吳艾霖，熊怡淞，王艷艷，曲遠青，吳麗娟△

(1.第三軍醫(yī)大學研究生管理大隊，重慶 400038；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床

實驗醫(yī)學研究與保障中心，成都 610083)

論著·基礎(chǔ)研究

熱休克蛋白70基因rs1008438多態(tài)性與高原肺水腫的相關(guān)性*

吳艾霖1,2，熊怡淞2，王艷艷2，曲遠青2，吳麗娟2△

(1.第三軍醫(yī)大學研究生管理大隊，重慶 400038；2.成都軍區(qū)總醫(yī)院臨床

實驗醫(yī)學研究與保障中心，成都 610083)

目的 探討熱休克蛋白(HSP)70基因啟動子區(qū)rs1008438位點單核苷酸多態(tài)性(SNP)與高原肺水腫(HAPE)之間的關(guān)系。方法 采用PCR-DNA直接測序法檢測100例HAPE組、200例健康對照組個體基因組rs1008438位點的基因分布，分析不同基因型與HAPE的關(guān)系；運用ELISA法檢測不同基因型HAPE組和健康對照組白細胞細胞質(zhì)和細胞核HSP70蛋白含量變化；應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)和EVIDENCE180全自動芯片儀分析TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平。結(jié)果 HAPE組，健康對照組rs1008438的TT、GT、GG的基因型頻率分別是76.0%、20.0%、4.0%，93.0%、6.5%、0.5%。統(tǒng)計處理顯示，HAPE組TT基因型頻率明顯低于健康對照組(P<0.05)；GT、GG基因型患HAPE的危險性是TT基因型的4.195倍，G等位基因相對T等位基因也能明顯增加HAPE的發(fā)病風險(OR=4.178)；ELISA檢測結(jié)果顯示，不同基因型HAPE組HSP70含量均高于健康對照組，且HSP70細胞核/細胞質(zhì)比值TT基因型高于GT/GG基因型；蛋白質(zhì)芯片檢測表明，HAPE組血清中的TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平均明顯高于健康對照組。結(jié)論 rs1008438位點多態(tài)性與HAPE易感性相關(guān)，這種相關(guān)性可能是由于突變型在基因轉(zhuǎn)錄水平通過影響啟動子活性而增強HSP70表達，從而導(dǎo)致HAPE的發(fā)生。

多態(tài)性，單核苷酸；高原肺水腫；rs1008438；熱休克蛋白70；啟動子

高原肺水腫(high altitude pulmonary edema,HAPE)是指近期抵達高原(一般指海拔3 000 m以上)，出現(xiàn)靜息時呼吸困難、胸悶壓塞感、咳嗽、咳白色或粉紅色泡沫痰，患者感覺全身乏力或活動能力減低的疾病，是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。近年來，對于HAPE的研究熱點涉及體內(nèi)多個系統(tǒng)，如細胞離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、內(nèi)皮系統(tǒng)等[1-4]。熱休克蛋白(HSP)是一組細胞在應(yīng)激環(huán)境誘導(dǎo)下生成的一組蛋白質(zhì)。人快速進入高原環(huán)境時，體內(nèi)的HSP會迅速增高來提高細胞的應(yīng)激能力，抵抗外部的不利因素，其中一個機制為調(diào)節(jié)Na+-K+-ATP酶的活性，防止水分進入肺泡，引起HAPE[5]。Qi等[6]對修建青藏鐵路的中國工人進行了調(diào)查，觀察了148名HAPE患者和438名健康者，結(jié)果表明HSP70的rs1061581、rs1043618 和 rs1008438位點的多態(tài)性可能與HAPE易感性相關(guān)，尤其rs1008438通過改變HSPA1A的啟動子活性對HAPE的發(fā)生、發(fā)展起重要作用。

作者通過生物信息學分析的方法發(fā)現(xiàn)HSP70基因啟動子區(qū)rs1008438位點位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域，且在國際人類基因組單體型圖計劃(www.Hapmap.org)中查詢到在中國漢族人群中等位基因頻率大于12%，推測其可能影響HSP70基因的表達，從而導(dǎo)致HAPE的發(fā)生。本研究通過對臨床HAPE病例及健康人群的研究，探討rs1008438多態(tài)性與HAPE的關(guān)系，以深入認識HAPE發(fā)生、發(fā)展的遺傳基礎(chǔ)，為臨床HAPE患者的預(yù)防提供客觀依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 新入伍戰(zhàn)士1 200人,漢族,所有研究對象均為男性，年齡18～20歲,入伍前經(jīng)體檢身體健康。分別從23、110、396 m和891 m的4個不同海拔地乘火車抵達海拔505 m(成都)集結(jié)地,休整7 d后乘飛機到達海拔3 658 m高原(拉薩)。除非特指,本研究中平原海拔高度為505 m,高原海拔高度為3 658 m。從本次受試者符合急性高原反應(yīng)評分量表(AMS Lake Loulse)評分診斷標準的HAPE患者中選取100名患者作為HAPE組,從未達到診斷標準的人群中隨機選取200名作為健康對照組,兩組人員除觀察因素外其他一般資料(服役時間、身高、體質(zhì)量、身體狀況、祖籍地) 基本均衡。

1.2 主要實驗材料 高保真PrimeSTAR HS DNA Polymerase PCR試劑盒、PrimeScript RT(逆轉(zhuǎn)錄)PCR試劑盒、SYBR premix EX taq熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；DNA膠回收純化試劑盒、柱式總RNA提取試劑盒及所有引物合成(上海生工生物技術(shù)有限公司)；HSP70 ELISA試劑盒(Stressgen Biotechnologies,Canada)；蛋白質(zhì)芯片試劑盒和EVIDENCE180全自動芯片儀(Randox，UK)。

1.3 基因分型

1.3.1 基因組DNA提取 清晨空腹狀態(tài)下采集各組人群外周靜脈全血，乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝?；蚪MDNA提取使用酚-氯仿法，nano 2000超微量分光光度計測定A260及A280，判斷基因組DNA的純度和濃度。

1.3.2 目的基因的PCR擴增及純化 ABI 2720 PCR儀用于目的片段的擴增，上游引物5′-GTG ACA CTC TGC TCC AAA CTT CT-3′，下游引物5′-CCC CTT GTC TAT TTC TGC TCA C-3′。反應(yīng)體系含2×PrimeSTAR GC Buffer 25.0 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，2.5 mM dNTPs Mixture 4.0 μL，10.0 μM引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，雙蒸水補足50.0 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火59 ℃ 35 s，延伸72 ℃ 50 s，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR擴增產(chǎn)物，用柱式DNA膠回收試劑盒進行切膠純化回收。PCR純化產(chǎn)物測序美國ABI公司3730測序列分析儀測序。

1.4 HSP70含量測定 患者和健康組均取清晨空腹血2 mL(EDTA-K2抗凝)用于HSP70檢測。血樣標本用紅細胞裂解液破壞紅細胞并用PBS洗滌1次(1 000 r/min，10 min)，計數(shù)5×106個細胞，用蛋白提取試劑盒(Pierce)分別抽提細胞質(zhì)蛋白和細胞核蛋白，置于-70 ℃待測。HSP70用 ELISA試劑盒檢測，具體操作嚴格按試劑盒說明書進行。

1.5 細胞因子檢測 運用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)和Evidence180全自動芯片儀檢測并分析HAPE組和健康對照組血清中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平。兩組人群清晨空腹抽血5 mL于分離膠管(BD公司生產(chǎn)),室溫放置30 min,3 000 r/min離心10 min,分離血清,置于-80 ℃冰箱貯存待檢。具體方法及操作過程參見文獻[7]。

1.6 統(tǒng)計學處理 各組均采用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗；采用SPSS13.0行統(tǒng)計學分析，采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗分析病例對照之間的基因型分布并計算優(yōu)勢比OR值和95%CI。熒光定量PCR數(shù)據(jù)通過2-△△CT法[4]換算成相對含量并進行分析，HSP70表達及細胞因子間比較利用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 rs1008438基因型分布

2.1.1 RT-PCR直接測序法分型結(jié)果 如圖1所示，測序峰清晰，無明顯雜峰，結(jié)果穩(wěn)定，能明顯區(qū)分TT、GT、GG 3種基因型。健康對照組200例標本中，HSP70啟動子rs1008438位點基因型為GG的1例(0.5%)、GT的13例(6.5%)、TT的186例(93.0%)；HAPE組100例標本中，HSP70啟動子rs1008438位點基因型為GG的4例(4.0%)、GT的20例(20.0%)、TT的76例(76.0%)。由Hardy-Weinberg平衡計算得到兩組的P值分別為0.31、0.16，均大于0.05，說明各組人群都符合Hardy-Weinberg，樣本選擇具有代表性。

圖1 HSP70基因啟動子區(qū)rs1008438位點測序峰圖。

表1 各組HSP70基因rs1008438位點基因型及等位基因頻率分布[n(%)]

a：P<0.05,與健康對照組比較。

2.1.2 各基因型及等位基因頻率分布情況 各組等位基因均以T等位基因最為常見，突變型GT基因型及GG基因型罕見。HAPE組TT基因型頻率明顯低于健康對照組(P<0.05)，而GT和GG基因型則明顯高于健康對照組(均P<0.05)；等位基因頻率分析同樣顯示HAPE組G等位基因頻率明顯高于健康對照組(P<0.05)，見表1。對基因易感性分析發(fā)現(xiàn)，GT、GG基因型患HAPE的危險性是TT基因型的4.195倍(OR=4.195，95%CI：3.767～4.622)，G等位基因相對T等位基因也能明顯增加HAPE的發(fā)病風險(OR=4.178，95%CI：3.750～4.606)。

2.2 HSP70含量測定實驗 不同基因型HAPE組和健康對照組白細胞細胞質(zhì)和細胞核HSP70蛋白含量測定結(jié)果見表2。對于HAPE組，HSP70含量在細胞核和細胞質(zhì)中的比值(細胞核/細胞質(zhì))，TT基因型明顯高于GT、GG基因型；并且TT、GT、GG在細胞核中的絕對含量也均高于細胞質(zhì)，GT、GG基因型與TT基因型比較，表現(xiàn)尤為明顯。對于健康對照組，則沒有上述表現(xiàn)。另外，健康對照組與HAPE組比較，GT、GG基因型 HSP70含量明顯低于TT型。

表2 不同基因型HAPE組和健康對照組白細胞細胞質(zhì)和細胞核HSP70蛋白比較

2.3 細胞因子水平表達 健康組與HAPE組比較，HAPE組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平明顯增高，見圖2。

A：TNF-α;B:IL-1β;C:IL-6;a:P<0.05，與健康對照組比較。

圖2 HAPE組和健康對照組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量比較

3 討論

HSP70是進化上最保守的蛋白質(zhì)之一,相對分子質(zhì)量約70×103，主要由一個N端高度保守的44 ku ATPase功能域(ATPbindingdomain)和一個相對分子質(zhì)量為25 ku的C端區(qū)域組成[8]。其具有(1)分子伴侶功能：在細胞中執(zhí)行最基本的生理功能，如蛋白質(zhì)折疊、伸展、轉(zhuǎn)運、寡聚體的形成和解聚等，維持細胞的生存和功能，在應(yīng)激的不利條件下，提高細胞的抵抗力，起到應(yīng)激保護作用；(2)協(xié)同免疫作用：正常情況下HSP70在細胞內(nèi)呈基礎(chǔ)表達，表達水平較低；而在高溫及各種有害應(yīng)激狀態(tài)下，HSP70的合成速度明顯增加，一般數(shù)分鐘內(nèi)即可達到最高水平，而原來的蛋白質(zhì)合成則減少，以提高生物體的抗應(yīng)激能力[9-12]。Qi等[6]的研究證實在正常情況下HSP70位于細胞質(zhì)內(nèi)，當細胞遭受應(yīng)激作用時，如高溫、高濕等極端環(huán)境，人體會迅速動員細胞質(zhì)中的HSP70到細胞核內(nèi)并包圍核仁，細胞質(zhì)內(nèi)只有少量存在，以此來抵御外來的不利因素，維持人體正常的功能。本研究表明HAPE患者HSP70含量細胞核/細胞質(zhì)，TT基因型明顯高于GT、GG基因型。這可能提示突變型GT、GG基因型及G等位基因更易患HAPE。同時，在HAPE組中，細胞核中的HSP70的絕對含量也明顯高于細胞質(zhì)，這可能是因為人為了適應(yīng)高原的極端環(huán)境，在極短時間內(nèi)，人體動員大量細胞質(zhì)中的HSP70到細胞核以此抵御外來不利因素而產(chǎn)生的一種自衛(wèi)表現(xiàn)。同時，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測表明，HAPE組和健康對照組血清中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平存在明顯差異，前者遠遠高于后者(P<0.05)。這可能是因為HAPE組的HSP70增高所致。Asea等[13-14]研究表明HSP70會上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子的表達水平。這進一步證明了HSP70與HAPE有很大的關(guān)聯(lián)。這也表明HAPE患者為了抵御外來的不利因素，在短時間內(nèi)，迅速動員相關(guān)細胞因子，激活或者沉默某些免疫途徑，以此來維護生命的穩(wěn)定。

借助病例-對照試驗，作者還分析了HAPE組和健康對照組基因型rs1008348位點的多態(tài)性，結(jié)果顯示健康對照組T等位基因頻率96.3%，與Hapmap中記錄的CHB人群T等位基因頻率接近[15]；且病例組無論在基因型頻率還是在等位基因頻率分布上與健康組相比均有明顯差異，野生型TT純合子頻率明顯低于健康組。而且從基因型頻率的易感性分析發(fā)現(xiàn)，GT/GG基因型及G等位基因明顯增加HAPE發(fā)生的風險。上述發(fā)現(xiàn)表明rs1008348位點G等位基因與HAPE的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述，HSP70啟動子rs1008438 GT、GG基因型及G等位基因與HAPE的發(fā)生明顯相關(guān)，且經(jīng)過對HAPE組和健康對照組血清中細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量測定，初步分析驗證上過觀點，為更深入認識HAPE發(fā)生的分子機制在基因和蛋白水平上奠定了基礎(chǔ)。

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The relationship between rs1008438 polymorphism of HSP70 gene and high altitude pulmonary edema*

WuAilin1,2,XiongYisong2,WangYanyan2,QuYuanqing2,WuLijuan2△

(1.PostgraduateManagementAgency,theThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China;2.ResearchandServiceCenterofLaboratoryMedicine,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu,Sichuan610083,China)

Objective To investigate the relationship between the single nucleotide polymorphisms(SNP) of rs1008438 in HSP70 promoter and the susceptibility of high altitude pulmonary edema(HAPE).Methods The PCR-DNA sequencing method was used to analyze gene distribution of rs1008438 in 100 HAPE patients and 200 healthy people,and the relationship between different genotypes and HAPE was evaluated.Meanwhile,HSP70 protein in cytoplasm and nuclei of white blood cells were detected by ELISA in patientgroup and healthy group.TNF-α,IL-1β and IL-6 levels were analyzed by protein chip technology and EVIDENCE180 automatic chip reader.Results The TT,GT,and GG genetype frequencies of rs1008438 in HAPE patients and healthy controls were 76.0%,20.0%,4.0%,and 93.0%,6.5%,0.5%,respectively.The TT genetype frequency in HAPE patients was significantly lower than that in healthy control(P<0.05).The HAPE incidence rate in GT/GG genetype was 4.195 times higher than that in TT genetype,and the allele G can also significantly increase the prevalence of HAPE compared to T allele(OR=4.178).ELISA showed that HSP70 were higher in HAPE group of all genotypes than those in healthy control of the same genotype.And the nuclei/cytoplasm ratio of HSP70 in TT genotype was higher than that in GT/GG genotype.Protein chip showed that the levels of TNF α,IL-1β,and IL-6 in HAPE group were significantly higher than those in healthy control.Conclusion The polymorphism of rs1008438 is related to susceptibility of HAPE.Mutate genetype may change the promoter activity and increase the expression of HSP70,which induced HAPE.

polymorphism,single nucleotide;high altitude pulmonary edema;rs1008438;HSP70;promoter

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.05.006

國家自然科學基金資助項目(81302596)；成都軍區(qū)總醫(yī)院創(chuàng)新科研基金資助項目(2011YG-A23、2013YG-B064)。 作者簡介：吳艾霖(1982-)，主管技師，在讀碩士，主要從事siglec-1介導(dǎo)組織巨噬細胞炎性反應(yīng)參與類風濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制研究。△

，E-mail：wulijuan1638@126.com。

R394.3

A

1671-8348(2015)05-0593-04

2014-09-13

2014-10-10)