘤，其病死率居癌癥死因的第6位[1]。我國是食管癌發(fā)病率和病死率最高的國家，其發(fā)病率居惡性腫瘤的第4位。我國食管癌的發(fā)病率有明顯的地區(qū)分布特點，其中，研究者所在的川東北地區(qū)是高發(fā)區(qū)之一。食管癌的形成是多因素作用、多基因變化和多階段發(fā)展的過程，篩選和確定與食管癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子和信號通路，以及他們之間的互作關(guān)系，將為食管癌的發(fā)病機制、診斷、治療、預(yù)后判斷提供科學依據(jù)。1項食管癌相關(guān)的研究中，作者發(fā)現(xiàn)Nek8基因在食管鱗癌細胞系Eca109細胞中高表達，而正常食管黏膜上皮不表達。Nek8屬NIMA相關(guān)激酶家族(never-in-mitosis a-related kinase,Nek)，該家族為絲氨酸/蘇氨酸激酶，在人類基因組中已發(fā)現(xiàn)包括Nek 1～11共11個成員[2]。目前關(guān)于Nek8的研究較少，多集中在與囊性腎病的關(guān)系，但Bowers等[3]發(fā)現(xiàn)Nek8水平在乳腺癌組織中比正常組織表達更高，提示Nek8可能是腫瘤相關(guān)基因。為進一步探討Nek8與食管鱗癌的關(guān)系，本研究采用RT-PCR和組織芯片的方法，對Nek8在食管鱗癌組織中的表達進行了研究，作為探索Nek8與食管鱗癌或其他腫瘤是否相關(guān)的基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 食管鱗癌172點組織芯片(HEso-Squ172Sur-01)由上海芯超生物科技有限公司提供，含78例配對的癌組織及癌旁組織，8例癌組織，共86例。食管鱗癌的TNM分期、分級和病理診斷由公司提供。組織均來自經(jīng)過患者知情同意的組織芯片庫。其中男64例，女22例；年齡41～81歲，平均65歲；病理分化程度：Ⅰ級8例，Ⅰ～Ⅱ級20例，Ⅱ級40例，Ⅱ～Ⅲ級7例，Ⅲ級11例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者51例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者35例；腫瘤大小計算公式為：腫瘤大小=長×寬×高×π/6，其中22例小于或等于5 cm3，62例大于5 cm3，2例無相關(guān)資料。本研究調(diào)查的86例食管鱗癌患者，手術(shù)時間為2006年7月至2008年10月，隨訪時間2013年9月。隨訪時因食管癌死亡59 例，截尾數(shù)27例，分別占總?cè)藬?shù)的68.6%和31.4%。RT-PCR所用2例配對的食管鱗癌組織及癌旁食管黏膜上皮來自川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院胸心外科手術(shù)切除標本，均通過病理學診斷證實和患者知情同意。食管黏膜上皮為無菌條件下剪取遠離癌組織的正常食管，除去結(jié)締組織及血管，縱行剖開食管，PBS液洗滌，剪成大小約1 cm2小塊，用眼科鑷將黏膜層直接撕下。食管鱗癌Eca109細胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要試劑 兔抗人Nek8多克隆抗體購于Abcam公司。免疫組織化學試劑盒UltraVision Quanto Detection System HRP購自Thermo公司，包括信號放大劑Primary Antibody Amplifier Quanto和兔鼠結(jié)合二抗HRP Polymer Quanto等。DAB試劑盒購自Thermo公司?？贵w稀釋液購自DAKO公司。引物由上海生工合成。PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。TRIzol購自Invitrogen公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3 方法

1.3.1 RT-PCR檢測Nek8 mRNA的表達 用TRIzol提取細胞或組織總RNA，按照PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒說明書提取總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA并進行PCR。PCR引物如下，Nek8：上游引物為5′-CTG CGG CTG CCA ATG CTC AA-3′，下游引物為5′-AAC TCG CTG AGC TTC CTG TCC TGG-3′；β-actin：上游引物為5′-GAC GAG GCC CAG AGC AAG AGA-3′，下游引物為5′-ACG TAC ATG GCT GGG GTG TTG-3′。PCR條件為：94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34個循環(huán)。

1.3.2 組織芯片免疫組織化學染色 將組織芯片放入烘箱中，烘蠟1 h；常規(guī)脫蠟水化；檸檬酸修復(fù)；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑阻斷10 min；滴加用DAKO抗體稀釋液1∶3 000稀釋的Nek8抗體，濕盒4 ℃孵育過夜，PBS沖洗；滴加信號放大劑作用10 min，PBS沖洗；滴加兔鼠結(jié)合二抗作用10 min，PBS沖洗；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，中性樹脂封固。以顯色強度(intensity)和顯色比例(percentage)的乘積(Q-score)作為結(jié)果判斷的標準。顯色強度分為0～3級，評級標準：0，不顯色；1，弱顯色；2，中度顯色；3，強顯色。顯色比例分為0～9級，評級標準，0級：<5%；1級：5%～15%；2級：15%～25%……；9級：85%～100%。Q-score最小為0，最大為27。Q-score≤13.5為低表達，>13.5為高表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析，配對的癌組織及癌旁組織Nek8表達差異采用配對資料的非參數(shù)檢驗Wilcoxon檢驗。癌組織中Nek8表達情況與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率比較采用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測Nek8 mRNA的表達 Eca109細胞、2例食管鱗癌患者的癌組織均有Nek8 mRNA表達，且Eca109細胞表達最強。在所檢測的這2例患者癌旁食管黏膜上皮中均未見明顯的Nek8表達，見圖1。

1：Eca109細胞；2、4：食管鱗癌組織；3、5：相應(yīng)配對的癌旁食管黏膜上皮。

圖1 RT-PCR檢測Nek8 mRNA在食管鱗癌細胞系和組織中的表達

2.2 組織芯片食管鱗癌組織和癌旁組織中Nek8的表達 采用食管鱗癌組織芯片，用Nek8抗體進行免疫組織化學染色，結(jié)果如圖2。Nek8主要表達在細胞胞質(zhì)。檢測的86例食管鱗癌標本中，癌組織均有Nek8表達，其中低表達38例，高表達48例。癌旁組織中，陰性16例，低表達61例，高表達1例。經(jīng)Wilcoxon檢驗，在其中78例配對的標本中，Nek8在癌組織中的表達顯著高于其在癌旁黏膜組織的表達，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

A：食管鱗癌組織；B：配對的癌旁組織。

圖2 組織芯片免疫組織化學檢測Nek8在配對的食管鱗癌組織和癌旁組織中的表達(×200)

圖3 Nek8在食管鱗癌組織和配對癌旁組織表達的統(tǒng)計學分析

2.3 Nek8表達與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 經(jīng)統(tǒng)計學分析，Nek8表達與性別、年齡、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)，與腫瘤大小有關(guān)(P<0.05)，見表1。

2.4 Nek8表達與食管鱗癌患者術(shù)后生存的關(guān)系 采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗，對癌組織Nek8表達與食管鱗癌患者生存率進行單因素生存分析發(fā)現(xiàn)，Nek8蛋白表達的高低與食管鱗癌患者術(shù)后生存無顯著的相關(guān)性(P>0.05)，見圖4。

表1 Nek8表達與食管鱗癌臨床病理特征的關(guān)系(n)

圖4 Nek8表達與食管鱗癌患者術(shù)后生存的關(guān)系

3 討論

在對絲狀菌構(gòu)巢曲霉的細胞分裂周期突變的遺傳篩選中發(fā)現(xiàn)了與有絲分裂入口相關(guān)的絲氨酸/蘇氨酸激酶NIMA。NIMA是G2/M期進展所需的重要蛋白酶，啟動染色質(zhì)凝聚和促進進入有絲分裂[3]。隨后，在真核細胞中鑒定到NIMA的直系同源物Nek。目前在人類基因組中發(fā)現(xiàn)Nek家族包括Nek1～11共11個成員。其中，Nek2、Nek6、Nek7和Nek9與有絲分裂有關(guān)，Nek1和Nek8與纖毛形成有關(guān)，Nek1、Nek2和Nek11參與DNA損傷反應(yīng)[4]。越來越多的研究表明，Nek家族部分成員的表達或功能異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)，其中以Nek2、Nek6研究最多。在多種惡性腫瘤組織和細胞系中，Nek2和/或Nek6的轉(zhuǎn)錄、蛋白、激酶活性水平上調(diào)，用小干擾RNA(siRNA)敲低Nek2或Nek6表達抑制了腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡[5-6]。

在本研究前期1項與食管癌相關(guān)的研究中發(fā)現(xiàn)有一基因在食管鱗癌細胞系Eca109細胞中高表達，而正常食管黏膜上皮不表達。對該基因進行測序并在GenBank中進行比對，發(fā)現(xiàn)該基因為Nek8。Nek8首先被Holland和Liu等克隆[7-8]，目前關(guān)于Nek8的研究較少，多集中在與囊性腎病的關(guān)系。人Nek8在分裂細胞中定位于中心體，在有纖毛細胞中定位于最接近纖毛的區(qū)域。在常染色體隱性多囊腎(ARPKD)模型jck小鼠中發(fā)現(xiàn)Nek8發(fā)生G448V突變。在腎集合管細胞中，突變改變了Nek8的定位，由明顯的頂點定位改變?yōu)榉稚⒌募毎|(zhì)定位。表達突變的Nek8導(dǎo)致細胞分裂失敗，出現(xiàn)更大的和多核的細胞，肌動蛋白細胞骨架也出現(xiàn)異常。在斑馬魚中用反義寡核苷酸敲低Nek8導(dǎo)致形成前腎囊腫，敲除Nek8的小鼠其腎發(fā)育受到損害，提示Nek8功能丟失導(dǎo)致多囊腎病[3,8-9]。Nek8也與常染色體隱性腎疾病少年型腎單位腎癆(nephromophthisis,NPHP)相關(guān)(因此Nek8也被稱為NPHP9)。在患者標本中發(fā)現(xiàn)了幾個Nek8突變體(L330F,H425Y和A497P)。在小鼠內(nèi)髓集合管上皮細胞系IMCD3細胞中過表達3個突變均顯示Nek8在纖毛定位的減少，支持Nek8的錯誤定位導(dǎo)致腎囊腫的形成[10-12]。Nek8通過啟動復(fù)制叉進程，抑制異常的起點激發(fā)，穩(wěn)定失速的復(fù)制叉而保持基因組穩(wěn)定性。Nek8丟失導(dǎo)致自發(fā)的DNA損傷和細胞對復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)的缺失。Nek8可能是復(fù)制應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)分子，該反應(yīng)失調(diào)可能導(dǎo)致腎纖毛疾病的發(fā)生[13-14]。

本研究針對食管鱗癌中Nek8的表達情況進行了研究。RT-PCR結(jié)果顯示Eca109細胞、食管鱗癌組織均有Nek8 mRNA表達，而在檢測的正常食管黏膜上皮中未見明顯的Nek8表達。組織芯片包含的78例配對的標本中，Nek8在食管鱗癌組織中的表達顯著高于其在癌旁黏膜組織的表達。提示Nek8可作為診斷食管鱗癌的分子標志物，并且可能與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。關(guān)于Nek8與腫瘤關(guān)系的研究，目前報道極少，只有兩篇文獻提及。Bowers等[3]研究發(fā)現(xiàn)，Nek8在乳腺癌中比乳腺正常組織表達更高；Chan等[15]針對41個配對的外科切除的肝細胞肝癌標本定量RT-PCR結(jié)果顯示，Nek8在腫瘤組織中有1.29倍的增加。以上研究均提示Nek8可能是腫瘤相關(guān)基因，但其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用尚不清楚。本研究還發(fā)現(xiàn)，Nek8表達與性別、年齡、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤大小有關(guān)(P<0.05)，提示Nek8可能與細胞增殖關(guān)系密切。雖然Nek家族多數(shù)成員被認為是細胞周期調(diào)節(jié)子，Nek8是否參與細胞周期調(diào)節(jié)尚不清楚，在骨肉瘤U2-0S 細胞系中表達缺陷突變的Nek8導(dǎo)致肌動蛋白減少，Cdk1/cyclinB1微弱增加，提示Nek8可能與G2/M進程相關(guān)[3]；另外，Habbig等[12]發(fā)現(xiàn)Nek8促進Hippo信號通路的癌基因轉(zhuǎn)錄因子TAZ轉(zhuǎn)位入核，在乳腺癌細胞中敲低Nek8抑制了TAZ誘導(dǎo)的增殖，提示Nek8可能和TAZ共同控制細胞增殖。生存分析結(jié)果顯示，高表達和低表達Nek8的患者生存率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示Nek8與食管鱗癌患者的預(yù)后可能無顯著的關(guān)聯(lián)。

總之，Nek8是一潛在的腫瘤相關(guān)基因，可能與食管鱗癌等腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，但其具體機制尚不清楚。尚需進一步研究明確其功能，該分子有望作為診斷食管鱗癌的標志物和治療食管鱗癌的靶點。

[1]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global cancer statistics,2002[J].CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-108.

[2]FryAM,O′reganL,SabirSR,etal.Cellcycle regulation by the NEK family of protein kinases[J].J Cell Sci,2012,125(Pt 19):4423-4433.

[3]Bowers AJ,Boylan JF.Nek8,a NIMA family kinase member,is overexpressed in primary human breast tumors[J].Gene,2004,328:135-142.

[4]Malumbres M,Barbacid M.Cell cycle kinases in cancer[J].Curr Opin Genet Dev,2007,17(1):60-65.

[5]Tsunoda N,Kokuryo T,Oda K,et al.Nek2 as a novel molecular target for the treatment of breast carcinoma[J].Cancer Sci,2009,100(1):111-116.

[6]Nassirpour R,Shao L,Flanagan P,et al.Nek6 mediates human cancer cell transformation and is a potential cancer therapeutic target[J].Mol Cancer Res,2010,8(5):717-728.

[7]Holland PM,Milne A,Garka K,et al.Purification,cloning,and characterization of Nek8,a novel NIMA-related kinase,and its candidate substrate Bicd2[J].J Biol Chem,2002,277(18):16229-16240.

[8]Liu S,Lu W,Obara T,et al.A defect in a novel Nek-family kinase causes cystic kidney disease in the mouse and in zebrafish[J].Development,2002,129(24):5839-5846.

[9]Manning DK,Sergeev M,Van Heesbeen RG,et al.Loss of the ciliary kinase Nek8 causes left-right asymmetry defects[J].J Am Soc Nephrol,2013,24(1):100-112.

[10]Otto EA,Trapp ML,Schultheiss UT,et al.NEK8 mutations affect ciliary and centrosomal localization and May cause nephronophthisis[J].J Am Soc Nephrol,2008,19(3):587-592.

[11]Zalli D,Bayliss R,Fry AM.The Nek8 protein kinase,mutated in the human cystic kidney disease nephronophthisis,is both activated and degraded during ciliogenesis[J].Hum Mol Genet,2012,21(5):1155-1171.

[12]Habbig S,Bartram MP,S?gmüller JG,et al.The ciliopathy disease protein NPHP9 promotes nuclear delivery and activation of the oncogenic transcriptional regulator TAZ[J].Hum Mol Genet,2012,21(26):5528-5538.

[13]Choi HJ,Lin JR,Vannier JB,et al.NEK8 links the ATR-regulated replication stress response and S phase CDK activity to renal ciliopathies[J].Mol Cell,2013,51(4):423-439.

[14]Jackson PK.Nek8 couples renal ciliopathies to DNA damage and checkpoint control[J].Mol Cell,2013,51(4):407-408.

[15]Chan WL,Yuo CY,Yang WK,et al.Transcribed pseudogene ψPPM1K generates endogenous siRNA to suppress oncogenic cell growth in hepatocellular carcinoma[J].Nucleic Acids Res,2013,41(6):3734-3747.

Significance of Nek8 expression in esophageal squamous cell carcinoma*

GuoYaping1,ZhuHong1,FuMaoyong2,WangChaoli3,LiQianqian1,HuWeimin1,3△

(1.DepartmentofMicrobiologyandImmunology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;2.DepartmentofCardiothoracicSurgery,theAffiliatedHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China;3.InstituteofImmunologyandMolecularBiology,NorthSichuanMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China)

Objective To investigate the expression of Nek8 in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) tissues and cell line,and to evaluate its correlation with the clinicopathological features of ESCC and the survival rate of ESCC patients after operation.Methods The expression of Nek8 mRNA in human ESCC Eca109 cell line and two pairs of ESCC tissues and adjacent normal esophageal mucosal epithelium were detected by semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).Immunohistochemistry and tissue microarray technique were used to examine the expression of Nek8 protein in ESCC tissues and tumor-adjacent tissues.The correlation between Nek8 expression and clinicopathological features of ESCC and survival rate of ESCC patients was then analyzed.Results The expression of Nek8 mRNA was positive in Eca109 cells and two cases of ESCC tissue,and it was negative in paired normal esophageal mucosal epithelium specimens.In tissue microarray,the expression of Nek8 protein in ESCC tissues,which was mainly in the cytoplasm,was significantly higher than that in tumor-adjacent tissues(P=2.16E-13).The high expression of Nek8 was associated with tumor size(P=0.008),but not with sex,age,histological grade,infiltration degree,lymph node metastasis,and the survival rate(P>0.05).Conclusion The expression of Nek8 is up-regulated in ESCC tissues and cell line,and may be involved in tumorigenesis and development of ESCC.Nek8 could act as a potential biomarker for ESCC diagnose and target for therapy.

immunohistochemistry;Nek8;esophageal squamous cell carcinoma;Eca109 cell

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.05.007

四川省科技廳重點科技自籌項目(2011JYZ023)。 作者簡介：郭亞平(1958-)，副教授，本科，主要從事腫瘤生物學與免疫方面研究。△

,E-mail：wmhu2002@163.com。

R735.1

A

1671-8348(2015)05-0597-03

2014-08-27

2014-10-16)