張 力,李 非，潘巍巍，孫霄云△

(1.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院康復醫(yī)學科，遼寧錦州 121001；2.遼河油田第二職工醫(yī)院外科,遼寧盤錦 124001；3.遼河油田總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧盤錦 124001)

·論著·

法舒地爾降低TLR4表達緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血后血管痙攣的實驗研究

張 力1,李 非2，潘巍巍3，孫霄云1△

(1.遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院康復醫(yī)學科，遼寧錦州 121001；2.遼河油田第二職工醫(yī)院外科,遼寧盤錦 124001；3.遼河油田總醫(yī)院呼吸內(nèi)科，遼寧盤錦 124001)

目的 建立兔蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后遲發(fā)性腦血管痙攣(DCV)模型，探討法舒地爾防治DCV的作用及相關(guān)信號通路。方法 60只新西蘭大白兔分為3組，每組20只。實驗組枕大池二次注血法建立SAH模型，對照組枕大池內(nèi)注入生理鹽水，治療組SAH模型建立后，法舒地爾靜脈給藥。血管造影及經(jīng)頗多普勒超聲(TCD)評估血管痙攣情況，造模后第7天取材井行蘇木素-伊紅染色觀察基底動脈痙攣情況。免疫組織化學和Mestern blot方法檢測基底動脈Toll受體4(TLR4)的表達。結(jié)果 SAH后血管痙攣模型造模成功，實驗組與對照組比較基底動脈直徑明顯降低(P<0.01);治療組基底動脈直徑較實驗組明顯增加(P<0.01)；免疫組織化學及Mestern blot顯示治療組基底動脈TLR4表達較實驗組明顯減少(P<0.05)。結(jié)論 SAH后DCV可能與TLR4信號通路有關(guān)，法舒地爾能顯著降低SAH后基底動脈TLR4表達，緩解SAH后DCV。

蛛網(wǎng)膜下腔出血；Toll樣受體4;白細胞介素10；遲發(fā)型腦血管痙攣；法舒地爾

蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)是神經(jīng)外科較為常見的疾病，SAH的致殘率、病死率均較高，遲發(fā)性腦血管痙攣(DCV)是SAH引起患者預后較差的主要原因[1]。當前，尚缺少行之有效的方案控制SAH，其引起腦血管痙攣的機制較為復雜,發(fā)生SAH后產(chǎn)生腦血管痙攣的病理生理機制還不明確，尚需要深入地進行研究，有報道指出炎性反應(yīng)有可能是SAH后出現(xiàn)DCV的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[2-3]。SAH的藥物治療，除擴容、升壓、血液稀釋、血管擴張劑的應(yīng)用外，尼莫地平是常用于預防血管痙攣的藥物之一，而近年出現(xiàn)的Rho激酶抑制劑法舒地爾在腦血管痙攣(CVS)防治方面的作用正受到越來越多的重視。有研究指出Rho信號通路與炎性信號因子Toll樣受體(TLRs)的表達密切相關(guān)，作為發(fā)現(xiàn)最早的TLR亞型之一，TLR4在炎性反應(yīng)相關(guān)的疾病中被給予極高的關(guān)注，原因是在識別細菌脂多糖及介導的炎性反應(yīng)信號傳導中，TLR4發(fā)揮了較為重要的作用[4-5]。目前對于法舒地爾通過Rho信號通路而影響TLR4表達的研究報道較少，本研究通過復制兔 SAH 模型，觀察法舒地爾對兔 SAH 后DCV的影響及TLR4的表達情況，以探討法舒地爾在 SAH后DCV防治中的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康純種新西蘭大白兔60只(清潔級)，雌雄不限，月齡4～6個月，體質(zhì)量2.5～3.0 kg。分為對照組(枕大池注入生理鹽水0.5 mL/kg，n=20)、實驗組(制備SAH模型，n=20)、治療組(SAH模型制備后法舒地爾靜脈注射，n=20)。所有實驗動物由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.2 DCV模型的制備 使用枕大池二次注血方式制備SAH模型。耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1 mg/kg)進行麻醉，后將兔俯臥于兔臺，電推去兔枕部體毛，顯露枕部穿刺處。局部皮膚碘附消毒，鋪無菌孔巾，取頭皮針末端連接1 mL注射器，向枕大池方向緩慢刺入，有落空感后繼續(xù)緩慢進針1～2 mm，輕輕回抽可見清亮腦脊液流出，緩慢抽取腦脊液約1 mL，兔耳中央動脈抽取動脈血立即緩慢注入枕大池(0.18 mL/kg)，3 min內(nèi)注射完成。注意觀察兔呼氣情況，注射后兔俯臥位，頭低30°放置約0.5 h，以保證血液積聚在基底動脈周圍。使用慶大霉素溶液擦拭穿刺口后無菌包扎。48 h后重復二次注血。對照組枕大池及靜脈注入等量0.9%氯化鈉注射液。治療組在枕大池注血后給予靜脈注射法舒地爾1 mg/kg。

1.3 神經(jīng)功能測評 在制備模型后，7 d內(nèi)的神經(jīng)缺損癥狀進行評分。按照Endo的評分標準[6]，評分分為4級。1級(0 分)：為無神經(jīng)功能缺損;2級(1分)：為輕度或可疑神經(jīng)功能缺損(嗜睡活動減少);3級(2分)：為中度神經(jīng)功能缺損(肢體無力跛行);4級(3分):為重度神經(jīng)功能缺損(劃圈運動或行走困難)。

1.4 經(jīng)顱多普勒超聲(TCD)檢測 在造模后第3天，進行腦血管造影前，使用TCD查看基底動脈痙攣情況。探頭為4 MHz，尋找適合的角度置于兔枕部，調(diào)整深度和方向至觀察到清晰穩(wěn)定的血流信號。記錄顯示屏的平均血流速度(MFV)和收縮期峰值流速(PSV)。

1.5 基底動脈血管造影分析 將兔給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，仰臥位于數(shù)字減影血管造影(DSA)操作臺，術(shù)區(qū)消毒后，顯微解剖下分離股動脈，套管式穿刺針穿刺股動脈，連接三通，以神經(jīng)介入常用的Echelon10微導管通過股動脈插入到主動脈弓。進入椎動脈后手推造影。使用DSA自帶軟件處理影像，選取5個測量點(基底動脈縱向中點，距中點上下各1 mm處，距離中點上下各2 mm處)測量基底動脈直徑，兩名測量者使用背靠背方式測量，計算平均直徑。DSA在制備SAH模型前(T1)，制備后第3 d(T2)和第7天(T3)進行。

1.6 標本的收集 在制備模型后7 d，麻醉后處死動物，原位灌注固定腦血管及腦組織，顯微解剖留取基底動脈，取基底動脈 1/2 段，蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察基底動脈管徑情況。

1.7 免疫組織化學檢測 基底動脈固定后制備蠟塊，橫斷位切片，脫蠟，微波修復，5%山羊血清封閉，PBS稀釋的一抗(兔抗TLR4和IL-10，1∶100稀釋)適量，-4 ℃冰箱過夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃恒溫箱孵育20 min，DAB顯色。切片放顯微鏡下觀察，細胞質(zhì)或細胞核顯現(xiàn)棕黃色為陽性，未顯現(xiàn)棕黃色為陰性。陰性反應(yīng)組用DPS緩沖液代替一抗。觀察和分析使用IPP軟件，隨機視野為每個組織5個點。染色范圍分4級，+：染色范圍小于1/4視野；++：染色范圍在1/4～1/2視野；+++：染色范圍在1/2～3/4視野；++++：染色范圍大于3/4視野。分為4個染色等級，陰性(-)、弱陽性(+)、中等陽性(++)、強陽性(+++)。染色范圍和染色等級被轉(zhuǎn)換成染色指數(shù)。染色指數(shù)=染色范圍×染色等級。其中-為0分，+為1分，++為2分，+++為3分，++++為4分。

1.8 Western blot檢測 將留取的基底動脈組織制備成勻漿，應(yīng)用蛋白裂解液，行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素薄膜，TBST浸洗，封閉液封閉，與稀釋的一抗混合孵育。TBST浸洗后在室溫下同二抗混合孵育。再次TBST浸洗后加入發(fā)光顯色劑進行顯色。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)分析條帶光的密度。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分 對照組0分，無神經(jīng)功能障礙。實驗組(2.2±0.73)分、治療組(1.3±0.22)分，治療組與實驗組比較差異有統(tǒng)計意義(P<0.05)。

2.2 基底動脈血流速度 與對照組比較，實驗組基底動脈的腦血流平均流速(MFV)和最大峰流速(PSV)明顯升高(P<0.05)。治療組與實驗組比較，MFV和PSV明顯降低(P< 0.05)。蛛網(wǎng)膜下腔出血3 d后對照組、實驗組、治療組動物出現(xiàn)TCD典型表現(xiàn)。與對照組比較，蛛網(wǎng)膜下腔出血后MFV和PSV明顯增加。與實驗組比較，治療組血流速度(MFV、PSV)明顯降低，見圖1。

A：MFV；B：PSV。

圖1 TCD測量基底動脈腦血流速

2.3 基底動脈直徑 DSA顯示不同組別基底動脈直徑痙攣的情況。對照組血基底動脈無痙攣，實驗組血管痙攣明顯，基底動脈纖細，治療組血管痙攣明顯緩解，DSA圖未呈現(xiàn)。在T2和T3時間，實驗組和治療組中基底動脈的管徑較對照組基底動脈管徑減小，實驗組基底動脈平均直徑明顯小于治療組的直徑，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

表1 基底動脈直徑

a：P<0.01，與 T1時間比較;b:P<0.01，與對照組比較;c:P<0.01，與實驗組比較。

2.4 基底動脈HE染色 基底動脈HE染色圖像中：實驗組可見明顯血管痙攣，管壁內(nèi)膜皺褶，增厚，可見炎性細胞浸潤，對照組和治療組中基底動脈痙攣和周圍的炎性反應(yīng)均較輕，無明顯痙攣，見圖2。

A：對照組；B：實驗組；C：治療組。

圖2 HE染色觀察基底動脈血管痙攣改變

2.5 免疫組織化學表達 軟件分析各組基底動脈的免疫組化表達結(jié)果，實驗組中TLR4及IL-10表達與對照組相比顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療組基底動脈TLR4及IL-10與實驗組比較表達顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 TLR4和IL-10的免疫組織化學檢測

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較;c：P<0.05，與實驗組比較。

2.6 Western blot檢測結(jié)果 Western blot檢測基底動脈中TLR4和IL-10表達，結(jié)果顯示實驗組TLR4和IL-10表達與對照組比較顯著升高(P<0.05)；與實驗組相比，治療組基底動脈TLR4和IL-10表達顯著減少(P<0.05)，見圖3、4，表3。

圖3 TLR4的Western blot檢測

圖4 IL-10的Western blot檢測

表3 基底動脈TLR4和IL-10蛋白表達

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較;c：P<0.05，與實驗組比較。

3 討論

本研究中采用枕大池二次注血方式制備SAH模型，該制模方式是目前研究腦血管痙攣機制實驗中較為常用的方法[7-8]，基底動脈痙攣程度可以通過DSA檢測證實,此外在形態(tài)學改變上和人類較為相似。本研究中，枕大池初次注血7 d后處死實驗動物，發(fā)現(xiàn)實驗組和治療組中均可觀察到基底動脈周圍及基底動脈池內(nèi)有血塊聚集，而且實驗組基底動脈血管管徑明顯痙攣、減小，證明模型的反應(yīng)良好，適合本實驗的需求。

TLRs是一種模式識別受體，在炎性反應(yīng)以及固有免疫中都發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)13種哺乳動物的TLRs，這些受體能夠識別各種器官的病原分子模式[9]。此外，TLRs能夠識別破壞相關(guān)的分子模式，而且還能夠為主要的損傷性炎性反應(yīng)作中介。從本研究實驗組基底動脈中TLR4的表達顯著提高，此結(jié)果表明TLR4有可能介導了DCV的發(fā)生。有研究指出，在鼠的顱內(nèi)出血模型內(nèi)，一些內(nèi)在的配體能夠激活TLR4，使之表達上調(diào)，包括亞鐵血紅素以及纖維蛋白原等，TLR4的上調(diào)則進一步導致嚴重后果[10]。本研究中，實驗組基底動脈TLR4和IL-10表達均高于對照組，提示SAH后出現(xiàn)某種配體，其可以同TLR4結(jié)合進一步介導炎性反應(yīng)的發(fā)生，從而通過信號傳導系統(tǒng)，促使IL-10表達上調(diào)，IL-10又進一步參與CVS發(fā)生、發(fā)展。

相關(guān)研究報道提示[11]，在SAH后DCV發(fā)生的過程中，Rho/Rho激酶途徑可能發(fā)揮了重要的作用。鹽酸法舒地爾注射液，是一種新型Rho(絲氨酸/蘇氨酸蛋白)激酶抑制藥，是一種新型異喹啉磺胺衍生物，其主要通過阻斷血管收縮過程的最終階段——肌球蛋白輕鏈磷酸化來擴張血管，抑制血管痙攣，從而保護缺血腦組織，進而達到防治腦血管痙攣的目的，保護了腦神經(jīng)細胞，改善患者臨床預后。法舒地爾具備雙重的抑制磷酸化作用[12]，主要表現(xiàn)為3個方面:(1)抑制激酶，增加生成，發(fā)揮保護損傷組織的作用[13];(2)拮抗激酶，抑制炎性細胞，降低炎癥介質(zhì)數(shù)量及減少炎性反應(yīng)，發(fā)揮抑制蛋白水解和細胞凋亡的作用;(3)阻斷激酶抑制肌球蛋白輕鏈激酶，抑制鈣敏化的效應(yīng)，發(fā)揮舒張平滑肌，擴張血管的作用[14]。

有研究指出Rho/Rho激酶途徑由TLR介導的信號通路發(fā)揮作用[15]，本研究結(jié)果顯示法舒地爾可以顯著減少TLR4表達，其機制與其抑制激酶的作用密切相關(guān)。很多研究報道指出，腦血管痙攣引起炎癥滲出，腦水腫加重和細胞凋亡，最后導致血腦屏障的破壞以及腦細胞的大量死亡[14,16]。本研究使用靜脈注射法舒地爾觀察其防治DCV的效果，結(jié)果提示給藥后第5天其抑制痙攣效果最顯著，隨后的效果并不明顯，這可能與SAH后血腦屏障的自我修復以及腦啟動的某種血管保護機制有關(guān)系。研究還發(fā)現(xiàn)在治療組基底動脈的IL-10表達水平顯著降低，主要是因為法舒地爾抑制了TLR4受體表達后，進一步減少了其下游IL-10的表達，這提示TLR4信號通路在SAH后DCV的發(fā)生、發(fā)展中具有重要的地位。

綜上所述，靜脈注射法舒地爾能夠在動物模型中有效地抑制蛛網(wǎng)膜下腔出血后的血管痙攣反應(yīng)，作為 Rho/Rho激酶途徑的抑制劑，法舒地爾能夠減少血管組織中TLR4的表達從而降低炎性反應(yīng)，最終緩解血管痙攣。

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Fasudil relives cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage by inhibiting TLR4 expression

ZhangLi1,LiFei2,PanWeiwei3,SunXiaoyun1△

(1.DepartmentofRehabilitationMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicaluniversity,Jinzhou,Liaoning121001,China；2.DepartmentofSurgery,No.2Workers′HospitalofLiaoheOilfield,Panjin,Liaoning124001,China；3.DepartmentofRespiratoryMedicine,GeneralHospitalofLiaoheOilfield,Panjin,Liaoning124001,China)

Objective To study the effect of Toll-like receptor 4 inhibitor Fasudil on cerebral vasospasm after SAH.Methods A total of 60 New Zealand rabbits were randomly divided into three groups,20 rabbits for each group，SAH group:SAH model was established by autologous blood injection into the cisterna magna.Control group:saline was injected into cisterna magna.Fasudil group:Fasudil was injected into vein after SAH model.Vasospasm was valued by DSA and TCD.Seven days after operation basilar artery were collected.HE stain was used to observe vasospasm.TLR4 were observed by immunohistochemistry and western blotting.Results Vasospasm model after SAH was successfully established.The basilar artery diameters were significantly shorter in the model group compared with the normal group (P<0.01).The artery diameter in Fasudil group increased significantly compared with SAH group(P<0.01).The expression of TLR4 decreased significantly in the Fasudil group compared with the model group(P<0.05).Conclusion Toll-like receptor 4 pathway may be associated with cerebral vasospasm (DCV).Fasudil could inhibit TLR-4 expression and prevent cerebral vasospasm following subarachnoid hemorrhage.

subarachnoid hemorrhage;Toll-like receptor 4;interleukin 10;cerebral vasospasm;Fasudil

張力(1982-)，護師，本科，主要從事康復醫(yī)學研究?！?/p>

,E-mail：sunxiaoyun1983@126.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.05.003

R743.35

A

1671-8348(2015)05-0583-03

2014-10-18

2014-12-10)