楊 紅,田鳳瑛,周澤平,邵 亮,張 鈾△

(1.昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液科，昆明 650101；2.云南省昆明市延安醫(yī)院兒科

650051；3.武漢大學中南醫(yī)院血液科，武漢 430071)

·論著·

ANGPT1、ANGPT2、VEGF在急性髓系白血病小鼠模型中的表達研究*

楊 紅1,田鳳瑛2,周澤平1,邵 亮3,張 鈾1△

(1.昆明醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院血液科，昆明 650101；2.云南省昆明市延安醫(yī)院兒科

650051；3.武漢大學中南醫(yī)院血液科，武漢 430071)

目的 通過構建急性髓系白血病(AML)小鼠模型,從mRNA水平研究促血管生成素(ANGPT)1、ANGPT2、血管內皮生長因子(VEGF)的表達水平與急性髓系白血病的關系。方法 NOD/SCID小鼠腹腔接種HL-60細胞，建立AML小鼠模型，稱模型組，未經處理的NOD/SCID小鼠作對照組。用病理組織學及流式細胞學方法鑒定小鼠模型是否成功。實時熒光定量PCR(RQ-PCR)技術檢測ANGPT2、ANGPT1及VEGF mRNA在AML小鼠腫瘤組織中的表達水平。應用Spearman相關分析法分析ANGPT2 mRNA表達水平與小鼠生存期的關系。結果 成功構建AML小鼠模型。RQ-PCR結果顯示模型組腫瘤組織的ANGPT2、VEGF mRNA的表達水平較正常對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而ANGPT1 mRNA的表達水平兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。ANGPT2 mRNA表達水平與AML小鼠生存期呈負相關。結論 ANGPT2 mRNA在AML小鼠中高表達且與AML小鼠生存期呈負相關，ANGPT2表達與AML病情進展及預后相關。

急性髓系白血??；小鼠模型；促血管生成素；血管內皮生長因子

急性髓系白血病(AML) 是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一。目前尚缺乏療效好且不良反應小的治療方案。研究發(fā)現，血管增生在AML的致病機理中發(fā)揮重要作用，其中促血管生成素-酪氨酸激酶受體(ANGPT-TIE)通路是主要的血管增生信號通路之一。研究發(fā)現，ANGPT2在實體瘤組織和血液系統(tǒng)腫瘤患者外周血中高表達。目前發(fā)現ANGPT2與AML的預后密切相關。本研究通過構建急性髓系白血病小鼠模型,從mRNA水平研究ANGPT1、ANGPT2、血管內皮生長因子(VEGF)的表達水平與AML的關系，探討ANGPT2對AML預后的影響，為靶向ANGPT2治療AML提供理論及實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞與材料 NOD/SCID小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，雄性，周齡3周(<5周)，體質量約5 g左右，飼養(yǎng)于昆明醫(yī)科大學SPF級實驗動物實驗室。HL-60細胞全稱為HL-60人原髓細胞白血病細胞，購自中國科學院上海細胞庫。主要實驗試劑有IMDM培養(yǎng)基和胎牛血清購自上海哈靈生物科技有限公司，總RNA提取試劑盒、QuantiTect?SYBR?Green PCR試劑盒、PrimeScriptTM RT Master Mix 購自 TaKaRa公司，其他試劑為市售分析純。PCR引物序列由上海生工生物技術服務有限公司設計及合成。

1.2 方法

1.2.1 HL-60細胞的培養(yǎng) 細胞用10%小牛血清，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素、RPMI-1640培養(yǎng)液，置25 cm2塑料培養(yǎng)瓶內，每瓶培養(yǎng)基的體積為8 mL；培養(yǎng)條件37 ℃，飽和濕度，5% CO2，取對數生長期HL-60細胞進行實驗。

1.2.2 AML小鼠模型的構建 取傳代后處于對數生長期的HL-60細胞株，在倒置顯微鏡下用細胞計數板進行計數，將1×107個細胞在已局部消毒的NOD/SCID小鼠的左下腹進行腹腔接種。

1.2.3 急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的鑒定

1.2.3.1 觀察NOD/SCID小鼠的一般情況 動態(tài)觀察小鼠精神、食欲、體質量、活動能力、毛發(fā)情況、腹腔積液、皮下腫瘤大小、生存時間等情況。

1.2.3.2 流式細胞分析儀檢測骨髓細胞CD33陽性率 髓系細胞表面抗原CD33在人白血病細胞系HL-60上表達的陽性率可達99%。將瀕臨死亡的小鼠脫頸椎處死，小鼠置于75%乙醇中浸泡5～10 min，分離脛骨、股骨，將分離好的脛骨、股骨放入裝有PBS的培養(yǎng)皿，剪斷干骺端后用1 mL注射器吸取少許PBS反復沖洗骨髓腔，裝入有EDTA抗凝劑的離心管中，經PBS洗2 次后,加入抗人CD45和CD33抗體同時加入小鼠血清,4 ℃避光染色30 min,再經PBS洗2次,流式細胞儀檢測，Midfilt軟件分析細胞分布。

1.2.3.3 病理學檢查 取瀕死小鼠及死亡小鼠的實體瘤、肝、脾、肺、腦等臟器用10%甲醛固定后,常規(guī)石蠟包埋、切片、HE 染色，光鏡下觀察形態(tài)學改變，以明確小鼠的死亡原因。

1.2.4 實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RQ-PCR)檢測AML小鼠腫瘤組織中ANGPT2、ANGPT1以及VEGF mRNA的表達水平 采用Promega公司SV 總RNA 分離純化試劑盒提取RNA，紫外分光光度計評價所提取RNA的濃度和純度(A260/A280 >1.8)。采用PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒逆轉錄cDNA。利用Primer軟件設計擴增引物，由上海生工生物技術服務有限公司設計及合成，具體序列如下。ANGPT1基因，上游引物：5′-TGC ACT AAA GAA GGT GTT TTG CT-3′，下游引物：5′-CCG GTG TTG TAT TAC TGT CCA A-3′，片段大小197 bp；ANGPT2基因，上游引物：5′-CCT CGA CTA CGA CGA CTC AGT-3′，下游引物：5′-TCT GCA CCA CAT TCT GTT GGA-3′，片段大小146 bp；VEGF基因，上游引物：5′-GCA CAT AGA GAG AAT GAG CTT CC-3′，下游引物：5′-CTC CGC TCT GAA CAA GGC T-3′，片段大小105 bp；β-actin基因，上游引物：5′-TGC CAT CCT AAA AGC CAC-3′，下游引物：5′-TCA ACT GGT CTC AAG TCA GTG-3′，片段大小289 bp。RQ-PCR反應按QIAGEN公司QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒說明書進行?？偡磻w系為20.0 μL。2×SYBR Primix Ex TaqTM 10.0 μL，上游及下游引物各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，H2O 6.0 μL。反應條件如下：94 ℃預變性3 min;95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，44個循環(huán)。擴增產物行2%瓊脂糖凝膠電泳，確定產物特異性。根據目的基因對比標準品的RQ值作為ANGPT1、ANGPT2、VEGF mRNA相對表達水平。

2 結果

2.1 成功構建AML小鼠模型 腹腔接種HL-60細胞后約20～33 d左右10只小鼠均有不同程度發(fā)病，小鼠出現精神狀態(tài)差、活動減少、嗜睡、步態(tài)不穩(wěn)、行動遲緩、進食減少、體質量不增或下降。通過病理學檢查發(fā)現小鼠的肝、脾、肺、腦、腎等全身重要臟器均有腫瘤細胞的廣泛浸潤，其小血管內亦可見大量的腫瘤細胞浸潤。流式細胞儀檢測，結果顯示CD33在小鼠骨髓中高表達，表達率為30.0%～97.4%，見圖1。

A、C：CD45/SSC射門;B、D：CD33表達量。

圖1 流式細胞術檢測小鼠骨髓CD33表達

1：DNA分子標記物(DL2000)；2：正常組織內參β-actin基因；3：腫瘤組織內參β-actin；4：正常組織VEGF基因；5：腫瘤組織VEGF基因；6：正常組織ANGPT2基因；7：腫瘤組織ANGPT2基因；8：正常組織ANGPT1基因；9：腫瘤組織ANGPT1基因。

圖2 PCR擴增產物2%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 ANGPT1、ANGPT2、VEGF mRNA表達水平 取10例經鑒定成功建模的小鼠的腫瘤組織為模型組，10例未經任何處理的小鼠為對照組，RQ-PCR法檢測ANGPT1、ANGPT2及VEGF mRNA表達水平。ANGPT2、VEGF和β-actin 基因擴增產物溶解曲線分析顯示，溶解濃度均一，可排除非特異性擴增。目的和內參基因PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳可見，ANGPT1靠近197 bp處，ANGPT2靠近146 bp處，VEGF靠近105 bp處，且條帶致密、明亮，無引物二聚體和非特異性擴增，說明擴增產物正確，引物特異性好，見圖2。

2.3 ANGPT1、ANGPT2、VEGF mRNA在模型組和對照組中的表達 ANGPT1去掉一個異常值13.642，進行統(tǒng)計學分析。結果顯示模型組與正常組比較，ANGPT1 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義，而兩組間ANGPT2及VEGF mRNA的差異均有統(tǒng)計學差異，模型組明顯高于正常組(P<0.05)，結果見圖3。

2.4 ANGPT2 mRNA表達量與小鼠生存期的相關性分析 研究結果顯示小鼠生存期為(38.6±4.1)d，而ANGPT2的mRNA表達量為46.963±25.742 3。為了進一步明確二者之間是否存在關系，采用Spearman相關分析，結果顯示ANGPT2基因mRNA表達量與小鼠生存期呈負相關關系(P<0.01，r=-0.997)，見圖4。

A：ANGPT1；B：ANGPT2；C：VEGF。

圖3 ANGPT1、ANGPT2、VEGF mRNA在兩組中的相對表達量

圖4 ANGPT2 mRNA表達量與小鼠生存期的相關分析圖

3 討論

ANGPT是血管生成的一類因子，是一個家族體系。ANGPT家族與VEGF在血管的增生、穩(wěn)定以及退化中具有協(xié)同作用，促進腫瘤性新生血管的形成，并在腫瘤的生長、侵襲、轉移中發(fā)揮重要作用[1]。近年研究逐漸發(fā)現血管新生的程度可以成為預測腫瘤預后的一項重要指標。血管新生指的是在原有血管的基礎上形成新的毛細血管網，即內皮細胞增殖、遷移和毛細血管形成的過程。Padro 等[2]研究發(fā)現新確診的AML患者的微血管密度(microvessel density，MVD)是正常對照組的2倍，經過化療達完全緩解且骨髓處于抑制期時骨髓微血管密度下降了60%，而未達到完全緩解者僅下降了17%。對于完全緩解的骨髓與正常對照組MVD無顯著差異。表明血管新生在AML的發(fā)病機制中可能起著重要的作用，而MVD的增高通常伴隨來源于白血病細胞的血管生長因子的分泌，其中最重要的是ANGPTs及VEGF[3]。Muller等[4]、Tarai等[5]發(fā)現與正常對照組比較，新確診的和復發(fā)的AML患者中ANGPT1、ANGPT2有較高的陽性表達率，并且與幼稚細胞的數量呈正相關。Schliemann等[6]用免疫組織化學法分析了AML患者骨髓活檢標本的ANGPT1、ANGPT2、TIE2的表達情況，證實了ANGPT2在AML患者的骨髓中高表達，而ANGPT1與正常對照組無顯著差異，進一步證明了ANGPT2與AML的預后呈負相關。Schliemann等[7]用ELISA檢測68例新確診AML患者血漿中ANGPT2水平，發(fā)現高水平ANGPT2者預后不良。

目前臨床實驗中大多僅限于用AML患者的骨髓和外周血等進行相關檢測，大量的研究只是證實了ANGPT2在AML的骨髓、外周血及血漿中高表達且與AML患者的預后呈負相關，但是還沒有用ANGPT2的特異性單克隆抗體進行臨床治療的報道，并且其相關的實驗動物模型研究也很少。

本研究采用NOD/SCID小鼠成功構建AML模型，并利用RQ-PCR檢測建模成功的AML小鼠的腫瘤組織，研究發(fā)現ANGPT2、VEGF mRNA的表達水平較對照組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而ANGPT1 mRNA的表達水平與對照組無顯著差異(P>0.05)，這與文獻[4-6]臨床研究的結果一致，提示ANGPT2 mRNA高表達在AML的發(fā)病中有重要意義。在研究中同時還發(fā)現，高表達ANGPT2的小鼠其生存期比ANGPT2表達低的小鼠短，采用Spearman相關分析顯示ANGPT2基因mRNA表達量與小鼠生存期有高度的相關關系，且為負相關，由此可推論出高表達的ANGPT2與AML的預后呈負相關，高表達ANGPT2的AML預后不良。

針對ANGPT2的研究在實體瘤中也有大量的報道，研究發(fā)現ANGPT2高表達與大腸癌[8]、鼻咽癌[9]、胃癌[10]等多種實體瘤侵襲轉移及預后相關。但目前研究的熱點是靶向治療且已取得了初步結果。Hashizume等[11]應用ANGPT2選擇性地抑制性L1～L7融合蛋白治療人結腸癌異體移植的小鼠模型，發(fā)現該方法能有效抑制腫瘤生長和血管增生，當與抗VEGF合用時其作用更為明顯。有學者[12-13]應用3.19.3單克隆ANGPT2抗體，有效地抑制了侵襲性的MMTV-PyMT乳腺癌和胰腺胰島瘤的血管增生和疾病進展,局部性地降低了巨噬細胞(TIE-2-expressing macrophages,TEMs)的TIE2的表達，也有效降低了腫瘤的血管增生。

本研究成功建立了AML NOD/SCID小鼠模型，并在mRNA水平利用特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確的RQ-PCR進行了ANGPT2、VEGF及ANGPT1基因的相關檢測，發(fā)現ANGPT2、VEGF mRNA的表達水平較正常組顯著增高，而ANGPT1 mRNA的表達水平與正常組無顯著差異，且高表達ANGPT2的小鼠其生存期比ANGPT2表達低的小鼠短，說明了高表達的ANGPT2與AML的預后呈負相關。作為ANGPT2靶向治療的前期試驗，這對于下一步的分子靶向治療研究奠定了良好的實驗及理論基礎。接下來需要在AML小鼠模型的基礎上進一步深入研究用特異性的ANGPT2單克隆抗體治療AML小鼠，觀察小鼠的生存期及腫瘤生長情況，同時還需進一步探討VEGF抗體與ANGPT2抗體在AML中的協(xié)同治療效果，為臨床靶向ANGPT2治療AML奠定堅實的理論和實驗基礎。

[1]Shim WS,Ho IA,Wong PE.Angiopoietin:a TIE(d) balance in tumor angiogenesis[J].Mol Cancer Res,2007,5(7):655-665.

[2]Padro T,Ruiz S,Bieker R,et al.Increased angiogenesis in the bone marrow of patients with acute myeloid leukemia[J].Blood,2000,95(8):2637-2644.

[3]Fiedler W,Schuch G,Loges S,et al.Prognostic implication of expression of angiopoietin-2 in acute myeloid leukemia[J].Leuk Res,2008,32(6):843-844.

[4]Muller A,Lange K,Gaiser T,et al.Expression of angiopoietin-1 and its receptor TEK in hematopoietic cells from patients with myeloid leukemia[J].Leuk Res,2002,26(2):163-168.

[5]Tarai M,Miwa H,Shikami M,et al.Expression of endothelial cell associated molecules in AML cells[J].Leukemia,2002,16(1):112-119.

[6]Schliemann C,Bieker R,padro T,et al.Expression of angiopoietins and their receptor Tie2 in the bone marrow of patients with acute myeloid leukemia[J].Haematologica,2006,91(9):1203-1211.

[7]Schliemann C,Bieker R,Thoennissen N,et al.Circulating angiopoietin-2 is a strong prognostic factor in acute myeloid leukemia[J].Leukemia,2007,21(9):1901-1906.

[8]劉新蘭，李亦功，魏健敏，等.Ang-2,Tie-2和VEGFR-2表達在大腸癌血管生成和預后中的作用[J].南方醫(yī)科大學學報，2012,32(11)：1658-1662.

[9]趙萍萍，皺容，屈元嬌，等.Ang-1和Ang-2及其受體Tie-2在鼻咽癌患者血循環(huán)中的表達及臨床意義[J].第三軍醫(yī)大學學報，2012,34(13)：1289-1292.

[10]劉少平，董衛(wèi)國，胡欽勇，等.外周血血管生成素-2表達與胃癌淋巴結微轉移及預后的關系[J].武漢大學學報：醫(yī)學版，2013,34(2)：285-292.

[11]Hashizume H,Falcón BL,Kuroda T,et al.Complementary actions of inhibitors of angiopoietin-2 and VEGF on tumor angiogenesis and growth[J].Cancer Res,2010,70(6):2213-2223.

[12]Mazzieri R,Pucci F,Moi D,et al.Targeting the ANG2/TIE2 axis inhibits tumor growth and metastasis by impairing angiogenesis and disabling rebounds of proangiogenic myeloid cells[J].Cancer cell,2011,19(4):512-526.

[13]Lewis CE,Ferrara N.Multiple effects of angiopoietin-2 blockade on tumors[J].Cancer Cell,2011,19(4):431-433.

A study of the expression of ANGPT1,ANGPT2 and VEGF in mouse model of acute myeloid Leukemia*

YangHong1,TianFengying2,ZhouZeping1,ShaoLiang3,ZhangYou1△

(1.DepartmentofHematology,theSecondAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming,Yunnan650101,China;2.DepartmentofPediatrics,KunmingYan′anHospital,Kunming,Yunnan650051,China;3.DepartmentofHematology,theAffiliatedZhongnanHospitalofWuhanUniversity,Wuhan,Hubei430071,China)

Objective To construct mouse model of acute myeloid leukemia and detect the expression of ANGPT1,ANGPT2 and VEGF gene on the cells its as well as the clinical significance.Methods The HL-60 cells were transfected to NOD/SCID mouse through abdominal injection to construct mouse model of acute myeloid leukemia.Then identify mouse model by histopathology and Flow Cytometry.The expression of ANGPT2,ANGPT1 and VEGF mRNA in the tumor tissues of mouse model was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.The expression of ANGPT2 will be analyzed on the survival time of mouse model by Spearman′s correlation method.Results Mouse model has been successfully identified by histopathology and Flow Cytometry.The expression of ANGPT2 and VEGF in mouse mode was significantly detected,which was that of higher than normal group (P<0.05).The expression of ANGPT1 was lower than that of ANGPT2 and VEGF,there was no significant difference between ANGPT1 and normal groups (P>0.05).The higher expression of ANGPT2 in mouse model had a short survival time in mouse with acute myeloid leukemia.Conclusion This study showed that ANGPT2 mRNA was over-expressed in acute myeloid leukemia.The increasing expression of ANGPT2 mRNA may lead to poor prognosis in mouse with acute myeloid leukemia.

acute myeloid leukemia;mouse model;ANGPT；vascular endothelial growth factor

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.05.004

云南省應用基礎研究計劃項目-聯(lián)合專項(2011FB198)。 作者簡介：楊紅(1977-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事血液系統(tǒng)疾病的臨床研究?！?/p>

,E-mial:youzhangmd@aliyun.com。

R733.7

A

1671-8348(2015)05-0586-04

2014-11-10

2014-12-10)