王海峰，張 紅

1武警工程大學(xué)醫(yī)院，陜西 西安 710086；2陜西省中醫(yī)藥研究院

不同大孔吸附樹脂對(duì)葛根總黃酮分離純化效果的影響*

王海峰1，張 紅2

1武警工程大學(xué)醫(yī)院，陜西 西安 710086；2陜西省中醫(yī)藥研究院

目的：考察三種大孔吸附樹脂對(duì)葛根總黃酮的吸附及解吸性能，為分離純化葛根總黃酮提供選擇依據(jù)。方法：以葛根總黃酮為篩選指標(biāo)，考察A B-8、N K A和X-5三種大孔樹脂對(duì)葛根總黃酮的吸附量和解吸率。結(jié)果：以A B-8樹脂為吸附劑。最佳分離條件為上樣濃度：1 g/m L(按生藥計(jì)算)，流速：2～3 m L/m i n，70%乙醇為洗脫劑，用量為2.5 BV，總黃酮得率76.22%。結(jié)果：A B-8大孔吸附樹脂可用于分離純化葛根總黃酮，總黃酮得率76.22%。結(jié)論：三種大孔吸附樹脂相比較，以A B-8為分離純化葛根總黃酮的最佳吸附劑。

葛根總黃酮；葛根素；大孔吸附樹脂

葛根(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)是豆科落葉藤本植物野葛根，最早載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性平，味甘辛，功效解肌退熱，生津止渴，升陽(yáng)透疹［1］。藥理研究發(fā)現(xiàn)葛根具有抗缺氧，改善腦循環(huán)，保護(hù)心肌缺血，降血壓等作用［1-4］。臨床主要用于急性腦梗塞，急性心肌梗塞，不穩(wěn)定性心絞痛，高粘血癥的治療［5-8］。葛根含黃酮類化合物高達(dá)7.6%，主要有葛根素、大豆素、大豆素4′，7-二葡萄糖苷黃豆苷等［9-10］。本研究采用葛根70%乙醇回流得到粗提液為原料，比較AB-8、NKA-9和X-5三種大孔吸附樹脂對(duì)葛根總黃酮的分離效果，并考察AB-8大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮的工藝和方法。

1 材料與方法

1.1 材料 葛根采自陜西省安康市鎮(zhèn)平縣。葛根素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110752-200511；AB-8、NKA及X-5大孔吸附樹脂購(gòu)于天津南開大學(xué)化工廠；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器 UV-2201型紫外分光光度計(jì)；層析柱(φ15 mm×200 cm)。

1.3 方法

1.3.1 葛根粗提液制備 將葛根藥材(300 g)烘干，粉碎成粗粉，采用30%乙醇為溶劑回流提取3次，1.5h/次，濾過，濾液合并，減壓濃縮至300mL，得到葛根粗提液。

1.3.2 葛根總黃酮含量測(cè)定 以葛根素為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測(cè)定葛根總黃酮含量。

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取葛根素4.88 mg，置于25 mL量瓶中，加95%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲(chǔ)備液(含葛根素0.1952mg/mL)。精密量取儲(chǔ)備液 0.00，0.40，0.80，1.20，1.60，2.00 mL，置于25 mL量瓶中，加95%乙醇稀至刻度，搖勻。分別于254 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并建立濃度對(duì)吸光度的線性回歸方程：A=62.216C+ 0.0043；相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2.2 含量測(cè)定 取葛根粗提液0.1 mL，置于25 mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度，搖勻。另取1.0 mL乙醇同法稀釋作空白對(duì)照，在254 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。計(jì)算葛根總黃酮的含量，結(jié)果為3.997 mg/mL。

1.3.3 3種大孔吸附樹脂吸附性能的比較(柱層析分離純化)

1.3.3.1 大孔吸附樹脂預(yù)處理 AB-8、NKA和X-5 3種樹脂各取100 g，加95%乙醇適量，浸泡3天，讓樹脂充分溶脹，然后用95%乙醇洗脫至流出液中加水后無白色渾濁出現(xiàn)，再用蒸餾水洗盡乙醇，備用。

1.3.3.2 吸附量與解吸率測(cè)定 精密稱取預(yù)處理過的樹脂5 g，置于三角瓶中，精密加入葛根粗提液50 mL，振蕩24小時(shí)，濾過，測(cè)定濾液中總黃酮濃度。計(jì)算3種樹脂的吸附量和吸附率。再向吸附的樹脂中精密加入95%乙醇50 mL，振蕩24小時(shí)，濾過，測(cè)定濾液中總黃酮濃度，根據(jù)總黃酮解吸量計(jì)算解吸率。

2 結(jié)果

2.1 吸附量與解吸率測(cè)定結(jié)果 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立以“1.3.2.1”項(xiàng)下方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立總黃酮濃度對(duì)吸光度的線性回歸方程：A=66.163C+ 0.043 5；r=0.999 5，計(jì)算吸附量和解吸率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見3種樹脂中，AB-8大孔樹脂對(duì)葛根總黃酮的吸附量和解吸率最大，見表1。

表1 3種樹脂對(duì)葛根總黃酮的吸附量與解吸率測(cè)定 m g

2.2 A B-8大孔樹脂對(duì)葛根總黃酮的分離純化

2.2.1 吸附流速對(duì)吸附效果的影響 吸附流速對(duì)吸附效果的影響主要是影響溶質(zhì)向樹脂表面的擴(kuò)散。如果流速太高，溶質(zhì)分子來不及擴(kuò)散到樹脂表面，就會(huì)發(fā)生漏過。對(duì)相同的葛根浸提液(50mL)在相同條件下，分別進(jìn)行了AB-8樹脂在吸附流速為小流速(2～3 mL/min)，中檔流速(4～5 mL/min)、最高流速(6～7 mL/min)的吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明流速為2～3 mL/min時(shí)黃酮洗脫量最大，見表2。

表2 吸附流速對(duì)吸附效果的影響

2.2.2 洗脫劑及洗脫濃度的選擇 取AB-8樹脂，濕法裝柱(徑高比1∶15)，準(zhǔn)確吸取50 mL樣品原液，以流速1 mL/min上柱，分別準(zhǔn)確配制30%、50%、70%、80%和90%的乙醇洗脫劑，檢測(cè)它們?cè)谙嗤瑮l件下通過樹脂柱時(shí)的解吸率，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)70%以下乙醇洗脫曲線光滑，無拖尾，其解吸率適中，因此選用70%乙醇洗脫，見表3，洗脫曲線見圖2。

表3 不同濃度乙醇洗脫劑對(duì)吸附效果的影響

2.2.3 洗脫劑用量的選擇 用AB-8大孔樹脂(樹脂體積25 mL)飽和吸附葛根粗提液，分別用60、90、120、150、180、200、240、270 mL 70%的乙醇洗脫，收集每一樹脂流出液體積，計(jì)算黃酮洗脫率，依據(jù)累積洗脫率確定70%乙醇用量，見表4。

表4 洗脫劑用量考察結(jié)果

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)洗脫劑用量大于8倍樹脂體積得到的黃酮量少，因70%乙醇用量是樹脂體積5倍時(shí)洗脫率累積達(dá)到76.22%，說明此時(shí)大孔樹脂吸附的黃酮已基本被洗脫下來，并且在其用量為4倍樹脂體積時(shí)洗脫率為58.55%。當(dāng)70%乙醇用量為樹脂體積5～8倍時(shí)，黃酮洗脫率的累積值較小，說明70%乙醇用量大于5倍樹脂體積得到的黃酮量少，因此確定體積分?jǐn)?shù)70%乙醇的最適宜用量為5倍樹脂體積。

圖2 不同濃度乙醇洗脫劑的洗脫曲線

3 結(jié)論

大孔樹脂(macroporous resin)是以苯乙烯和丙酸酯為單體，加入乙烯苯為交聯(lián)劑，甲苯、二甲苯為致孔劑，經(jīng)聚合反應(yīng)制備而成。聚合物形成后，除去致孔劑，樹脂中留下了大小不一、形狀各異、互相貫通的孔洞。是分離中草藥水溶性成分的一種有效方法［11］。

3種樹脂中AB-8對(duì)葛根總黃酮和葛根素具有較高的吸附量，對(duì)葛根總黃酮的解吸率超過75%，可用于葛根總黃酮的分離純化。通過動(dòng)態(tài)吸附、解吸的方法，以總黃酮吸附率和解吸率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)AB-8大孔吸附樹脂分離純化葛根總黃酮效果影響的最佳條件為：以70%乙醇為洗脫劑、用量為樹脂體積的5倍，吸附流速2～3 mL/min。葛根總黃酮收率為76.22%，表明AB-8大孔樹脂純化法能夠富集葛根黃酮，適合于葛根黃酮的純化。

［1］ 徐國(guó)鈞，何宏賢.中國(guó)藥材學(xué)［M］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1996:249.

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Influence of Macroporous Adsorption Resin on Purification of Total Flavonoids from GeGen

WANG Haifeng1,ZHANG Hong2
1 Hospital Affiliated to Engineering University of CAPF,Xi′an 710086,China;
2 Shaanxi Provincial Academy of Traditional Chinese Medicine

Objective:To provide reference for purifying total flavonoids from GeGen［Puerariae lobata(Willd.) ohwi］by observing adsorption and desorption of macroporous absorption resin to total flavonoids from GeGen. Methods:By taking total flavonoids from GeGen as screening index,adsorption volume and desorption rate of total flavonoids from GeGen were investigated by three kinds of macroporous adsorption resins AB-8,NKA and X-5.Results:AB-8 resin was taken as adsorbent.The optimal separation conditions were sample concentrations:1 g/mL(calculated according to crude drugs),flow rate:2～3 mL/min,70%ethanol as eluent,dosage:2.5BV,total flavonoids yield was 76.22%.Conclusion:AB-8 is chosen as the best adsorbent of separating and purifying total flavonoids from GeGen after comparing three kinds of macroporous absorption resins.

total flavonoids from GeGen;puerarin;macroporous absorption resin

R567.1

A

1004-6852(2015)11-0027-03

2014-11-29

西安市科技計(jì)劃項(xiàng)目［編號(hào) SF0931(1)］。

王海峰(1976—)，男，主管藥師。研究方向：中藥藥劑學(xué)。