支 敏，陶 輝，陳澤文，汪裕琪，宣海洋，占紅英，石開虎

HDAC8在異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化中的作用

支 敏1，2，陶 輝1，2，陳澤文2，汪裕琪1，宣海洋1，占紅英1，石開虎1，2

目的初步探討組蛋白去乙?；福℉DAC8）在鹽酸異丙腎上腺素（ISO）誘導(dǎo)的大鼠心肌纖維化中表達(dá)的機(jī)制。方法將40只雄性SD大鼠隨機(jī)均等分為正常組和模型組。模型組給予ISO 1次／d（5 mg／kg），正常組予以等劑量生理鹽水皮下注射，連續(xù)注射7 d后處死大鼠取血液標(biāo)本，并取心肌組織。測定心臟質(zhì)量指數(shù)；ELISA法檢測血清中I型膠原和Ⅲ型膠原的含量；HE和Masson染色法觀察心肌纖維化程度；Western blot法測定HDAC8和α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）蛋白表達(dá)情況；qRT-PCR法檢測HDAC8 mRNA的表達(dá)。結(jié)果與正常組比較，模型組心臟質(zhì)量指數(shù)明顯增加（P＜0.05）；HE和Masson染色顯示模型組心肌組織出現(xiàn)明顯的膠原纖維增生；模型組血清標(biāo)本中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量較正常組明顯增加（P＜0.05）；Western blot法檢測顯示模型組HDAC8、α-SMA的蛋白表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.05，P＜0.01）；qRT-PCR檢測模型組HDAC8 mRNA表達(dá)明顯高于正常組（P＜0.05）。結(jié)論HDAC8在心肌纖維化中高表達(dá)，而在正常心肌組織中低表達(dá)，提示其在心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮作用。

心肌纖維化；HDAC8；α-SMA

心肌纖維化是由各種損傷因素導(dǎo)致異常膠原纖維沉積于心肌細(xì)胞間質(zhì)的病理過程［1］。同時心肌纖維化也是心房顫動（atrial fibrilation，AF）的病理學(xué)基礎(chǔ)，嚴(yán)重影響人類生命健康。AF是臨床上最常見的心律失常之一，AF本身及其所引起的并發(fā)癥（如心衰、血栓栓塞等）常給患者帶來嚴(yán)重后果［2］。但其發(fā)病機(jī)制目前仍不清楚。報道［3］顯示，組蛋白的修飾調(diào)節(jié)參與多種器官（如腎臟、肺臟及心臟組織）纖維化的形成。研究［4］顯示Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）在心血管疾病中廣泛表達(dá)，具有促心肌肥大作用。作為Ⅰ類HDACs中的一員，HDAC8由于缺少保守的C-端結(jié)構(gòu)域且主要在細(xì)胞質(zhì)表達(dá)而被視為Ⅰ類HDACs中一個特殊的亞型［5］。而關(guān)于HDAC8在心肌纖維化中的作用鮮有報道。該研究將通過對心肌纖維化和HDAC8相關(guān)性分析來揭示心肌纖維化發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制，為AF的防治提供新思路和新的研究途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠40只，8周齡，體重（200±20）g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.1.2 藥品與試劑 鹽酸異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）購自上海禾豐制藥有限公司（批號：H31021344）；大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原ELISA試劑盒均購自北京北方生物技術(shù)研究所；一抗HDAC8購自美國Abcam公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），β-actin購自武漢博士德生物工程有限公司；二抗辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TRIzol Reagent購自美國Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒、SYBR-Green qPCR Master Mix購自立陶宛MBI Fermentas公司；HDAC8、α-SMA、β-actin引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型建立 將40只SD大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組各20只。自處理之日起，模型組大鼠背部皮下注射ISO溶液（5 mg／kg），1次／d，連續(xù)7 d，制備心肌纖維化大鼠模型；正常組大鼠背部皮下注射與模型組相同劑量的生理鹽水。

1.2.2 標(biāo)本采集及處理 兩組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后處死。留取血清待測，開胸取心臟組織快速進(jìn)行心臟質(zhì)量指數(shù)的測定后置于10%甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋后，沿切面連續(xù)切片5張，每張厚5 μm，用HE染色和Masson染色觀察，剩余心臟組織裝入凍存管置于－80℃冰箱保存。

1.2.3 心臟質(zhì)量指數(shù)的測定 末次給藥后禁食不禁飲24 h，大鼠稱體重（body weight，BW）后10%水合氯醛（0.3 ml／kg）腹腔注射麻醉后，開胸取出心臟，去除大血管、心外膜脂肪組織，先以20 ml生理鹽水清洗，吸干后稱全心重（heart weight，HW）和左心室重量（left ventricular weight，LVW），計算左心室重量指數(shù)（左心室重量／體重，LVW／BW）和心重指數(shù)（全心重／體重，HW／BW）。

1.2.4 病理學(xué)及膠原容積分?jǐn)?shù)計算 心肌組織切片經(jīng)烤片后在二甲苯中脫蠟5～10 min，換新鮮的二甲苯，再脫蠟5～10 min。經(jīng)梯度乙醇溶液脫水后，流水沖洗。蘇木精染色5 min左右、流水沖去多余的染色液；1%鹽酸酒精迅速分化；流水稍洗；加入藍(lán)液0.5%淡氨水返藍(lán)數(shù)秒；流水沖洗數(shù)分鐘，依次行HE染色和Masson染色。中性樹脂膠封片，光鏡下觀察、攝片。每張Masson染色切片選取3個無血管視野（×400），采用Image Proplus 6.0圖像掃描軟件進(jìn)行圖像分析，計算心肌膠原容積分?jǐn)?shù)（collagen volume fraction，CVF）。CVF（%）：膠原面積／全視野面積×100%。

1.2.5 血清中Ⅰ型及Ⅲ型膠原含量的檢測 大鼠取血后，分離血清；測定血清中I型和III型膠原的含量，具體步驟按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.6 Western blot法檢測HDAC8、α-SMA蛋白表達(dá) 心肌總蛋白提?。喝?.1 g心肌組織塊經(jīng)勻漿后，移入Eppendorf管中，加入RIPA裂解液1 ml，冰上裂解30 min，4℃、12 000 r／min離心40 min，留取上清液即得總蛋白提取液，應(yīng)用BCA法進(jìn)行蛋白定量，變性后置于－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩５鞍纂娪荆翰捎?2%分離膠及5%濃縮膠的SDS-PAGE系統(tǒng)。轉(zhuǎn)膜：200 mA恒流電轉(zhuǎn)印1 h。洗膜后放入含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h搖床，洗膜，孵育一抗，4℃搖床過夜。洗膜，孵育二抗，室溫孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光法顯影。成像結(jié)果采用Image J軟件分析，以β-actin作為內(nèi)參，結(jié)果重復(fù)3次。

1.2.7 qRT-PCR法檢測HDAC8、α-SMA mRNA表達(dá) 采用TRIzol提取心肌細(xì)胞總RNA，用紫外分光光度計測定RNA濃度和純度，以吸光度（absorbance，A）值為計量，根據(jù)RNA的A260 nm／A280 nm均在1.8～2.0，鑒定RNA的純度。以2 μg總RNA為模板，嚴(yán)格按照RT-PCR試劑盒操作說明合成cDNA。取2 μl cDNA在SYBR-Green qPCR Master Mix作用下，用ABI StepOne進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，以β-actin作為內(nèi)參。引物序列見表1。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。組間比較采取兩樣本t檢驗(yàn)。

表1 HDAC8、α-SMA和β-actin的引物序列

2 結(jié)果

2.1 心臟LVW／BW和HW／BW參數(shù)測定ISO所致的心肌纖維化對大鼠心臟質(zhì)量指數(shù)的影響，與正常組比較，模型組左心室重量指數(shù)和心重指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 模型組和正常組之間的心臟質(zhì)量指數(shù)以及血清中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量的比較（n＝20，±s）

表2 模型組和正常組之間的心臟質(zhì)量指數(shù)以及血清中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原含量的比較（n＝20，±s）

項(xiàng)目模型組正常組t值P值LVW／BW（mg／g）3.10±0.402.00±0.601.752＜0.05 HW／BW（mg／g）5.20±0.603.40±0.501.824＜0.05Ⅰ型膠原（μg／L）5.81±0.963.53±0.631.865＜0.05Ⅲ型膠原（μg／L）4.23±0.521.84±0.781.923＜0.05

2.2 ISO所致的大鼠心肌纖維化血清中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量影響模型組血清中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量明顯高于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 HE染色和Masson染色及心肌CVFHE染色及Masson染色顯示，正常組心肌細(xì)胞形狀基本一致，排列整齊，細(xì)胞核間距規(guī)整，無纖維化；模型組心肌組織間質(zhì)成分增多且不規(guī)則，細(xì)胞核間距增寬，見較多纖維組織。模型組大鼠心肌組織CVF明顯高于正常組（t＝2.019，P＜0.05）。見圖1、2。

2.4 Western blot法檢測HDAC8、α-SMA蛋白表達(dá)與正常組比較，模型組大鼠心肌組織HDAC8含量顯著升高，同時，α-SMA含量顯著升高（圖3）。

2.5 qRT-PCR法檢測HDAC8 mRNA的表達(dá)采用相對定量法對心肌細(xì)胞內(nèi)HDAC8基因相對于β-actin內(nèi)參基因的表達(dá)變化。與正常組比較，模型組大鼠心肌組織HDAC8 mRNA含量顯著升高，同時，α-SMA mRNA顯著升高（圖4）。

3 討論

α-SMA在心肌成纖維細(xì)胞活化過程中功用最為顯著［6］，可將α-SMA作為評估心肌纖維化嚴(yán)重程度的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)通過皮下注射ISO制備心肌纖維化動物模型，結(jié)果顯示模型組血清中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的含量明顯高于正常組。HE染色及Masson染色顯示，模型組心肌組織間質(zhì)呈現(xiàn)纖維化改變。說明大鼠心肌纖維化動物模型制備是成功的，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明模型組的表型與文獻(xiàn)［7］相一致。該法簡單、經(jīng)濟(jì)，可靠。

組蛋白乙酰化修飾是表觀遺傳重要修飾方式之一，包括組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferase，HAT）和HDAC兩種酶，其動態(tài)平衡調(diào)控著染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)及基因表達(dá)，HAT使組蛋白乙酰化，促使DNA與組蛋白八聚體分離，激活基因的表達(dá)；而HDAC使組蛋白去乙?；c帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合，基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制［8－9］。HDACs是一類蛋白酶，并作為銜接因子直接影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄因子的活性，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程［10］。目前，哺乳類動物HDAC共發(fā)現(xiàn)18種，根據(jù)不同HDACs的結(jié)構(gòu)同源性分析，可將HDACs分為4類；其中Ⅰ類HDACs與酵母Rpd3基因具有同源性，包括HDAC1、2、3和8；研究［11］顯示Ⅰ類HDACs能夠通過成纖維細(xì)胞和循環(huán)纖維細(xì)胞調(diào)控心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。研究［4］顯示HDAC1和HDAC2在心肌細(xì)胞生長及心肌纖維化的形成中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究［12］表明在轉(zhuǎn)基因大鼠模型中，HDAC3能夠參與調(diào)控心肌細(xì)胞的增殖。不同亞型的HDACs可能發(fā)揮不同的功能，HDAC8在大鼠心肌纖維化中是否也發(fā)揮作用，鮮有報道。

本研究顯示，與正常組比較，模型組大鼠心肌組織HDAC8、α-SMA HDAC8 mRNA、α-SMA mRNA含量顯著升高。從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平說明心肌纖維化的發(fā)生與發(fā)展可能與組蛋白乙酰化有關(guān)。但單一的生物分子可能被多種表觀遺傳修飾所調(diào)控，同時一種修飾方式的發(fā)生也將影響另一種修飾的作用。由于缺乏針對單一亞型特定的HDAC抑制劑，無法特定抑制HDAC8，這也是本實(shí)驗(yàn)的不足之處。初步探討組蛋白去乙?；赡茉谡{(diào)控心肌纖維化的形成過程中發(fā)揮作用，HDAC8究竟在心肌纖維化形成過程中如何起作用，尚不明確，課題組將通過小干擾RNA技術(shù)靶向沉默HDAC8，及其如何影響纖維化相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程進(jìn)一步研究。

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The role of HDAC 8 in isoprenaline-induced myocardial fibrosis of rat

Zhi Min1，2，Tao Hui1，2，Chen Zewen2，et al
（1Dept of Cardiothoracic Surgery，The Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，2Cardiovascular Disease Research Center，Anhui Medical University，Hefei 230601）

ObjectiveTo preliminarily study the expression and the role of histone deacetylase 8（HDAC8）of isoprenaline induced myocardial fibrosis in rats.MethodsThe 40 male SD rats were randomly divided into normal group and the experimental model group.The model group was treated subcutaneously with 5 mg／kg isoprenaline daily for 7 d；the normal group was given the same amount of normal saline at the same time.Rats were executed to obtain blood samples and myocardial tissue after 7 d.And HW／BW，LVW／BW were tested.ELISA was used to detected the content of type I collagen and type III collagen in serum.The degree of myocardial fibrosis was observed with HE and Masson staining method.The expressions of HDAC8 and α-SMA were tested by Western blot. The mRNA expressions of α-SMA and HDAC8 were examined by qRT-PCR.ResultsHW／BW and LVW／BW increased significantly in the model group compared with the normal group（P＜0.05）.The content of type I collagen and type III collagen in serum increased significantly in the model group compared with the normal group（P＜0.05）.HE and Masson staining showed myocardial tissue in the model group appeared obviously collagen fiber hyperplasia.The expressions of HDAC8 and α-SMA in the model group were higher than the normal group（P＜0.05）.qRT-PCR detection of mRNA expression of HDAC8 model group was significantly higher than the normal group（P＜0.05）.ConclusionThe HDAC8 is highly expressed in myocardial fibrosis but lowly expressed in normal myocardium suggesting that it may play a role in the development of myocardial fibrosis.

myocardial fibrosis；HDAC8；α-SMA

R 542

A

1000－1492（2015）07－0950－04

2015－04－14接收

安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號：1308085MH117，1408085MH175）；安徽省高校省級自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號：KJ2011A175，KJ2012Z164）

1安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心胸外科、2安徽醫(yī)科大學(xué)心血管病研究中心，合肥 230601

支 敏，男，碩士研究生；石開虎，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：shikaihu ＠gmail.com