李 凱，吳正祥，楊 楓

大麻素受體-2對小鼠結(jié)腸炎作用機(jī)制研究

李 凱1，吳正祥1，楊 楓2

目的觀察大麻素受體-2（CB2）對急性實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎的作用，探討CB2對腸黏膜內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）影響。方法32只SPF小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、CB2激動(dòng)劑組、CB2拮抗劑組，每組8只。記錄小鼠疾病活動(dòng)度及結(jié)腸組織病理學(xué)評分，ELISA法檢測結(jié)腸組織中炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）水平，免疫組化法檢測結(jié)腸組織CB2及ERS相關(guān)蛋白GRP78、CHOP表達(dá)，RT-PCR法檢測結(jié)腸組織中GRP78、CHOP mRNA水平。結(jié)果與正常組比較，模型組TNF-α水平顯著上調(diào)、IL-10水平下降（P ＜0.05），GRP78、CHOP蛋白及mRNA顯著增高（P＜0.05）。與模型組比較，CB2激動(dòng)劑組CB2表達(dá)明顯增多（P＜0.05），TNF-α水平下降（P＜0.05），IL-10水平增多（P＜0.05），GRP78、CHOP蛋白及mRNA顯著下降（P＜0.05）。CB2拮抗劑組TNF-α、IL-10、ERS標(biāo)記物水平與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸黏膜存在劇烈的ERS，CB2激動(dòng)劑激活CB2表達(dá)后緩解結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥，可能與CB2抑制腸黏膜ERS有關(guān)。

結(jié)腸炎；大麻素受體-2；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；GRP78

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一類胃腸道慢性免疫異常疾病，包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是IBD發(fā)生的重要機(jī)制之一，抑制ERS對緩解腸內(nèi)炎癥有重要作用。大麻素受體－2（cannabinoid receptor－2，CB2）是體內(nèi)新近發(fā)現(xiàn)的新型物質(zhì)，研究［1］顯示CB2能夠改善腸內(nèi)炎癥，但其具體機(jī)制不明。該實(shí)驗(yàn)通過建立急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠模型，觀察CB2對小鼠結(jié)腸炎的作用，并從ERS方面探討CB2改善結(jié)腸炎的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只SPF級雄性C57BL／6小鼠，6周齡，體重18～22 g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.2 主要試劑 葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS，相對分子質(zhì)量5 000）、CB2激動(dòng)劑JWH-133（美國Sigma公司）；CB2拮抗劑AM630（英國Tocris公司）；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）ELISA試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）；CB2單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；GRP78、CHOP多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素SP染色試劑盒及DAB顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；TRIzol試劑（上海Roche公司）；RT試劑盒、DNA Marker （DL1000，大連TaKaRa公司）；RT-PCR引物（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；大便隱血檢測試劑盒（杭州艾康生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組及急性結(jié)腸炎模型建立 將50只C57BL／6小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，挑選體重、健康程度接近的小鼠32只，編號后隨機(jī)分為正常組、模型組、干預(yù)組（CB2激動(dòng)劑組和CB2拮抗劑組），每組8只。模型組和干預(yù)組小鼠連續(xù)飲用5%DSS蒸餾水7 d，正常組飲用普通蒸餾水，以大便帶血（大便隱血試劑盒檢測）、稀便、體重減輕作為急性結(jié)腸炎造模成功標(biāo)志［2］。造模結(jié)束后，將CB2激動(dòng)劑JWH-133、CB2拮抗劑AM630溶于3%DMSO，按10 mg／（kg·d）劑量分別給予對應(yīng)干預(yù)組小鼠腹腔注射，每天1次，連續(xù)干預(yù)7 d［3］，正常組、模型組腹腔注射等體積3%DMSO＋0.9%NaCl溶媒作為對照。

1.2.2 觀察指標(biāo)及檢測方法 ①疾病活動(dòng)度（disease activity index，DAI）評分，DAI＝（體重指數(shù)＋大便形狀＋出血情況）／3［4］；②病理學(xué)評分：給藥結(jié)束后，禁食1 d，取出結(jié)腸組織，PBS沖洗后縱切，在結(jié)腸末端（距肛門1 cm處）剪取0.5 cm結(jié)腸，經(jīng)中性福爾馬林固定、石蠟包埋后切片，行HE染色，根據(jù)Cooper et al［5］組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理學(xué)評分（histopathological score，HS）；③ELISA法檢測結(jié)腸組織TNF-α、IL-10表達(dá)：嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟；④免疫組化法檢測結(jié)腸組織CB2、GRP78、CHOP表達(dá)：組織包埋、切片、抗原修復(fù)，滴加抗體，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片；CB2一抗?jié)舛?∶500，GRP78一抗?jié)舛?∶300，CHOP一抗?jié)舛?∶300，陰性對照采用PBS代替，光鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)不同高倍視野（×400），采用Imagepro plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析，以平均光密度（optical denesity，OD）值代表表達(dá)強(qiáng)度；⑤RT-PCR法檢測GRP78、CHOP mRNA表達(dá)：TRIzol法提取結(jié)腸組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于PCR擴(kuò)增，95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，GRP78、CHOP、β-actin退火溫度分別為58、59、57℃，循環(huán)數(shù)分別為34、34、32個(gè)，擴(kuò)增結(jié)束后行凝膠電泳，電壓100 V，電泳時(shí)間40 min，采用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，分析GRP78、CHOP mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果以GRP78、CHOP mRNA與β-actin的比值表示。各基因引物序列及擴(kuò)增片段見表1。

表1 目的基因引物序列、擴(kuò)增片段

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，方差不齊采用秩和檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用雙變量Bivariate相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 DAI、HS評分及TNF-α、IL-10表達(dá)與正常組比較，模型組DAI、HS、TNF-α水平明顯升高（P＜0.05），IL-10水平下降（P＜0.05）；與模型組比較，CB2激動(dòng)劑組DAI、HS、TNF-α水平明顯下降（P＜0.05），IL-10水平升高（P＜0.05）；CB2拮抗劑組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 免疫組化法檢測CB2、GRP78、CHOP表達(dá)CB2激動(dòng)劑組CB2表達(dá)明顯高于正常組、模型組、CB2拮抗劑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4組小鼠間結(jié)腸組織GRP78、CHOP表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝197.20、98.121，P＜0.05）。正常組結(jié)腸組織上皮細(xì)胞中可見少量GRP78、CHOP表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)表達(dá)為主；與正常組比較，模型組結(jié)腸組織中GRP78、CHOP表達(dá)顯著增多（P＜0.05）；與模型組比較，CB2激動(dòng)劑組GRP78、CHOP表達(dá)減少（P＜0.05）；CB2拮抗劑組與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

表2 各組小鼠DAI、HS評分及TNF-α、IL-10表達(dá)（n＝8，±s）

表2 各組小鼠DAI、HS評分及TNF-α、IL-10表達(dá)（n＝8，±s）

與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：＃P＜0.05

項(xiàng)目正常組模型組CB2激動(dòng)劑組CB2拮抗劑組DAI（分）0.00±0.003.21±0.35*1.21±0.31＃3.33±0.44 HS（分）0.00±0.007.38±3.42*4.50±1.41＃7.63±3.02 TNF-α（μg／L）57.67±6.78123.49±10.46*92.67±10.62＃125.68±8.76 IL-10（μg／L）375.22±16.91 122.46±9.79*235.39±21.05＃121.74±13.92

表3 各組小鼠結(jié)腸組織CB2、GRP78、CHOP 及mRNA表達(dá)（n＝8，±s）

表3 各組小鼠結(jié)腸組織CB2、GRP78、CHOP 及mRNA表達(dá)（n＝8，±s）

與正常組比較：*P＜0.05；與模型組比較：＃P＜0.05；與CB2拮抗劑組比較：△P＜0.05

項(xiàng)目正常組模型組CB2激動(dòng)劑組CB2拮抗劑組CB20.21±0.080.23±0.050.76±0.09*＃△0.15±0.05 GRP780.42±0.061.48±0.10*0.71±0.09＃1.39±0.15 CHOP0.45±0.070.90±0.05*0.66±0.07＃0.92±0.06 GRP78 mRNA 0.13±0.040.72±0.08*0.46±0.07＃0.74±0.11 CHOP mRNA0.16±0.050.84±0.14*0.50±0.08＃0.86±0.12

2.3 GRP78、CHOP mRNA表達(dá)各組小鼠結(jié)腸組織GRP78、CHOP mRNA表達(dá)總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝104.610、85.269，P＜0.05）。正常組GRP78、CHOP mRNA表達(dá)較少，條帶微弱，模型組條帶明亮，mRNA表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，CB2激動(dòng)劑組條帶稍暗，mRNA表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CB2拮抗劑組與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖2、表3。

2.4 相關(guān)性分析CB2激動(dòng)劑組中CB2表達(dá)與IL-10呈正相關(guān)性（r＝0.916，P＜0.05），與DAI、HS、TNF-α表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（r＝－0.778、－0.749、－0.926，P＜0.05），與GRP78及其mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（r＝－0.865、－0.932，P＜0.05），與CHOP及其mRNA呈負(fù)相關(guān)性（r＝－0.744、－0.803，P＜0.05）。

3 討論

CB2在體內(nèi)主要表達(dá)于外周免疫細(xì)胞，參與免疫調(diào)節(jié)，具有抗炎、抗氧化、抗增殖作用。眾多研究［3，6］證實(shí)，CB2減少腸上皮炎癥細(xì)胞浸潤及黏膜炎癥損害，對腸內(nèi)炎癥具有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)小鼠發(fā)生結(jié)腸炎后，小鼠DAI、HS評分增加，CB2激動(dòng)劑組DAI、HS評分較模型組明顯減輕，證實(shí)CB2能夠改善小鼠結(jié)腸炎癥狀。腸道炎癥是IBD發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)，大量促炎癥因子分泌，抗炎因子減少。本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組小鼠腸黏膜中促炎因子TNF-α表達(dá)顯著增加，抗炎因子IL-10表達(dá)減少，表明有腸道炎癥發(fā)生。CB2激動(dòng)劑組給予JWH-133激活CB2表達(dá)后，CB2表達(dá)增加，小鼠DAI、HS評分均減少，抗炎因子IL-10水平上調(diào)，促炎因子TNF-α水平下調(diào)；CB2拮抗劑組使用AM630抑制CB2表達(dá)后，炎癥因子變化不明顯，推測CB2緩解實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎與其抑制炎癥免疫反應(yīng)有關(guān)。

初期的ERS是一種適應(yīng)性代償過程，ERS持續(xù)發(fā)生時(shí)，將啟動(dòng)CHOP途徑等多種細(xì)胞凋亡通路，通過程序性死亡，清除過多的受損細(xì)胞［7］。GRP78、CHOP作為經(jīng)典標(biāo)記物反映ERS水平。研究［8－9］顯示ERS與IBD聯(lián)系緊密。實(shí)驗(yàn)［8］證明活動(dòng)期克羅恩病患者腸上皮中GRP78表達(dá)高于正常人群，提示發(fā)生ERS。研究［9］顯示，潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸黏膜組織存在大量ERS，甚至可以發(fā)生于非炎癥組織，而對照組中卻未發(fā)現(xiàn)，認(rèn)為可以把ERS作為潰瘍性結(jié)腸炎的一般特征。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠腸黏膜中ERS標(biāo)記蛋白GRP78及其mRNA表達(dá)顯著增多，提示小鼠腸內(nèi)已經(jīng)存在劇烈的ERS，與上述研究結(jié)果一致。CHOP蛋白表達(dá)增加，提示腸上皮細(xì)胞中發(fā)生大量ERS相關(guān)凋亡反應(yīng)，過多的細(xì)胞凋亡使腸上皮細(xì)胞數(shù)量急劇減少，促進(jìn)腸內(nèi)炎癥進(jìn)展。

研究［10］顯示，與野生型小鼠比較，IL-10－／－小鼠發(fā)生慢性腸道炎癥后，腸上皮細(xì)胞中GRP78蛋白表達(dá)增多，增加IL-10表達(dá)后，GRP78表達(dá)減少，這可能與IL-10調(diào)節(jié)p38信號通路抑制ATF6轉(zhuǎn)錄，以此減輕ERS有關(guān)。推測腸道炎癥反應(yīng)與ERS存在一定關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)顯示，模型組小鼠ERS標(biāo)記物GRP78表達(dá)上調(diào)與炎癥水平相一致，激活CB2表達(dá)改善腸內(nèi)炎癥后，GRP78表達(dá)下降，CB2抑制ERS可能是緩解結(jié)腸炎癥的機(jī)制之一。CB2激動(dòng)劑組CHOP表達(dá)減少，提示CB2抑制腸上皮細(xì)胞ERS相關(guān)凋亡通路，避免腸上皮細(xì)胞過度減少，有利于腸上皮組織恢復(fù)、愈合。本實(shí)驗(yàn)中，CB2激動(dòng)劑組GRP78、CHOP蛋白與基因下調(diào)水平同步，說明CB2主要通過抑制應(yīng)激蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄緩解ERS。

［1］ Engel M A，Kellermann C A，Burnat G，et al.Mice lacking cannabinoid CB1－，CB2－receptors or both receptors show increased susceptibility to trenitrobenzene sulfonic acid（TNBS）-induced colitis［J］.J Physiol Pharmacol，2010，61（1）：89－97.

［2］ Stevceva L，Pavli P，Husband A J，et al.The inflammatory infiltrate in the acute stage of the dextran sulphate sodium induced colitis：B cell response differs depending on the percentage of DSS used to induce it［J］.BMG Clin Pathol，2001，1（1）：3.

［3］ Singh U P，Singh N P，Singh B，et al.Cannabinoid receptor-2 （CB2）agonist ameliorates colitis in IL-10（－／－）mice by attenuating the activation of T cells and promoting their apoptosis［J］. Toxicol Appl Pharmacol，2012，258（2）：256－67.

［4］ Kihara N，de la Fuente S G，F(xiàn)ujino K，et al.Vanilloid receptor-1 containing primary sensory neurones mediate dextran sulphate sodium induced colitis in rats［J］.Gut，2003，52（5）：713－9.

［5］ Cooper H S，Murthy S N，Shah R S，et al.Clinicopathologic study of dextran sulfate sodium experimental murine colitis［J］.Lab Invest，1993，69（2）：238－49.

［6］ Harvey B S，Nicotra L L，Vu M，et al.Cannabinoid CB2 receptor activation attenuates cytokine-evoked mucosal damage in a human colonic explant model without changing epithelial permeability［J］. Cytokine，2013，63（2）：209－17.

［7］ Sano R，Reed J C.ER stress-induced cell death mechanisms［J］. Biochim Biophys Acta，2013，1833（12）：3460－70.

［8］ Deuring J J，de Haar C，Koelewijn C L，et al.Absence of ABCG2-mediated mucosal detoxification in patients with active inflammatory bowel disease is due to impeded protein folding［J］.Biochem J，2012，441（1）：87－93.

［9］ Treton X，Pedruzzi E，Cazals-Hatem D，et al.Altered endoplasmic reticulum stress affects translation in inactive colon tissue from patients with ulcerative colitis［J］.Gastroenterology，2011，141 （3）：1024－35.

［10］Shkoda A，Ruiz P A，Daniel H，et al.Interleukin-10 blocked endoplasmic reticulum stress in intestinal epithelial cells：impact on chronic inflammation［J］.Gastroenterology，2007，132（1）：190－207.

Research the mechanism of cannabinoid receptor-2 on colitis in mice

Li Kai1，Wu Zhengxiang1，Yang Feng2
（1Dept of Gastroenterology，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001；2Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical Uniersity，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the role of cannabinoid receptor-2（CB2）in acute experimental colitis in mice，and to explore its effect on the endoplasmic reticulum stress（ERS）in the intestinal mucosa.Methods32 SPF mice were randomly divided into normal group，model group，CB2 agonist group and CB2 antagonist group.Disease activity index（DAI）and colon histopathological score（HS）were evaluatd.The levels of TNF-α and IL-10 in colon tissue were detected by ELISA.The expression of CB2 and ERS markers GRP78，CHOP in colon tissues were detected by immunohistochemical.The mRNA levels of GRP78 and CHOP were detected by RT-PCR.ResultsCompared with the normal group，the level of TNF-α was significantly higher and the level of IL-10 was significantly lower（P＜0.05）in the model group，the expressions of GRP78，CHOP and its mRNA were significantly higher（P＜0.05）.Compared with the model group，the expression of CB2 in the CB2 agonist group was significantly higher（P ＜0.05），the level of TNF-α dropped and the level of IL-10 increased（P＜0.05），and the expressions of GRP78，CHOP and its mRNA were significantly reduced（P＜0.05）.The level of IL-10，TNF-α and ERS markers had no significant difference bewteen CB2 antagonist group and the model group（P＞0.05）.ConclusionSevere endoplasmic reticulum stress exists in intestinal mucosa of experimental colitis mice.The CB2 agonist activates CB2 expression，reducing colitis in mice.Its mechanism may be related to inhibiting ERS in intestinal mucosa.

colitis；cannabinoid receptor-2；endoplasmic reticulum stress；GRP78

R 574.62

A

1000－1492（2015）07－0954－04

2015－03－02接收

安徽省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（編號：13zc041）

1安徽省立醫(yī)院消化內(nèi)科，合肥 230001

2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理學(xué)教研室，合肥230022

李 凱，男，碩士研究生；吳正祥，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，通訊作者，E-mail：zxiangwu＠126.com