王懿萍，尹 曄，王盛民，劉睿穎，熊 雄

1西南交通大學(xué)峨眉校區(qū)，四川 峨眉 614202；2西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院

生脈膨化膠囊對(duì)免疫功能低下小鼠的影響*

王懿萍1，尹 曄2，王盛民2，劉睿穎2，熊 雄1

1西南交通大學(xué)峨眉校區(qū)，四川 峨眉 614202；2西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院

目的：觀察生脈膨化膠囊對(duì)免疫功能低下小鼠的影響。方法：采用環(huán)磷酰胺造免疫抑制小鼠模型，通過(guò)觀察小鼠臟器指數(shù)、小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化及骨髓D N A含量測(cè)定，評(píng)價(jià)生脈膨化膠囊對(duì)免疫功能低下小鼠的影響。結(jié)果：各劑量組臟器指數(shù)均高于正常組，中劑量組的胸腺、脾臟、腎臟指數(shù)明顯高于模型組（P＜0.05），肝臟指數(shù)高于模型組（P＜0.05）；高、中劑量組相對(duì)于模型組能顯著提升淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)（P＜0.05）；各劑量組D N A含量明顯高于模型組（P＜0.05）。結(jié)論：生脈膨化膠囊具有增加小鼠免疫功能的作用，在多方面優(yōu)于傳統(tǒng)生脈膠囊。

生脈膨化膠囊；生脈膠囊；免疫功能

生脈散又名生脈飲，由紅參、麥冬、五味子組成，是益氣養(yǎng)陰的傳統(tǒng)古方?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有鎮(zhèn)靜、提高心臟對(duì)缺氧耐受力、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和增強(qiáng)心肌收縮力的作用，廣泛用于急性心肌梗死、冠心病、心絞痛、心源性休克及感染性休克的治療［1］。中藥膨化技術(shù)借助食品膨化原理，對(duì)中藥材進(jìn)行膨化處理，使之結(jié)構(gòu)疏松，有效成分易于溶出。紅參膨化前后的化學(xué)成分基本一致，其指紋圖譜相似度大于0.99［2］。因此，我們將生脈散組方中的紅參進(jìn)行膨化處理后制備了生脈膨化膠囊。已有研究表明：紅參膨化處理后得到的生脈膨化膠囊和普通生脈膠囊比較，人參總皂苷含量并無(wú)顯著性差異，但前者具有釋藥更快的特點(diǎn)［3］。筆者分析2種生脈膠囊對(duì)環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下小鼠的影響，探討膨化技術(shù)在中藥加工中應(yīng)用的可行性。

1 材料與方法

1.1 儀器 m312604型離心機(jī)(北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司提供)；TU1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (北京普析通用儀器有限公司提供)；BJHA-PYC30型CO2恒溫培養(yǎng)箱(北京中西化玻儀器有限公司提供)；JY10001型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠提供)；精密天平。1.2 試劑 環(huán)磷酰胺注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：08121021)；刀豆球蛋白A(ConA) Sigma公司生產(chǎn)，批號(hào)：11028-71-0)；噻唑藍(lán)(上海伯奧生物科技公司分裝，批號(hào)：970408)；酸性異丙醇；PBS緩沖液(自制：稱取磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀，吐溫-20，加水，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆?；臺(tái)盼藍(lán)染色劑(上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：B11000468)；RPMI1640培養(yǎng)液 (上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：B11000180)。

1.3 試藥 生脈膠囊(自制)，生脈膨化膠囊(自制)，制備方法見(jiàn)文獻(xiàn)［3］。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠(22±2)g，雌雄各半，購(gòu)于四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專委會(huì)養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法 昆明種小鼠90只，隨機(jī)分為正常組、模型組、生脈膠囊組、生脈膨化膠囊高、中、低劑量組共6組。正常組生理鹽水灌胃，1次/d，0.5 mL/次，連續(xù)15天；模型組從第1天開(kāi)始，每天1次腹腔注射環(huán)磷酰胺20mg/kg)，共注射5次，每天灌胃生理鹽水0.5 mL，連續(xù)15天；生脈膠囊及生脈膨化膠囊高、中、低劑量組除每天1次腹腔注射環(huán)磷酰胺(劑量同模型組，共5次)外，每天灌胃藥物0.5mL(生脈膠囊組：0.82 g/kg，0.1 g/mL；生脈膨化膠囊高劑量組：1.64 g/kg，0.1 g/mL；生脈膨化膠囊中劑量組：0.82 g/kg，0.1 g/mL；生脈膨化膠囊低劑量組：0.41g/kg，0.1g/mL)，連續(xù)15天。1.6 臟器指數(shù) 給小鼠稱重并記錄體質(zhì)量，最后1天斷頭處死小鼠，取出肝臟、腎臟、脾臟和胸腺，分別用生理鹽水漂洗，濾紙吸干，在電子分析天平上稱重，計(jì)算臟器指數(shù)。

1.7 ConA誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化 脾細(xì)胞懸液制備：無(wú)菌取脾，研磨，過(guò)200目篩，PBS液沖洗，收集分離的脾細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5～10分鐘，棄上清；加紅細(xì)胞裂解液10 mL，混勻脾細(xì)胞，靜置4～5分鐘，待紅細(xì)胞完全破碎，1500r/min離心10分鐘，棄上清液去除紅細(xì)胞，PBS液洗2～3遍，將細(xì)胞懸浮于1 mL完全培養(yǎng)液中，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)在95%以上，調(diào)整細(xì)胞密度2× 106個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)6個(gè)復(fù)孔(加ConA液50 μL，相當(dāng)于5 μg/mL)，同時(shí)設(shè)對(duì)照孔6個(gè)(加RPMI1640培養(yǎng)液50 μL)。置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)，每孔加入20μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，1 000 r/min離心5分鐘，棄上清，每孔加100 μL酸性異丙醇，吹打均勻，使紫色結(jié)晶完全溶解，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(570 nm)測(cè)吸光度(A)。

1.8 骨髓D N A含量 取小鼠右側(cè)股骨，除凈軟組織，用0.005 mol/L，CaCl210 mL將全部骨髓沖入離心管，置4℃冰箱30分鐘，2 500 r/min離心15分鐘，棄上清，將沉淀物加入0.2 mol/L，HClO45 mL中，90℃加熱15分鐘，冷卻過(guò)濾，濾液在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(260 nm)測(cè)A(1A代表50 μm/mL雙鏈DNA)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的影響 模型組小鼠注射環(huán)磷酰胺后，胸腺、脾臟和肝臟指數(shù)均有不同程度下降，表明環(huán)磷酰胺可使小鼠上述器官萎縮。對(duì)胸腺指數(shù)的影響：與模型組比較，生脈膨化膠囊各劑量組和生脈膠囊組均能明顯提高免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與生脈膠囊組比較，生脈膨化膠囊中劑量組可提高免疫抑制小鼠胸腺指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；生脈膨化膠囊各劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 對(duì)脾臟指數(shù)的影響 與模型組比較，生脈膨化膠囊各劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，生脈膠囊組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；與生脈膠囊組比較，生脈膨化膠囊中、低劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠脾臟指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)；生脈膨化膠囊各組之間比較，中劑量組與高、低劑量組之間差異顯著，但高、低劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，說(shuō)明中劑量組效果顯著。見(jiàn)表1。

表1 各組胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)比較 m g/g

2.3 對(duì)肝臟指數(shù)的影響 與模型組比較，生脈膠囊組和生脈膨化膠囊中、低劑量組均可明顯提高免疫抑制小鼠肝臟指數(shù)，具有顯著差異(P＜0.05)；生脈膨化膠囊各劑量組比較，中劑量組與高、低劑量組之間差異顯著(P＜0.05)，但高、低劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 對(duì)腎臟指數(shù)的影響 與模型組比較，生脈膠囊組、生脈膨化膠囊高、低劑量組可提高免疫抑制小鼠腎臟指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，生脈膨化膠囊中劑量組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；與生脈膠囊組比較，生脈膨化膠囊中劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠腎臟指數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；生脈膨化膠囊各劑量組間比較，中劑量組與高、低劑量組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，但高、低劑量組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組肝臟指數(shù)及腎臟指數(shù)比較 m g/g

2.5 對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響 與模型組比較，生脈膠囊組，生脈膨化膠囊高、中劑量組可明顯提高ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表3。

表3 生脈膨化膠囊對(duì)ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力的影響

2.6 對(duì)骨髓D N A含量的影響 與模型組比較，生脈膠囊組，生脈膨化膠囊各劑量組可明顯提高免疫抑制小鼠骨髓DNA含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表4。

表4 生脈膨化膠囊對(duì)免疫抑制小鼠骨髓D N A含量的影響

3 討論

胸腺和脾臟是動(dòng)物體內(nèi)主要的免疫器官，免疫器官重量是反映機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)，胸腺和脾臟指數(shù)的高低能客觀反映機(jī)體非特異性免疫功能。生脈膨化膠囊各劑量組臟器指數(shù)均高于正常組，中劑量組胸腺、脾臟、腎臟指數(shù)明顯高于模型組(P＜0.05)，肝臟指數(shù)高于模型組(P＜0.05)。因此，生脈膨化膠囊對(duì)由環(huán)磷酰胺引起的免疫器官及主要臟器變化有一定保護(hù)作用，中劑量組效果優(yōu)于傳統(tǒng)生脈膠囊(P＜0.05)。

在ConA誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)明顯降低。傳統(tǒng)生脈膠囊組及生脈膨化膠囊高、中劑量組能顯著提升免疫抑制小鼠的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)(P＜0.05)。淋巴細(xì)胞是反映特異性免疫的一個(gè)重要指標(biāo)，生脈膨化膠囊能顯著提高免疫抑制小鼠的淋巴增值反應(yīng)，說(shuō)明生脈膨化膠囊能夠有效地提高機(jī)體特異性免疫功能。

環(huán)磷酰胺造模后，模型組小鼠骨髓DNA含量最低，提示環(huán)磷酰胺具有明顯的骨髓抑制作用。生脈膨化膠囊各劑量組DNA含量明顯高于模型組(P＜0.05)，高劑量組高于傳統(tǒng)生脈膠囊組。骨髓屬于免疫器官，機(jī)體內(nèi)所有細(xì)胞(包括巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞等)都能在骨髓中產(chǎn)生，因此骨髓DNA含量的恢復(fù)能在某種程度上反映免疫功能的強(qiáng)弱。生脈膨化膠囊能顯著提高免疫抑制小鼠骨髓DNA含量，提示生脈膨化膠囊對(duì)環(huán)磷酰胺所致骨髓損傷具有一定的保護(hù)作用，能有效保護(hù)生物體的免疫系統(tǒng)。

綜上所述，生脈膨化膠囊對(duì)環(huán)磷酰胺致免疫功能低下小鼠的免疫功能具有恢復(fù)作用，且在多方面表現(xiàn)要優(yōu)于傳統(tǒng)生脈膠囊，說(shuō)明膨化技術(shù)用于生脈散中的紅參膨化是可行的。

［1］ 彭明勇，李艷.生脈散的臨床應(yīng)用及藥理研究［J］.中醫(yī)中藥，2012，10(1)：224-226.

［2］ 張翠英.人參膨化炮制及膨化飲片的質(zhì)量研究［D］.成都：西南交通大學(xué)，2006.

［3］ 王懿萍，姜怡，王盛民.中藥膨化技術(shù)用于生脈膠囊的可行性研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2010，21(1)：174-176.

The Effects of ShengMai Puffed Capsules on the Mice with Immune Dysfunction

WANG Yiping1,YIN Ye2,WANG Shengming2,LIU Ruiying2,XIONG Xiong1
1 Emei Branch of Southwest Jiaotong University,Emei 614202,China; 2 School of Life Science and Engineering of Southwest Jiaotong University

Objective:To observe the effects of ShengMai puffed capsules on the mice suffering from immune dysfunction.Methods:Immunodepression mice were prepared with cyclophosphamide,the effects of ShengMai puffed capsule on the mice with immune dysfunction were assessed by observing organ index,splenic lymphocyte transformation and detecting DNA contents of bone marrow.Results:Different doses groups were higher than the normal group in organ indexes,moderate dose group was higher than the model group in thymus index,spleen index and kidney index obviously (P＜0.05),higher than the model group in liver index (P＜0.05);compared with the model group,high and moderate doses groups could significantly raise lymphocyte proliferation(P＜0.05);different doses group was higher than the model group in DNA contents(P＜0.05).Conclusion:ShengMai puffed capsules could improve immune function of the mice,it's superior to traditional ShengMai capsules in many aspects.

ShengMai puffed capsules;ShengMai capsules;immune function

R285.5

A

1004-6852(2015)10-0009-03

2015-02-10

四川省科技攻關(guān)計(jì)劃(編號(hào)2006Z08-021)；成都市科技局科技攻關(guān)計(jì)劃(編號(hào)07G G Y B100SF-010)。

王懿萍(1963—)，女，碩士學(xué)位，教授。研究方向：中藥質(zhì)量控制研究。